CN114592038B - 一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用,所述荧光生物传感系统包括哑铃型DNA探针(DSP)、CRISPR/Cas 12a蛋白、crRNA与荧光报告探针;所述哑铃DNA探针内含四个Dam甲基转移酶识别位点,在Dam酶存在时被甲基化并切割形成含3’端羟基的DNA链,3’端羟基被TdT末端转移酶识别并经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链;CRISPR/Cas 12a蛋白与富含A碱基的crRNA特异性识别DNA长单链并与其互补,引发Cas12a顺式切割活性并激发反式切割活性,剪切荧光报告探针从而产生荧光信号。本发明能实现Dam甲基转移酶的超灵敏、高特异性检测,且检测限低、检测速度快,能在3h内完成检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及无模板扩增策略及荧光生物传感器技术领域,特别是涉及一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用。
背景技术
DNA甲基化是表观遗传学的一种,在调节基因表达,细胞分化和维持基因组稳定性方面发挥重要作用,能在不改变DNA序列的前提下,将甲基从甲基供体——甲硫腺苷氨酸转移到相应的胞嘧啶或者腺嘌呤上,而甲基化转移酶在此过程中发挥重要作用。近年来,多项研究指出,通过沉默相关转录基因,异常的甲基化转移酶活性能够导致相关疾病的产生,如肿瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病等。而甲基化转移酶水平升高对于疾病的发生发展乃至是预后方面有一定的指示作用,因此将其作为相关疾病的分子标记物具有不可忽略的诊断与药用价值。
传统的甲基化转移酶检测方法如放射性元素标记法、高效液相色谱法、甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)法等被开发出来,但复杂的操作、昂贵仪器设备和不够理想的灵敏度限制了它们的应用,因此等温扩增法因其操作简单、结果快速、灵敏度和成本低、能在体内进行等优点,使其在一众传统方法中脱颖而出。研究者们常常将DNA作为载体运用在等温扩增方法中,如滚环扩增RCA、SDA 链置换反应、等温指数扩增EXPAR和杂交链式反应HCR等。而上述方法虽然提高了检测性能,但仍存在耗时较长,背景较高,检测限不够理想等问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用,用于解决现有技术中Dam甲基化转移酶的检测方法灵敏度和时效性不够理想等问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明第一方面提供一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统,包括哑铃型DNA探针(DSP)、CRISPR/Cas 12a 蛋白、crRNA与荧光报告探针;所述哑铃DNA探针内含四个Dam甲基转移酶识别位点,所述Dam甲基转移酶识别位点的序列为5’GATC3’,两两形成回文序列;存在Dam甲基转移酶时,所述哑铃DNA探针被甲基化并切割形成含3’端羟基的DNA链,所述DNA链的3’端羟基被TdT末端转移酶识别并经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链;所述CRISPR/Cas 12a蛋白与富含A 碱基的crRNA特异性识别所述DNA长单链并与其互补,引发Cas12a顺式切割活性并激发反式切割活性,将两端分别标记有荧光基团与荧光淬灭基团的荧光报告探针剪切从而产生荧光信号;不同浓度的Dam甲基转移酶催化反应可产生不同强度的荧光信号。
进一步,所述哑铃型DNA探针的序列如SEQIDNO.1所示。
进一步,所述crRNA的序列如SEQIDNO.2所示。
进一步,所述荧光报告探针的序列如SEQIDNO.3所示。
进一步,所述荧光基团选自HEX、FAM、Cy3、Cy5中的至少一种,所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种;优选地,所述荧光基团为HEX,所述荧光淬灭基团为BHQ1。
进一步,所述哑铃DNA探针被甲基化并切割形成两条发夹结构和一条DNA 双链,即四条含3’端羟基的DNA链。
进一步,切割哑铃DNA探针使用的剪切酶为Dpn I甲基化限制性内切酶。
进一步,切割哑铃DNA探针时还需要加入S腺苷甲硫氨酸。
进一步,所述无模板延伸反应需加入原料脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTTPs)和 TdT末端转移酶的激活剂,所述激活剂为钴离子;优选地,所述激活剂为二氯化钴。
本发明第二方面提供一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统的构建方法,包括如下步骤:
(1)制备哑铃型DNA探针(DSP):采用如SEQ ID NO.1所示序列的哑铃单链,所述哑铃单链5’端修饰有磷酸基团P、3’端连接有OH,在DNA连接酶的作用下,5’端磷酸基团P与3’端OH连接形成封闭的哑铃环,连接端口处为5’-GAAG-3’,得到含哑铃型DNA探针的体系;(2)甲基化与酶切反应:在含哑铃型DNA探针的体系中加入Dam甲基化转移酶、Dpn I甲基化限制性内切酶与 S腺苷甲硫氨酸,进行甲基化与酶切反应,哑铃DNA探针被甲基化并切割形成两条发夹结构和一条DNA双链,即四条含3’端羟基的DNA链;
(3)无模板扩增反应:取甲基化与酶切反应的产物,加入TdT末端转移酶、脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTTPs)和TdT末端转移酶激活剂,经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链;
(4)在无模板扩增反应产物中加入CRISPR/Cas12a蛋白、如SEQ ID NO.2 所示序列的crRNA与如SEQIDNO.3所示序列的荧光报告探针,构建得到所述检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统。
进一步,所述步骤(1)中,哑铃型DNA探针(DSP)的制备方法包括如下步骤:取哑铃DNA单链干粉,用TE缓冲液溶解,再加入DNA连接酶反应缓冲液,进行反应,再加入DNA连接酶,反应形成哑铃环。
可选地,所述步骤(1)中,所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶,所述DNA 连接酶反应缓冲液为10×T4 DNA连接酶反应缓冲液。可选地,所述步骤(1) 中,加入DNA连接酶反应缓冲液后,先于95℃加热5分钟,再缓慢降至室温,加入DNA连接酶。
可选地,所述步骤(1)中,加入DNA连接酶后,先于16℃反应3小时,再于70℃反应10分钟,使哑铃成环。
可选地,所述步骤(1)中,当哑铃环形成后,加入核酸外切酶以去除未成环的单双链,并灭活核酸外切酶,得到只含哑铃型DNA探针的体系。
可选地,所述步骤(1)中,所述核酸外切酶选用核酸外切酶I和核酸外切酶III。
可选地,所述步骤(1)中,当哑铃环形成后,加入核酸外切酶于37℃反应 1小时,再于90℃反应20分钟使核酸外切酶完全灭活,以保证体系中只存在哑铃环,避免存在未成环的单双链。
进一步,所述步骤(2)中,甲基化与酶切反应在1×Dam甲基转移酶缓冲液和1×rCutsmart缓冲液中进行。
进一步,所述步骤(2)中,甲基化与酶切反应时间为30-75分钟,优选为 45-60分钟,更优选为45分钟。
进一步,所述步骤(2)中,甲基化与酶切反应温度为37℃。
进一步,所述步骤(2)中,所述Dpn I甲基化限制性内切酶的浓度为4-12U,优选为4-8U,更优选为8U。
进一步,所述步骤(2)中,甲基化与酶切反应结束后,于90℃反应10分钟使酶灭活。
进一步,所述步骤(3)中,所述TdT末端转移酶的浓度为4-20U,优选为 8-14U,更优选为14U。
进一步,所述步骤(3)中,无模板扩增反应时间为1h。
进一步,所述步骤(3)中,无模板扩增反应温度为37℃。
进一步,所述步骤(3)中,无模板扩增反应结束后,80℃反应10min以灭活TdT末端转移酶。
进一步,所述步骤(4)中,所述荧光报告探针末端修饰有荧光基团和荧光淬灭基团,所述荧光基团选自HEX、FAM、Cy3、Cy5中的至少一种,所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种;优选地,所述荧光基团为 HEX,所述荧光淬灭基团为BHQ1。
进一步,所述荧光生物传感系统的检测范围为0.01U/mL12U/mL,最低检测限为0.0015U/mL。
本发明第三方面提供一种如第一方面所述的荧光生物传感系统和/或如第二方面所述方法制备得到的荧光生物传感系统在检测Dam甲基转移酶上的应用。
本发明第四方面提供一种检测Dam甲基转移酶的方法,采用第一方面所述的荧光生物传感系统和/或如第二方面所述方法制备得到的荧光生物传感系统,所述方法包括如下步骤:将所述荧光生物传感系统进行CRISPR/Cas12a酶切反应后检测荧光信号。
进一步,CRISPR/Cas12a的酶切反应时间≥30分钟,优选为30-60分钟,更优选为40分钟。
进一步,所述CRISPR/Cas12a的酶切反应温度为25℃。
进一步,CRISPR/Cas12a酶切反应在避光条件下进行。
进一步,CRISPR/Cas12a酶切反应结束后,95℃灭活5min,再检测反应产物荧光信号。
进一步,通过荧光分光光度计检测荧光信号,波长范围为540-640nm,激发波长为525nm,激发狭缝和发射狭缝分别为5nm和10nm。
进一步,当Dam甲基转移酶浓度在0.01-6U/mL范围内时,荧光强度(y)与 Dam甲基转移酶浓度(x)的关系方程为y=91.187x+35.088,相关系数为0.9969。
本发明第五方面提供一种检测试剂盒,用于检测Dam甲基转移酶,所述试剂盒包括第一方面所述的荧光生物传感系统和/或如第二方面所述方法制备得到的荧光生物传感系统。
本发明第六方面提供一种如第一方面所述的荧光生物传感系统和/或如第二方面所述方法制备得到的荧光生物传感系统在筛选MTase抑制剂上的应用。
进一步,所述MTase抑制剂为5氟尿嘧啶。
如上所述,本发明的一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用,具有以下有益效果:
本发明设计了一种末端脱氧核酸转移酶结合CRISPR/Cas 12a的荧光生物传感系统,用于超灵敏检测Dam甲基转移酶,将哑铃型DNA探针(DSP)和TdT 末端转移酶无模板扩增反应结合,封闭的哑铃环形结构将非特异性的TdT末端转移酶作用位点大大减少,是本发明低背景信号的关键,TdT酶的扩增作用增加了灵敏度。为了进一步提高检测的灵敏度同时有效的缩短检测的反应时间,本发明引入了CRISPR Cas12a切割延伸产物以产生荧光信号。本发明的哑铃链上设计有四个甲基化酶识别位点,当存在Dam甲基转移酶时,它们被修饰甲基,随后被Dpn I甲基化限制性内切酶特异性识别并切割,产生四条含3’端羟基的DNA 链,3’端羟基暴露从而能在TdT酶作用下延伸出长链,与CRISPR/Cas12a中的 crRNA特异性结合激发Cas12a蛋白的顺式切割活性,继而引发反式切割活性将荧光报告探针切割产生大量荧光,检测限达到0.0015U/mL(S/N=3),且能在3h 内完成检测。此外,本发明的荧光生物传感系统还可以很好地筛选MTase抑制剂,并量化MTase在复杂生物样本(人类血清)中的活性,因此在生物医学研究和临床诊断方面具有很大的潜力。
附图说明
图1显示为本发明实施例中末端脱氧核酸转移酶结合CRISPR/Cas 12a系统超灵敏检测Dam甲基转移酶原理图。
图2显示为本发明实施例中验证生物传感器构建的可行性结果图。
图3显示为本发明实施例中实验中重要参数的优化结果图。
图4显示为本发明实施例中DSP结合TdT酶无模板延伸DNA链被 CRISPR/Cas12a切割用以检测Dam甲基转移酶的浓度分析结果图。
图5显示为本发明实施例中的特异性分析结果图。
图6显示为本发明实施例中5-氟尿嘧啶抑制剂浓度变化对6U/mL Dam MTase活性的抑制情况结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用
1实验部分
1.1试剂
Dam甲基转移酶、10×Dam甲基转移酶缓冲液、S腺苷甲硫氨酸(SAM),Dpn I甲基化限制性内切酶、10×rCutSmart缓冲液,T4 DNA连接酶、10×T4 DNA 连接酶反应缓冲液、核酸外切酶I(Exo I)、核酸外切酶III(Exo III)、M.SssI 甲基转移酶、末端脱氧核酸转移酶(TdT末端转移酶)、10×TdT缓冲液、10×二氯化钴溶液和1×NEBuffer2、LbaCas12a(Cpf1)核酸酶和NEB r2.1缓冲液(10×)均购买自NEB(北京)有限公司。5-氟尿嘧啶买自索莱宝生物公司。 TE缓冲液,三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)粉末,过硫酸铵(APS),丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺30%溶液(29:1),以及所有寡核苷酸序列均来自于生工生物公司,20bp DNA Ladder和6×loading缓冲液均购买自Takara生物公司。实验用超纯水 (18.2MΩ·cm)取自于密理博净水系统(Millipore公司)。
本实验中应用的相关核苷酸序列如表1所示。
表1.核苷酸序列表
1.2仪器与设备
本实施例所有荧光分析实验均使用光程1.0cm(容积100μL)的石英比色皿在CaryEclipse荧光分光光度计(安捷伦,美国)进行,所有核酸序列均使用Nano Drop 1000超微量分光光度计(赛默飞,美国)检测浓度。哑铃探针形成于HH-ZK420智能恒温水箱(予华仪器公司),所有等温实验在T100热循环仪(Bio-Rad公司)上完成。凝胶电泳实验在DYY-6C电泳仪(北京六一生物科技有限公司,中国),凝胶成像完成于ChemDoc XRS凝胶成像系统(伯乐,美国)。Heraeus Fresco 17低温高速离心机(赛默飞,美国)处理核酸序列干粉;纯水仪(Millipore,美国)。
1.3荧光生物传感系统构建
哑铃产物制备:哑铃单链5’端修饰有磷酸基团P,结构形成时可与3’端OH 连接形成环。首先用TE缓冲液溶解干粉成100μM在20℃保存,实验时取2μL 哑铃和4μL 10×T4 DNA连接酶反应缓冲液配制40μL反应液,于95℃反应5 分钟后缓慢降至室温,然后加入120U的T4 DNA连接酶,于16℃反应3小时, 70℃反应10分钟使哑铃成环;为避免不成环单双链的影响,加入1μL核酸外切酶I和1uL核酸外切酶III 37℃反应1小时,90℃反应20分钟使核酸外切酶完全灭活,此时体系中只存在哑铃环(哑铃型DNA探针,DSP)。
DNA甲基化与酶切反应:取2μL已成环哑铃产物(5μM)配制30μL总体系,S腺苷甲硫氨酸浓度为160μM,加入8UDpn I甲基化限制性内切酶和不同浓度的Dam甲基转移酶,使反应在1×Dam甲基转移酶缓冲液和1×rCutsmart缓冲液中进行。37℃反应45min后,90℃反应10分钟使酶灭活。
无模板扩增反应:取上述产物10μL,加入2μL的10×TdT缓冲液、2μL的 CoCl2、1μL的dTTPs(100mM)和14U的TdT酶,补水至20μL,于37℃反应 1h,扩增产物形成富含dTTP的DNA长单链,80℃反应10min以灭活TdT酶。
CRISPR/Cas12a酶切反应:在上述溶液中加入终浓度为1×NEB缓冲液r2.1, 20nM的crRNA,10nM的CRISPR Cas12a和20nM荧光报告探针,25℃反应40min, 95℃灭活5min。反应后的产物通过荧光分光光度计检测,波长范围为540- 640nm,激发波长为525nm,激发狭缝和发射狭缝分别为5nm和10nm。
2结果及讨论
2.1荧光生物传感系统的构建原理
图1显示为本发明中末端脱氧核酸转移酶结合CRISPR/Cas 12a系统超灵敏检测Dam甲基转移酶的原理图。
如图1所示,本实施例构建的对称双环哑铃辅助无模板扩增反应结合 CRISPR/Cas12a酶切作用检测甲基化转移酶的体系由三部分组成。首先对称哑铃环的制备,此DNA链内含两部分,一部分是能够互补配对的部分,存在四个 Dam甲基转移酶识别位点,其序列为GATC,两两形成回文序列;另一部分则是非对称的环结构。哑铃型DNA变性退火使设计链内互补序列配对,而链的5’端和3’端的碱基则因此靠近,分别修饰磷酸基团和羟基,能在T4DNA连接酶作用下首尾相连,且为对称结构。加入核酸外切酶III与核酸外切酶I可将未成环的DNA链水解掉,减少背景干扰。加入DNA甲基转移酶和Dpn I甲基化限制性内切酶,在SAM的催化作用下,甲基结合到双链的4个5’GATC3’位点上,同时Dpn I甲基化限制性内切酶对其识别剪切,可形成两条发夹结构和一条DNA 双链。
接下来是无模板扩增反应,上述的四条DNA链的四个3’端羟基位点被TdT 末端转移酶识别,以dTTPs作为原料,延伸出DNA长单链。
最后,上述产物中延伸的DNA长单链富含T碱基,被CRISPR/Cas 12a中富含A碱基的crRNA特异性识别并互补,引发蛋白CRISPR Cas12a顺式切割活性,继而激发反式切割活性,将两端标记荧光基团与淬灭基团的荧光报告探针非特异性剪切,DNA短链被切割后,淬灭基团与荧光基团远离,从而产生荧光信号。
2.2荧光生物传感系统可行性分析
末端脱氧核酸转移酶结合CRISPR/Cas 12a系统超灵敏检测Dam甲基转移酶,通过电泳图和不同的荧光光谱变化进行验证。
图2显示了验证荧光生物传感系统构建的可行性的结果图。图2A为12%非变形电泳凝胶显影图,图2B为不同体系的荧光光谱图。(A)泳道M为20bp DNA Marker,泳道1为成环的哑铃链DSP,此时已加入核酸外切酶将未成环DNA水解。泳道2为哑铃链DSP加入Dam甲基转移酶与内切酶Dpn I后被水解形成更小的DNA片段。泳道3为DSP加入内切酶Dpn I,并无明显变化,说明没有Dam 酶时,即使存在内切酶Dpn I,也并不能识别未甲基化的GATC序列将DSP切割。泳道4和5分别是泳道3和泳道2产物中加入TdT酶与dTTPs延伸后的结果,4 泳道无明显变化,无扩增条带产生;而5泳道在靠近电泳起始处出现一个条带,分子量大于500bp,说明成功地合成了DSP,且DSP保持了完整的哑铃环形结构,证明使用外切酶I和外切酶III能够消除DSP以外的DNA,保证体系不存在非特异的DNA结构被末端转移酶识别。
图2B中,绿色曲线:缺少TdT酶的荧光强度;粉色曲线:缺少CRISPR Cas12a 的荧光强度;蓝色曲线:缺少Dpn I的荧光强度;黑色曲线:缺少Dam甲基转移酶的荧光强度;红色曲线:所有成分均存在且所测Dam浓度为10U/mL时的荧光强度。当分别缺少Dam甲基转移酶、内切酶Dpn I、Cas 12a和TdT酶时,其荧光信号强度很微弱,可以忽略不计,但加入10U/mLDam甲基转移酶时,信号接近900a.u.,荧光强度增幅非常明显,表明缺少任何一个成分都不能成功引发荧光信号的放大作用。因此选择将DSP和TdT酶相结合用来检测Dam甲基转移酶的方法不仅保证了低背景信号,并且发挥了优异的信号放大作用。上述实验结果验证了对称双环哑铃辅助无模板扩增反应结合CRISPR/Cas12a酶切作用检测甲基化转移酶的体系具有良好的可行性。
2.3实验条件优化
对实验中的关键条件进行优化。图3显示了实验中重要条件的优化结果。(A) 甲基转移酶与Dpn I共同作用时间的优化。(B)Dpn I浓度优化。(C)TdT浓度优化。
甲基转移酶与Dpn I共同作用的时间直接影响了剪切产物的量,而这决定了后续TdT酶的作用位点的多少本实施例。实验时选择了4个时间,分别是30分钟、45分钟、60分钟和75分钟,并将信噪比F/F0作为评估标准,F和F0代表加入和未加入Dam酶时的荧光强度,并将6U/mL的Dam酶选做检测对象。如图3A所示,随着时间增加,阳性信号不断增强,而背景信号F0也随之增加,在45分钟时信噪比达到最大,并在60分钟时有所减低,45分钟成为甲基转移酶与Dpn I共同作用的最佳反应时间,无需再增加反应时间。
Dpn I甲基化限制性内切酶对哑铃探针DSP的剪切效率起重要作用,因此本实施例实验时选择了五个Dpn I浓度(4U、6U、8U、10U、12U)进行优化,如图3B所示,随着Dpn I浓度增加,荧光信号有所增加并在8U时达到最大,且大于8U时信号反而下降,因此将8U选为DpnI的最佳浓度。
TdT酶的浓度直接决定了延伸的DNA长单链的长度与多少。本实施例实验时用信噪比F/F0来评估不同量的TdT酶所测得的实验结果。如图3C可以看到, F和F0都随TdT量增加而增加(F0增加可能与体系中仍存在微量DNA小碎片有关),并在TdT为14U时达到最大信噪比,但当TdT增加到20U时F却明显降低,这说明了20U对TdT来说已经达到饱和甚至对酶活性造成抑制,因此将 14U选为TdT的最优量。
以上实验参数为进行酶靶标检测时实验中的重要条件。在选定的优化条件下,实现检测靶标仅耗时2小时45分钟,充分体现了本方案高效快速检测的优势。
2.4灵敏度分析
在对关键条件进行优化以后,本实施例对Dam甲基转移酶进行了线性实验。图4显示了Dam甲基转移酶在不同浓度下的荧光强度。(A)酶检测线性分析结果:0.01、0.1、0.5、1、2、4、6U/mL。误差棒为三次平行实验的标准偏差。(B) 不同浓度检测的荧光光谱:0、0.01、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10、12U/mL。
图4A将荧光强度值F与目标浓度做出相应关系图,而其中荧光强度在 0.01~12U/mL的浓度呈现正向趋势变化,其中在0.016U/mL范围实现相关系数 0.9969及一次函数方程y=91.187x+35.088,同时根据3σ规则:3倍空白值标准偏差加上空白信号值得出最低检测限为0.0015U/mL。
如图4B所示的不同浓度对应的各荧光光谱显示,稀释Dam甲基转移酶,当其浓度分别为0U/mL,0.01U/mL,0.1U/mL,0.5U/mL,1U/mL,2U/mL,4U/mL, 6U/mL,8U/mL,10U/mL,12U/mL时进行检测,结果显示,随着酶浓度的增加,荧光强度也逐渐增加。
实验方案建立以实现高灵敏度和快速检测为首要目标,在本发明的技术方案中,所设计的哑铃型DNA探针(DSP)结构简单,热变性后靠分子内的碱基互补配对形成哑铃型结构,不易降解,且不额外添加引物,降低了背景信号;此外,通过精心设计,此探针内含4个甲基化转移酶识别位点GATC,提高了甲基化作用效率,一个哑铃探针能够被剪切成四条含3’端羟基的DNA链,进而被TdT末端转移酶识别并扩增为长达数百bp的DNA长单链,此为第一重扩增;DNA长单链与crRNA互补后,激活CRISPR/Cas12a的切割活性,切割短报告荧光报告探针DNA产生荧光信号,而CRISPR/Cas12a能够识别aM级别的DNA链,微量的DNA单链即能引发其切割作用,此为第二重扩增。方案中高信噪比检测对于酶的检测具有高效性,以至于达到相关系数0.9969的线性检测和0.0015的检测限。而三步反应的总时长不超过三小时(两小时四十五分钟),增加其实现床旁检测的可能性。
同时,将本发明的技术方案检测灵敏度与实效性与已有研究相关方法(论文 [1]-[6])进行对比,结果如表2所示,再次证明了本发明方法建立的优势。
表2.与靶Dam甲基转移酶的高灵敏和高实效性荧光检测方案方法学比较
注:
[1]Chen Liping,Zhang Ying,Xia Qian et al.Fluorescence biosensor forDNA methyltransferase activity and related inhibitor detection based onmethylation-sensitive cleavage primer triggered hyperbranched rolling circleamplification.[J].Anal Chim Acta,2020,1122:1-8.
[2]Du Yi-Chen,Wang Si-Yuan,Li Xiao-Yu et al.Terminal deoxynucleotidyltransferase-activated nicking enzyme amplification reaction for specific andsensitive detection of DNA methyltransferase and polynucleotide kinase.[J].Biosens Bioelectron,2019,145:111700.
[3]Wang Tong,Que Hai-Ying,Cheng Wen-Bin et al.Homogeneous fluorescentbiosensing method for DNA methyltransferase activity analysis and inhibitorscreening based on highly efficient isothermal amplification..[J].SensorActuat B-Chem,2019,296:126658.
[4]Xu Xiao-Wen,Wang Lei,Cui Wan-Ling et al.An integrated andrestructive probe mediated strand displacement amplification strategy forsensitive and specific DNA methyltransferase activity detection..[J].SensorActuat B-Chem,2018:124-130.
[5]Xu Xiaowen,Wang Lei,Li Xia et al.Multiple sealed primers-mediatedrolling circle amplification strategy for sensitive and specific detection ofDNA methyltransferase activity.[J].Talanta,2019,194:282-288.
[6]Hou Ting,Xu Ningning,Wang Wenxiao et al.Label-free andimmobilization-free photoelectrochemical biosensing strategy using methyleneblue in homogeneous solution as signal probe for facile DNA methyltransferaseactivity assay.[J].Biosens Bioelectron,2019,141:111395.
2.5特异性分析
为了评估分析方法的特异性,实验添加M.SssI甲基转移酶作为对照检测,本次实验中甲基转移酶识别位点为5’GATC3’,而M.SssI酶识别位点为 5’CG3’,加入甲基转移酶进行催化同时加入Dpn I甲基化限制性内切酶进行酶切反应,图6显示了特异性分析结果:比较单独加入的M.SssI酶、单独加入的Dam酶和两者混合后的荧光强度。
如图5所示:从左往右依次为加入6U/mL Dam甲基转移酶、加入6U/mL M.SssI甲基转移酶与相同浓度的Dam甲基转移酶、加入6U/mL M.SssI甲基转移酶进行反应,可以看到只有当Dam甲基转移酶存在时有荧光强度变化,且 M.SssI的存在并不干扰Dam的活性。
2.6血清学实验
为验证本发明的荧光生物传感系统在实际应用中的可行性,在健康人血清样品中分别添加0.05、0.5和6U/mL的Dam甲基转移酶,进行3组平行检测,结果如表3所示,并计算了酶检测的回收率分别为103.6%、94.54%、93.56%,而相对标准偏差RSD稳定在1.88%、4.72%、6.01%。上述结果表明,本发明构建的荧光生物传感系统检测血清结果具有良好的重现性和稳定性,具有极大的临床参考价值。
表3.Dam甲基转移酶在血清中的检测效果
2.7Dam甲基转移酶活性抑制实验
Dam甲基转移酶与致病菌的毒力有关,因此Dam抑制剂的筛选可为抗菌治疗应用提供有效的手段。本实施例选择5-氟尿嘧啶作为模型抑制剂,研究本发明方法筛选甲基转移酶靶向抗菌药物的可行性。
当Dam甲基转移酶活性被抗癌药物5-氟尿嘧啶抑制时,甲基化反应被阻断。而DpnI酶对DSP的裂解量不足,导致无模板扩增反应的效率降低,荧光信号降低。本实施例选用相对活性(%)作为5-氟尿嘧啶对Dam甲基转移酶的抑制作用的评估标准,RA的计算公式为:RA=(Fi-F0)/(F-F0),其中F与F0分别表示 Dam浓度为6U/mL和不加入Dam时所测得的荧光强度,而Fi表示在6U/mL Dam 中加入抑制剂所测得的荧光强度,F与反应空白值F0为3组平行实验取其平均值而进行后续计算。图6显示了5-氟尿嘧啶抑制剂浓度变化对6U/mL Dam甲基转移酶活性的抑制情况。从图6可以看出,当浓度逐渐升高达到6μM时,荧光信号接近空白不再变化,因此该浓度为酶抑制最佳浓度。
同时,通过计算得到抑制剂对酶的作用IC50值(5-氟尿嘧啶浓度导致50%的 DamMTase活性抑制)为0.728μM,以上结果表明本发明所提出的方案可用于筛选MTase抑制剂的抑制能力,再次证明本方案对重要的临床治疗诊断等重要的临床参考意义。
3结论
本发明的研究方案以哑铃型DNA探针(DSP)作为体系中甲基化转移酶唯一载体,其DNA特质和封闭状态减少了背景干扰信号,同时存在4个酶作用位点,被内切酶切割以后使得荧光信号4倍放大。同时,末端转移酶扩增反应能够不借助引物互补配对即能发生扩增反应,减小了设计难度也降低了干扰,与 CRISPR/Cas12a灵敏的切割活性结合使得信号双重放大。本方案具有实验操作简单、检测耗时短、特异性强的优点,且具有高灵敏度,达到了0.0015U/mL的检测限,同时利用5-氟尿嘧啶对Dam甲基转移酶的抑制作用,对于研发抗病菌药物及抗癌药物给予重要的参考意义,而血清标本检测体现良好重现性等多方面体现本发明检测体系的优势,有利于临床癌症的早期检测诊断及药物研究等的临床应用发展。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
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Claims (9)
1.一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统,其特征在于,包括哑铃型DNA探针、CRISPR/Cas 12a蛋白、crRNA与荧光报告探针;
所述哑铃型DNA探针的制备方法为:采用如SEQ ID NO.1所示序列的哑铃单链,所述哑铃单链5’端修饰有磷酸基团P、3’端连接有OH,在DNA连接酶的作用下,5’端磷酸基团P与3’端OH连接形成封闭的哑铃环,连接端口处为5’-GAAG-3’,得到哑铃型DNA探针;
所述哑铃型DNA探针内含四个Dam甲基转移酶识别位点,所述Dam甲基转移酶识别位点的序列为5’-GATC-3’,两两形成回文序列;存在Dam甲基转移酶时,所述哑铃型DNA探针被甲基化并切割形成两条发夹结构和一条DNA双链,即四条含3’端羟基的DNA链,所述DNA链的3’端羟基被TdT末端转移酶识别并经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链;所述CRISPR/Cas12a蛋白与富含A碱基的crRNA特异性识别所述DNA长单链并与其互补,引发Cas12a顺式切割活性并激发反式切割活性,将两端分别标记有荧光基团与荧光淬灭基团的荧光报告探针剪切从而产生荧光信号;不同浓度的Dam甲基转移酶催化反应可产生不同强度的荧光信号;
所述crRNA的序列如SEQ ID NO.2所示,所述荧光报告探针的序列如SEQ ID NO.3所示;
所述荧光基团选自HEX、FAM、Cy3、Cy5中的至少一种,所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种;
切割哑铃型DNA探针使用的剪切酶为Dpn I甲基化限制性内切酶;
切割哑铃型DNA探针时还需要加入S腺苷甲硫氨酸;
所述无模板延伸反应需加入原料脱氧胸腺嘧啶核苷酸和TdT末端转移酶的激活剂,所述激活剂为钴离子。
2.一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备哑铃型DNA探针:采用如SEQ ID NO.1所示序列的哑铃单链,所述哑铃单链5’端修饰有磷酸基团P、3’端连接有OH,在DNA连接酶的作用下,5’端磷酸基团P与3’端OH连接形成封闭的哑铃环,连接端口处为5’-GAAG-3’,得到含哑铃型DNA探针的体系;
(2)甲基化与酶切反应:在含哑铃型DNA探针的体系中加入Dam甲基化转移酶、Dpn I甲基化限制性内切酶与S腺苷甲硫氨酸,进行甲基化与酶切反应,哑铃型DNA探针被甲基化并切割形成两条发夹结构和一条DNA双链,即四条含3’端羟基的DNA链;
(3)无模板扩增反应:取甲基化与酶切反应的产物,加入TdT末端转移酶、脱氧胸腺嘧啶核苷酸和TdT末端转移酶激活剂,经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链;所述激活剂为钴离子;
(4)在无模板扩增反应产物中加入CRISPR/Cas12a蛋白、如SEQ ID NO.2所示序列的crRNA与如SEQ ID NO.3所示序列的荧光报告探针,构建得到所述检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统。
3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于:所述步骤(1)中,哑铃型DNA探针的制备方法包括如下步骤:取哑铃单链干粉,用TE缓冲液溶解,再加入DNA连接酶反应缓冲液,进行反应,再加入DNA连接酶,反应形成哑铃环;
所述步骤(2)中,甲基化与酶切反应在1×Dam甲基转移酶缓冲液和1×rCutsmart缓冲液中进行;
甲基化与酶切反应时间为30-75分钟;
甲基化与酶切反应温度为37℃;
所述Dpn I甲基化限制性内切酶的浓度为4-12U;
甲基化与酶切反应结束后,于90℃反应10分钟使酶灭活;
所述步骤(3)中,所述TdT末端转移酶的浓度为4-20U;
无模板扩增反应时间为1h;
无模板扩增反应温度为37℃;
无模板扩增反应结束后,80℃反应10min以灭活TdT末端转移酶;
所述步骤(4)中,所述荧光报告探针末端修饰有荧光基团和荧光淬灭基团,所述荧光基团选自HEX、FAM、Cy3、Cy5中的至少一种,所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于:所述步骤(1)中,所述DNA连接酶为T4DNA连接酶,所述DNA连接酶反应缓冲液为10×T4 DNA连接酶反应缓冲液;
加入DNA连接酶反应缓冲液后,先于95℃加热5分钟,再缓慢降至室温,加入DNA连接酶;
加入DNA连接酶后,先于16℃反应3小时,再于70℃反应10分钟,使哑铃成环;
当哑铃环形成后,加入核酸外切酶以去除未成环的单双链,并灭活核酸外切酶,得到只含哑铃型DNA探针的体系。
5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于:所述步骤(1)中,所述核酸外切酶选用核酸外切酶I和核酸外切酶III;
当哑铃环形成后,加入核酸外切酶于37℃反应1小时,再于90℃反应20分钟使核酸外切酶完全灭活。
6.如权利要求1所述荧光生物传感系统和/或如权利要求2-5任一项所述方法制备得到的荧光生物传感系统在检测Dam甲基转移酶上的应用,所述应用为非疾病诊断或治疗目的。
7.一种非疾病诊断或治疗目的的检测Dam甲基转移酶的方法,其特征在于:采用如权利要求1所述荧光生物传感系统和/或如权利要求2-5任一项所述方法制备得到的荧光生物传感系统,所述方法包括如下步骤:将所述荧光生物传感系统进行CRISPR/Cas12a酶切反应后检测荧光信号。
8.一种检测试剂盒,用于检测Dam甲基转移酶,其特征在于:所述试剂盒包括权利要求1所述荧光生物传感系统和/或如权利要求2-5任一项所述方法制备得到的荧光生物传感系统。
9.如权利要求1所述荧光生物传感系统和/或如权利要求2-5任一项所述方法制备得到的荧光生物传感系统在筛选MTase抑制剂上的应用,所述MTase为Dam甲基转移酶,所述应用为非疾病诊断或治疗目的。
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