CN103352070B - 一种ros1融合基因的筛查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药和生物技术领域，涉及ROS1融合基因的筛查方法，尤其是ROS1融合基因筛查的多片段引物及其应用。本发明的ROS1融合基因筛查方法，以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1-22所示的real-time PCR联合引物，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有ROS1融合基因突变。本发明方法具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。
Description
技术领域
本发明属于医药和生物技术领域，涉及ROS1融合基因的筛查方法，尤其是ROS1融合基因筛查的多片段引物及其应用。
背景技术
ROS1融合基因为近几年发现的肺癌中的具有重要潜在临床治疗价值的致癌基因突变。目前报道ROS1基因可在32-35外显子之间发生断裂，断裂后的ROS1基因3’残端可以与CD74、SDC4、TPM3、SLC34A2、EZR、LRIG3及GOPC等多种“伙伴基因”发生融合，形成“ROS1融合基因”，并产生相应的融合蛋白。
研究显示，ROS1融合基因见于约1.7%的非小细胞肺癌，并被研究证明是造成这些肿瘤发生发展的“驱动突变”。目前报道的ROS1融合基因仅发现于肺腺癌中，且多见于青年人，不吸烟患者。根据WHO的全球肿瘤统计进行估算，全球每年新发的具有ROS1融合基因的实体肿瘤可能超过万例。有研究显示，具有ROS1融合基因的非小细胞癌细胞系（HCC78）以及转染CD74-ROS1的细胞均对ALK融合基因的特异性抑制剂Crizotinib表现为敏感，一例经Crizotinib治疗的具有ROS1融合基因的肺癌患者经评估，表现为肿瘤缩小，几近完全缓解。如这一研究结果经大规模临床试验证实，则这些具有ROS1融合基因的肿瘤患者可以通过接受Crizotinib的治疗来延长其生命和提高生活质量。因此，对于肿瘤中ROS1融合基因的筛查，有助于进一步明确病情，帮助患者选择相应有针对性的治疗方案，提高疗效，延长生命。
目前关于ROS1融合基因的具体形式多达7种以上，例如CD74-ROS1、SDC4-ROS1等形式。这些复杂的融合形式，使得对ROS1融合基因的筛查具有较高难度。现有技术中对ROS1融合基因的筛查方法主要包括如下两种主要形式：1、普通PCR，通过设计引物，对某一种具体的融合形式进行扩增，根据琼脂糖凝胶电泳判断结果；2、荧光原位杂交（FISH），通过荧光标记的DNA探针特异性地与肿瘤组织DNA中ROS1基因5’端和3’端进行杂交，在荧光显微镜下判读结果。
临床实践显示，目前所述的普通PCR筛查方法，其存在有以下明显缺陷：由于目前报道的ROS1融合基因的具体形式多达7种以上，因此至少需要设计7对PCR引物，分别进行7次PCR反应，费时费力；而且，如果样本是一种新的ROS1融合形式（具有未知的“伙伴基因”），则使用该方法则无法有效地进行检测，而出现假阴性的结果。对于荧光原位杂交（FISH），虽然目前被认为是诊断融合基因的金标准，但是其价格高昂，实验步骤复杂，对操作人员的技术水平要求极高，致使其亦无法进行推广。因此，目前临床实践中需要提出更加简单、方便、灵敏的ROS1融合基因的筛查工具和筛查方法。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术所存在的缺陷与不足，提供一种新的ROS1融合基因的筛查方法，尤其涉及ROS1融合基因筛查的多片段引物及其应用。
本发明提供了筛选ROS1融合基因的real-time PCR联合引物。
本发明的进一步目的是提供上述real-time PCR联合引物在ROS1融合基因筛查方法中的应用，本发明方法能准确、简捷、经济、直观地判断ROS1融合基因存在与否。
本发明的ROS1融合基因筛查方法，以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入real-time PCR联合引物，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有ROS1融合基因。本方法具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。
具体而言，本发明提供的一种ROS1融合基因筛查方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）设计筛查ROS1融合基因的11对real-time PCR联合引物或探针；
（2）提取样本中的总RNA；
（3）以样本中的总RNA为模板，通过逆转录方法合成cDNA；
（4）在11个real-time PCR反应单位中，以（3）中所得的cDNA为模板，分别加入（1）中设计的11对引物或探针，以及包括荧光染料在内的反应预混液；
（5）在real-time PCR反应仪上进行real-time PCR反应，并分别记录每个样本的10个反应单位的荧光阈值（Ct值）；
（6）分别计算引物I～XI所在反应体系的Ct值的均值CtABP，和引物IV~V所在反应体系的CT值的均值CtBBP；
（7）计算ABP与BBP之差的绝对数，如大于1.5，则认为该样本具有ROS1融合基因。
本发明中，筛选ROS1融合基因的real-time PCR联合引物或探针由11对上游引物、下游引物组成，所述11对引物其核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1-22所示，其中第I对SEQ ID NO 1-2，第II对SEQ ID NO3-4，第III对SEQ ID NO5-6，第IV对SEQ ID NO7-8，第V对SEQ ID NO9-10，第VI对SEQ ID NO 11-12，第VII对SEQ ID NO 13-14，第VIII对SEQ ID NO 15-16，第IX对SEQ ID NO17-18，第X对SEQ ID NO 19-20，第XI对SEQ ID NO 21-22。
上述引物和探针可以从特定组织中克隆，也可以用化学合成的方法人工合成。
本发明中，real-time PCR即实时荧光定量聚合酶链反应。聚合酶链反应简称为PCR，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降低，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板，将待扩目的基因不断扩增放大。实时荧光定量PCR，是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。real-time PCR以Ct值为重要的计量单位，反应每个反应单位内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
本发明中，反应单位指一个real-time PCR反应单位，例如384孔板或96孔板的一个孔。反应一起可以使用如ABI公司的7900HT Fast、Roche公司的Lightcycler480等。
本发明中中，包括荧光染料在内的反应预混液，可以使用商品化产品如Invitrogen公司的PowerGreen PCR Master Mix、TaKaRa公司的Premix DimerEraserTM、BIOTIUM公司的Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix；也可以使用含有类似荧光染料的具有想尽功能的自制预混物。
本发明中，未及详述的操作均参考冷泉港实验室的《分子克隆》，10-50bp的寡聚核苷酸序列采用人工合成方法，也可以从上海生工公司购买；生物试剂从美国Invitrogen公司或北京天根公司的生物制剂公司购买。
本发明进行了非小细胞肺癌样本的ROS1融合基因筛检并验证，结果显示，本发明方法的准确性达到100%，通过本方法检测的结果未出现假阳性或假阴性。
本发明的ROS1融合基因筛查方法，该方法以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入real-time PCR联合引物，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有ROS1融合基因。本方法与现有技术比较，具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。而现有技术需经PCR反应、琼脂糖凝胶电泳、紫外灯下观察目标片段情况；或者需要经石蜡切片、脱蜡、杂交、封片再通过荧光显微镜观察等繁杂的人工分析等过程才能得到结果，操作步骤繁多，对人员技术要求高，需要使用较多的仪器设备和实验耗材，成本高，耗时多。而且在操作过程中容易造成实验室污染。
本发明的突出优点在于：
本方法设计了real-time PCR联合引物，以引物对的联合分析进行识别，仅通过一次real-time PCR反应，即可快捷地完成实验全过程，并且实验结果可以快速、直观的判读，能够方便地得到准确明晰的结果。
本发明方法既适合于科研项目中大规模的样本筛查，又适合于对临床对可疑具有ROS1融合基因肿瘤的初步检测，因此具有较高的科研和临床使用价值。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
具体实施方式
实施例1实时荧光定量双标记探针PCR法
1、提取样本中的总RNA，并反转为cDNA。
2、引物及探针设计
引物对I
上游引物：AACATAAGTGGAACCATGCTG（SEQ ID NO 1）
下游引物：GCCATGATAAATGGTGGTTCA（SEQ ID NO 2）
引物对II
上游引物：AAGAAGATGGGCTTTGGAGTA（SEQ ID NO 3）
下游引物：TGAGATATCCGTCCCATTCAG（SEQ ID NO 4）
引物对III
上游引物：CTACTGGGCTGGAAAGACATA（SEQ ID NO 5）
下游引物：TAGAGTGTGGTCCAGTAGAGA（SEQ ID NO 6）
引物对IV
上游引物：GAATGACATGGTGGTGGATTC（SEQ ID NO 7）
下游引物：CCCATCACTGAGGTCTAAAGT（SEQ ID NO 8）
引物对V
上游引物：GTTGGTTCAAGACAGTCAATG（SEQ ID NO 9）
下游引物：TCCTAAAGCCATTGATCCAGA（SEQ ID NO 10）
引物对VI
上游引物：CCACAGACCAGGAGAAGATT（SEQ ID NO 11）
下游引物：GGGCTTTACGCAAATAAGTAAG（SEQ ID NO 12）
引物对VII
上游引物：GCTGAATGAACCCCAATACAT（SEQ ID NO 13）
下游引物：CAAGTAGACACAGCCTTTTGA（SEQ ID NO 14）
引物对VIII
上游引物：CACCTTGGTTGACCTTGTAGA（SEQ ID NO 15）
下游引物：CCAAAGTCTCCAATCTTCACT（SEQ ID NO 16）
引物对IX
上游引物：GATGGCTCCAGAAAGTTTGAT（SEQ ID NO 17）
下游引物：CCTCCTGTTTGCACATAGTTT（SEQ ID NO 18）
引物对X
上游引物：AACTCTTGGTCATCAGCCTTA（SEQ ID NO 19）
下游引物：TCTTTGGTCGGGTTCTTGAG（SEQ ID NO 20）
引物对XI
上游引物：AGAATTCAGGACCAACTTCAG（SEQ ID NO 21）
下游引物：AGCAACTGGCATAATGTCATC（SEQ ID NO 22）
3、反应体系（10ul）
4、反应条件
5、结果的判定
有ROS1融合基因：|CtABP-CtBBP|≥1.5；
无ROS1融合基因：|CtABP-CtBBP|<1.5；
检测失败：反应单位无荧光信号，致使没有Ct值返回，无法计算CtABP或CtBBP。
实施例2体外样本筛查
按常规方法取筛查的体外样本。采用本方法在154例无已相关致癌基因突变（EGFR、KRAS、BRAF、HER2、ALK融合和RET融合）的肺腺癌中筛查含有ROS1融合基因的体外样本（取自复旦大学附属肿瘤医院的体外样本），结果显示，筛检出12例具有ROS1融合基因突变的肺腺癌，其余142例无ROS1融合基因突变。
为进一步验证本发明方法的准确性，对筛查的12例具有ROS1融合基因突变的肺腺癌和42例不具有ROS1融合基因突变的肺腺癌体外样本，进行普通PCR，PCR产物进行直接测序，测序结果经软件读图和人工核对结合分析，结果显示，所述12例样本均具有ROS1融合基因突变；继续利用金标准FISH实验进行检验，使用ROS1分裂探针进行杂交后在荧光显微镜下观察，结果显示，所述的12例样本全部均具有ROS1融合基因突变，与本发明的real-time PCR联合引物法的结果完全一致，结果证实，本发明方法的准确性达到100%，通过本方法检测的结果未出现假阳性或假阴性。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属肿瘤医院
<120> 一种ROS1融合基因的筛查方法
<160> 22
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
AACATAAGTGGAACCATGCTG 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
GCCATGATAAATGGTGGTTCA 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
AAGAAGATGGGCTTTGGAGTA 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
TGAGATATCCGTCCCATTCAG 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
CTACTGGGCTGGAAAGACATA 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
TAGAGTGTGGTCCAGTAGAGA 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
GAATGACATGGTGGTGGATTC 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
CCCATCACTGAGGTCTAAAGT 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
GTTGGTTCAAGACAGTCAATG 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
TCCTAAAGCCATTGATCCAGA 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
CCACAGACCAGGAGAAGATT 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
GGGCTTTACGCAAATAAGTAAG 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
GCTGAATGAACCCCAATACAT 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
CAAGTAGACACAGCCTTTTGA 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
CACCTTGGTTGACCTTGTAGA 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
CCAAAGTCTCCAATCTTCACT 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
GATGGCTCCAGAAAGTTTGAT 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
CCTCCTGTTTGCACATAGTTT 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
AACTCTTGGTCATCAGCCTTA 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
TCTTTGGTCGGGTTCTTGAG 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
AGAATTCAGGACCAACTTCAG 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
AGCAACTGGCATAATGTCATC 21
Claims (2)
1.SEQ ID NO 1-22的real-time PCR联合引物对在制备筛查ROS1融合基因突变的制剂中的用途；所述的联合引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO 1-22所示；
其中第I引物对的序列如SEQ ID NO 1-2所示，第II引物对的序列如SEQ ID NO3-4所示，第III引物对的序列如SEQ ID NO5-6所示，第IV引物对的序列如SEQ ID NO7-8所示，第V引物对的序列如SEQ ID NO9-10所示，第VI引物对的序列如SEQ ID NO 11-12所示，第VII引物对的序列如SEQ ID NO 13-14所示，第VIII引物对的序列如SEQ IDNO 15-16所示，第IX引物对的序列如SEQ ID NO 17-18所示，第X引物对的序列如SEQID NO 19-20所示，第XI引物对的序列如SEQ ID NO 21-22所示；
所述的制剂按如下方法用以筛查ROS1融合基因：
(1)设计筛查ROS1融合基因的11对real-time PCR联合引物对；
(2)提取样本中的总RNA；
(3)以样本中的总RNA为模板，通过逆转录方法合成cDNA；
(4)在11个real-time PCR反应单位中，以(3)中所得的cDNA为模板，分别加入(1)中设计的11对引物，以及包括荧光染料在内的反应预混液；
(5)在real-time PCR反应仪上进行real-time PCR反应，并分别记录每个样本的10个反应单位的荧光阈值；
(6)分别计算引物I～IV所在反应体系的荧光阈值的均值CtABP，和引物VI～XI所在反应体系的荧光阈值的均值CtBBP；
(7)计算ABP与BBP之差的绝对数，判定样本是否具有ROS1融合基因突变，其中，结果的判定标准为：
有ROS1融合基因：|CtABP-CtBBP|≥1.5；
无ROS1融合基因：|CtABP-CtBBP|<1.5。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ROS1融合基因是非小细胞肺癌样本的ROS1融合基因。
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