CN112626179B - 一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用 - Google Patents

一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于荧光传感器技术领域，具体公开了一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用。所述荧光传感器的制备和检测miRNA过程为：采用DNA单链探针C和B制备双链产物C‑B复合物，将C‑B复合物与单链F、靶序列T(miRNA)混合，孵育，获得含PAM位点的双链DNA，即Cas12a激活剂；再加入预组装的Cas12a‑crRNA复合物和标记有荧光猝灭基团的报告探针，混合，孵育；反应完成后，对蛋白进行灭活；通过对荧光信号的检测即可获知靶物质miRNA的含量。本发明的荧光传感器将立足点介导的级联链置换反应和CRISPR/Cas12a系统结合实现级联信号放大和对miRNA的高灵敏检测。本传感器制备及检测方法简便、成本低，能有效防止非特异性反应的发生，稳定性和重现性良好。

Description

一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制 备与应用
技术领域
本发明涉及荧光传感器技术领域，主要涉及一种用于检测miRNA的荧光传感器，特别是涉及一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用。
背景技术
MiRNA是一种单链、长约19-23个核苷酸的内源性非编码调控RNA，在生物体的早期发育、细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥着重要的调控作用。大量研究表明，异常表达的miRNA作为新的肿瘤标志物，在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要作用。MiRNA有许多独特的特性，如小尺寸、高序列相似性、易降解，低丰度等，这对其准确的检测和定量提出了分析挑战。传统的miRNA分析方法，包括反转录定量聚合酶链反应(ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、微阵列技术、基因测序、印迹杂交等已得到广泛应用。但它们通常需要复杂的系统和繁琐的样本/试剂处理，这依赖于拥有专门仪器的成熟实验室或训练有素的操作员，存在灵敏度低、方法费时、假阳性、设备昂贵等缺点。因此，迫切需要开发新的高灵敏度的策略来监测miRNA水平，特别是那些能够用于快速和通用的医疗点诊断应用的技术。
成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat，CRISPR)是来源于细菌和古细菌中针对入侵核酸成分的适应性免疫系统，由于该系统的可编程性，现如今已成为转录调控、基因组编辑和核酸检测等方面的重要工具。特别是在CRISPR相关蛋白Cas12a、Cas13a的反式切割活性被发现之后，拓宽了其在核酸检测中的应用。CRISPR/Cas12a，属于II类V-A CRISPR系统，能够利用CRISPR RNA(crRNA)特异性识别单链DNA(ssDNA)或含有原间隔子相邻基序(Proto-spacer AdjacentMotif，PAM)的双链DNA(dsDNA)，激活Cas12a的反式切割活性并不加区分地切割非特异性ssDNA。Doudna等基于Cas12a的此特点建立了DETECTR方法(DNA Endonuclease-TargetedCrispr Trans Reporter)。此外，Cas12a还用于人类基因分型和病原体检测、癌症突变测试，以及现场即时检测等，为miRNA的检测提供了新的契机。
基于CRISPR/Cas系统开发的新型检测技术与传统核酸检测技术相比，具有以下几方面的优点：(1)简便；(2)成本低；(3)耗时短；(4)灵敏度高；(5)特异性高；(6)多重检测等。尽管CRISPR/Cas12a在核酸检测方面具有很大潜力，但仍存在某些限制。首先，CRISPR效应器存在序列限制，它们严格要求在dsDNA目标序列上具有特征性的PAM，从而限制了核酸分析的通用性。其次，当前大多数方法依赖于PCR或RPA来扩增靶物质，需要多个酶、复杂的引物设计和热循环等严格的反应条件，这可能会带来不便。最重要的是Cas蛋白与其他酶体系结合，由于不同体系的不兼容性反应的效率受到影响。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用，用于解决现有技术中CRISPR/Cas技术在核酸检测上存在的通用性不高、反应条件严格、兼容性差、反应效率低等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：
(a)制备C-B复合物：采用与crRNA互补的DNA单链探针C、封闭探针B制备双链产物C-B复合物；
所述探针C的核苷酸序列为：
5′-TCAACATCAGTCTGATAAGCTACATCGCAAAGGCGA-3′；
所述探针B的核苷酸序列为：5′-GCGATGTAGCTTATCAGAC-3′；
(b)构建CTSDR：取步骤(a)所得的C-B复合物，与单链F、靶序列T(miRNA)混合，孵育，获得含PAM的双链DNA，即Cas12a激活剂；
所述单链F的核苷酸序列选自5′-TGCGATGTAGCTTATCAGACTGA-3′、5′-TTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA-3′、5′-TTTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA-3′中的至少一种；
所述即为miRNA，所述靶序列T(miR-21)靶序列T的核苷酸序列为：
5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′；
(c)将预组装的Cas12a-crRNA复合物和标记有荧光淬灭基团的单链报告探针加入步骤(b)所得的反应液中，混合，孵育；
(d)反应完成后，对蛋白进行灭活，得到荧光传感器。
进一步，所述步骤(a)中，探针C和探针B的摩尔比为1∶1。
进一步，所述步骤(a)中，探针C和B通过变性退火组装制得所述C-B复合物。
可选地，变性温度为90-100℃，优选为95℃。
可选地，变性时间为5-10min，优选为5min。
进一步，所述步骤(a)中，先将探针C和B溶解于缓冲液中，进行变性反应，变形反应结束后立即复性，制得所述C-B复合物。
可选地，复性温度为35-40℃，优选为37℃。
可选地，复性时间为0.5-2h，优选为1h。
可选地，所述缓冲液选自NEBuffer缓冲液、NEBuffer 2.1、NEBuffer 3.1中的至少一种。
进一步，所述步骤(a)中，制备C-B复合物所用的反应溶液包括：20μL 10×NEBuffer3.0缓冲液、10μL 10μM探针C和10μL 10μM探针B、60μL无酶水。
进一步，所述步骤(b)中，所述单链F的核苷酸序列为：
5′-TTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA-3′。
进一步，所述步骤(b)中，C-B复合物和单链F的摩尔比为1∶1。
进一步，所述步骤(b)中，C-B复合物与单链F、靶序列T混合形成的混合液中，C-B复合物的浓度为1-15nM，优选为10nM，靶序列T的终浓度≥70.28fM。
进一步，所述步骤(b)中，孵育温度为35-40℃，优选为37℃。
进一步，所述步骤(b)中，孵育时间为20-80min，优选为60min。
进一步，所述步骤(b)中，构建CTSDR所用的反应溶液包括：10μL10× NEBuffer3.0缓冲液、1μL1μM C-B复合物、1μL1μM单链F、20μL靶物质miRNA、56μL无酶水。
进一步，所述步骤(c)中，Cas12a-crRNA复合物的预组装方法为：将Cas12a与crRNA等比例混合，在室温下放置10-20min，优选为10min。
进一步，所述步骤(c)中，所述单链crRNA的核苷酸序列为：
5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGAUGUAGCUUAUCAGACUG-3′。
进一步，所述步骤(c)中，所述单链报告探针的核苷酸序列为：5′-FAM-TTATT-BHQ1-3′。
进一步，所述步骤(c)中，反应液中Cas12a-crRNA复合物的浓度为30-70nM，优选为50nM。
进一步，所述步骤(c)中，孵育在避光条件下进行。
进一步，所述步骤(c)中，孵育温度为35-40℃，优选为37℃。
进一步，所述步骤(c)中，孵育时间为40-80min，优选为60min。
进一步，所述步骤(c)中，反应溶液包括：5μL 1μM Cas12、5μL 1μM crRNA、1μL 40×RNA酶抑制剂、1μL 50μM报告探针。
进一步，所述步骤(d)中，蛋白灭活温度为60-80℃，优选为65℃。
进一步，所述步骤(d)中，蛋白灭活时间为5-15min，优选为10min。
本发明第二方面提供一种根据第一方面所述的制备方法制得的用于检测miRNA的荧光传感器。
本发明第三方面提供根据第二方面所述的荧光传感器在检测miRNA上的应用。
本发明第四方面提供一种采用第一方面所述的制备方法制得荧光传感器检测miRNA的方法，包括如下步骤：将步骤(d)得到的反应液加入比色皿中，采用荧光分光光度计检测荧光信号，即可获知靶物质miRNA的含量。在一定范围内，miRNA浓度越高，则荧光信号越强。
进一步，所述荧光传感器检测miRNA的方法包括如下步骤：
(1)清洗石英比色皿；
(2)设置参数：设置激发波长为490nm，发射波长范围为500-600nm，电压为600V；
(3)调零：向石英比色皿中加入ddH2O，进行调零；
(4)进行检测：将步骤(d)得到的反应液加入石英比色皿中，用荧光分光光度计检测，即可获得荧光信号。
进一步，所述步骤(1)中，石英比色皿的清洗方式为：将石英比色皿用酒精浸泡，并用ddH2O清洗。
如上所述，本发明的CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用，具有以下有益效果：
本发明首次将立足点介导的级联链置换反应和CRISPR/Cas12a相结合并用于miRNA的检测，通过立足点介导的级联链置换反应结合CRISPR系统本身的信号放大作用，能双重放大荧光信号，提高对靶物质miRNA检测的灵敏度，并克服Cas12a的PAM序列限制，扩展传感器的通用性。
本发明成功构建了可用于检测miRNA的荧光传感器，且本发明的荧光传感器对miRNA的测定显示出灵敏度高、重现性好的能力。与现有技术比较，本发明的荧光传感器成本低，灵敏度高，反应速度快，有望应用于实际样品和临床标本的测定，发展成为具有临床应用价值的传感器。
附图说明
图1显示为本发明构建的荧光传感器的检测原理图。
图2显示为本发明实施例2中验证荧光传感器可行性的荧光信号对比图。
图3显示为本发明实施例2中验证荧光传感器可行性的电泳验证图。
图4显示为在本发明实施例1的反应体系中加入5’端立足点碱基不同的F链构建得到的荧光传感器的响应信号结果图。
图5显示为在本发明实施例1的反应体系中加入不同浓度C-B复合物：F链(1∶1)构建得到的荧光传感器的响应信号结果图。
图6显示为在本发明实施例1的反应体系中加入不同浓度预组装的Cas12a-crRNA构建得到的荧光传感器的响应信号结果图。
图7显示为本发明实施例1的反应体系在不同CTSDR反应时间下构建得到的荧光传感器的响应信号结果图。
图8显示为本发明实施例1的反应体系在不同Cas12a切割反应时间下构建得到的荧光传感器的响应信号结果图。
图9显示为本发明实施例1的荧光传感器的检测灵敏度(A)及线性分析图(B)。
图10显示为本发明的荧光传感器的特异性结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明首次将立足点介导的级联链置换反应和CRISPR/Cas12a相结合，构建一种用于检测miRNA的荧光传感器，通过立足点介导的级联链置换反应结合CRISPR系统本身的信号放大作用，能双重放大荧光信号，提高对靶物质检测的灵敏度，并克服Cas12a的PAM序列限制，扩展传感器的通用性。
立足点介导的链置换反应(Toehold-mediated Strand Displacement Reaction，TMSDR)是一种加速杂交反应，可通过入侵链可逆地置换双链结构。该方法避免了任何用于靶循环扩增的酶的参与，并且具有降低背景噪声的特性。2006年，Winfree等人对TMSDR做了进一步改进，提出了级联TMSDR(Cascade driven Reaction by Strand Displacement，CTSDR)，用于核酸反应网络的动态规划。CTSDR的速率常数可以跨越几个数量级，这有助于构建一个健壮、低成本和自主的检测平台，而不需要特定的反应条件。因此，本发明将CTSDR与CRISPR/Cas联用，创新地提出了一种miRNA响应CRISPR/Cas12a的生物传感器，通过构建立足点介导的级联链置换反应产生可被Cas12a-crRNA复合物识别的含有PAM位点的双链DNA，用于检测miRNA。本发明链置换的可编程性与Cas12a的功能相结合成功构建了等温核酸检测平台。
本发明的荧光传感器主要有以下几点优势：
(1)高保真度识别，CTSDR特异性识别，可确保检测具有高特异性的目标。
(2)高灵敏度，CTSDR反应可以循环利用靶物质，扩增靶信号；且CRISPR/Cas12a具有高周转率，双重扩增提高了检测的灵敏度。
(3)等温反应，适用于现场即时检测。
(4)具有普适性；人为地加入含有PAM位点的辅助链，扩展了其检测范围。
下面通过具体的实施例来对本发明的方案进行详细地说明。
实施例1
制备荧光传感器并检测miRNA
1.材料与方法
1.1材料
HPLC纯化的寡核苷酸由上海生工合成。EnGen Lba Cas12a和NEBuffer 3.0溶液购自New England Biolabs公司。DNA marker、无酶水和RNA酶抑制剂购于大连Takara公司。
1.2检测仪器
Cary Eclipse荧光分光光度计(安捷伦)。
1.3检测原理
图1显示为本发明的检测原理图。
本发明检测miRNA的荧光传感器包括信号识别部分和信号转换部分，所述信号识别部分为靶物质触发的立足点介导的级联链置换反应(CTSDR)，所述信号转换部分为将靶物质转换为Cas12a可识别的含有PAM序列的双链DNA。
信号识别部分由双链产物C-B复合物(C-B)和单链F组成，所述双链产物C-B复合物(C-B)由与crRNA互补的探针C、封闭探针B组成，并通过变性退火组装而成。
其中，探针C的核苷酸序列为：
5′-TCAACATCAGTCTGATAAGCTACATCGCAAAGGCGA-3′。
探针B的核苷酸序列为：5′-GCGATGTAGCTTATCAGAC-3′。
单链F的核苷酸序列为：5′-TTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA-3′。
靶序列T(miR-21)的核苷酸序列为：5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′。
信号转换部分由预组装的Cas12a-crRNA复合物和标记有荧光猝灭基团的单链报告探针组成。
其中，单链crRNA的核苷酸序列为：
5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGAUGUAGCUUAUCAGACUG-3′。
单链报告探针的核苷酸序列为：5′-FAM-TTATT-BHQ1-3′。
本发明的荧光传感器检测原理为：在均相体系中，靶物质与C-B复合物中的立足点(Toehold t1)结合，通过立足点介导的链置换反应取代探针B，从而暴露出位于探针C中封闭的单链F可识别的立足点(Toehold t2)。随后，单链F与暴露的立足点结构域杂交，随着碱基配对的延伸置换目标并形成新的含有PAM位点的双链DNA(复合物C-F，也称为Cas12a激活剂)。接着，移位的靶物质快速结合其他C-B复合物触发下一个循环反应，从而产生大量Cas12a激活剂。预组装的Cas12a-crRNA系统可以识别上述反应产生的Cas12a激活剂，激活其切割活性，非特异性的反式切割报告探针，产生可测量的荧光信号。通过对荧光信号的检测即可获知靶物质的含量。
1.3制备和检测方法
1、构建立足点介导的级联链置换反应(CTSDR)：
(1)制备C-B复合物：将探针C与探针B以1∶1的比例溶解于NEBuffer3.0缓冲液中，在95℃条件下变性5分钟，立即置于37℃条件下复性1h，获得终浓度为1μM的C-B复合物。
Figure BDA0002848943390000071
将所得C-B复合物于4℃放置保存，备用。
(2)构建CTSDR：将待测靶物质T链、C-B复合物和单链F共同溶解于缓冲溶液，在37℃条件下进行60min置换反应。
Figure BDA0002848943390000072
获得大量含PAM的双链DNA(即Cas12a激活剂)，用于后续实验。
2、构建CRISPR/Cas12a切割反应体系：将Cas12a与crRNA与等比例混合，在室温下放置10min，得到预先组装的Cas12a反应系统，然后将预组装的Cas12a-crRNA复合物和单链报告探针加入上述混合物中，在37℃条件下进行60min避光反应。
Figure BDA0002848943390000081
反应结束，将反应产物置于65℃10min，灭活Cas12a的切割活性。
3、检测荧光信号：将上述反应产物加入石英比色皿中，利用荧光分光光度计进行测量。具体检测步骤如下：
(1)石英比色皿清洗：将石英比色皿用酒精浸泡，并用ddH2O清洗。
(2)设置参数：设置激发波长为490m，发射波长范围为500-600nm，电压为600V。
(3)调零：向石英比色皿中加入ddH2O，进行调零。
(4)进行检测：将反应液加入石英比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。
实施例2
验证检测miRNA荧光传感器的可行性
1、对立足点介导的级联链置换反应和Cas12a的切割作用用荧光检测进行验证。
在实施例1的反应体系中加入5’端立足点碱基个数不同的单链F构建得到荧光传感器，并检测其荧光响应信号，结果如图2所示。图2显示为验证本发明荧光传感器可行性的荧光信号对比图，其中：
红色曲线为实验组；
蓝色曲线为缺乏靶物质的对照组；
绿色曲线为没有Cas12a的对照组；
黄色曲线为没有crRNA的对照组。
从图2可知，当不存在靶物质、Cas12a或者crRNA时，没有明显的荧光信号；只有在有靶物质的情况下，才能够得到明显的荧光信号。
2、对实施例1中整体检测过程用琼脂糖凝胶电泳进行验证。
图3显示为验证本发明荧光传感器可行性的电泳验证图，其中：
泳道M为20bp DNA Marker；
泳道1为靶物质；
泳道2为C-B复合物；
泳道3为靶物质和C-B复合物反应后所得的反应产物；
泳道4为靶物质、C-B复合物和单链F反应的产物；
泳道5为向靶物质、C-B复合物和单链F的反应产物中加入预组装的Cas12a-crRNA复合物所得产物；
泳道6为向C-B复合物和单链F的反应产物中加入预组装的Cas12a-crRNA复合物所得产物。
如图3所示，泳道2、3显示靶物质能够置换下探针B；泳道3、4显示在单链F的辅助下能够形成新的双链DNA，并促进靶物质的循环；泳道5、6对比显示只有在靶物质存在的条件下，C-B复合物、单链F和被置换的单链B才会被切割。
实施例3
检测miRNA荧光传感器及其使用条件的优化
本实施例对实验过程中几个重要的条件，即对单链F 5’端立足点的碱基个数、反应底物的浓度、预组装的Cas12a-crRNA复合物的浓度、CTSDR的反应时间和Cas12a的切割反应时间这几个对本发明方案实验测定影响较大的测定条件进行了进一步的优化，对每一个优化条件都由低值到高值分别选取至少五个点进行一系列实验。
1、为考察单链F 5’端立足点的碱基个数对所开发的荧光传感器的稳定性和反应速度的影响，我们进一步研究了最佳的立足点碱基个数。
图4显示为在本发明实施例1的反应体系中加入5’端立足点碱基不同(TG、TTG、TTTG)的F链构建得到的荧光传感器的响应信号结果图。
由图4可知，当立足点碱基为TTG时，信噪比最佳。因此，F链凸出的立足点选择TTG最佳。
2、为考察本发明方案中反应底物C-B复合物和单链F的浓度对miRNA检测结果的影响，C-B复合物和单链F以1∶1的比例进行研究。本实验采用了不同浓度(1nM、5nM、10nM、15nM、20nM)的反应底物C-B复合物构建荧光传感器。
图5显示为在本发明实施例1的反应体系中加入不同浓度C-B复合物：F链(1∶1)构建得到的荧光传感器的响应信号结果图。
由图5可知，随着反应底物C-B复合物浓度的增加，信噪比也随之增强；当底物浓度为10nM时，信噪比达到最高，其后随着底物浓度的升高信噪比降低，说明底物浓度已到达饱和状态，因此，选择10nM作为反应的最佳底物浓度。
3、为考察本发明方案中预组装的Cas12a-crRNA复合物浓度对miRNA检测结果的影响，本实验采用了不同浓度(30nM、40nM、50nM、60nM、70nM)的预组装的Cas12a-crRNA复合物构建荧光传感器。
图6显示为在本发明实施例1的反应体系中加入不同浓度预组装的Cas12a-crRNA构建得到的荧光传感器的响应信号结果图。
由图6可知，随着预组装的Cas12a-crRNA复合物浓度的增加，荧光信噪比也随之增强；当预组装的Cas12a-crRNA复合物浓度为50nM时，信噪比达到最高，其后随着浓度的升高信噪比略微降低，说明预组装的Cas12a-crRNA复合物的浓度已到达饱和状态，因此，选择50nM作为反应的最佳浓度。
4、为考察CTSDR反应时间对本发明的荧光传感器检测结果的影响，本实验采用了不同的反应时间构建荧光传感器。
图7显示为本发明实施例1的反应体系在不同CTSDR反应时间下构建得到的荧光传感器的响应信号结果图。
由图7可知，荧光信噪比随反应时间的变化而变化，当反应时间为60min时，信噪比达到最大值，而后继续增加反应时间信噪比反而降低，说明60min为最佳反应时间。
5、为考察Cas12a切割时间对本发明的荧光传感器检测结果的影响，本实验采用了不同的反应时间构建荧光传感器。
图8显示为本发明实施例1的反应体系在不同Cas12a切割反应时间下构建得到的荧光传感器的响应信号结果图。
由图8可知，荧光信噪比随反应时间的变化而变化，当反应时间为60min时，信噪比达到最大值，而后续继续增加反应时间信噪比反而降低，说明60min为最佳反应时间。
实施例4
检测miRNA荧光传感器的性能分析
为了评估本发明荧光传感器的性能，在实施例3得到的最佳实验条件下，探索所构建的荧光传感器检测miRNA的动态范围和灵敏度。
图9显示为本发明实施例1的荧光传感器的检测灵敏度(A)及线性分析图(B)。
由图9可知，当miRNA-21浓度在100fM到100pM之间时，得到的荧光信号与miRNA-21浓度的对数呈线性相关，线性方程式为F＝15.682lgC+0.809(R2＝0.98)，检测限为66.4fM。
实施例5
制备的检测miRNA荧光传感器的稳定性和重现性分析
根据实施例1所述的方法，在实施例3得到的最佳实验条件下，构建荧光传感器，并采用所构建的荧光生物传感器分别对100pM的miRNA-21样品进行了批内测定和批间测定。荧光值的可变系数约为2.4％和4.67％，表明所开发的荧光生物传感器具有良好的重现性和稳定性。
图10显示为本发明的荧光传感器的特异性结果。
由图10可知，只有存在miR-21时才会有较强的荧光信号，对照组miR-101、miR-122、miR-155、miR-373、miR-378没有明显的荧光信号，证明该荧光生物传感器具有良好的特异性。
综上所述，本发明的荧光传感器将立足点介导的级联链置换反应和CRISPR/Cas12a构结合实现级联信号放大，实现对miRNA的高灵敏检测。本发明构建的荧光传感器制备及检测方法简便、成本低，能有效防止非特异性反应的发生，且稳定性和重现性良好，有望在miRNA的检测分析及应用研究方面推广使用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学
<120> 一种CTSDR与CRISPRCas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用
<130> PCQYK209429-HZ
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针C
<400> 1
tcaacatcag tctgataagc tacatcgcaa aggcga 36
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针B
<400> 2
gcgatgtagc ttatcagac 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链F
<400> 3
ttgcgatgta gcttatcaga ctga 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶序列T
<400> 4
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> crRNA
<400> 5
uaauuucuac uaaguguaga ucgauguagc uuaucagacu g 41

Claims (10)

1.一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）制备C-B复合物：采用与crRNA互补的DNA单链探针C、封闭探针B制备双链产物C-B复合物；
所述探针C的核苷酸序列为：
5'- TCAACATCAGTCTGATAAGCTACATCGCAAAGGCGA-3'；
所述探针B的核苷酸序列为：5'- GCGATGTAGCTTATCAGAC-3'；
（b）构建CTSDR：取步骤（a）所得的C-B复合物，与单链F、靶序列T混合，孵育，获得含PAM的双链DNA，即Cas12a激活剂；
所述单链F的核苷酸序列选自5'- TGCGATGTAGCTTATCAGACTGA -3'、 5'-TTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA -3'、5'- TTTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA -3'中的至少一种；所述靶序列T即为miRNA，所述靶序列T的核苷酸序列为：
5'- UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；
（c）将预组装的Cas12a-crRNA复合物与标记有荧光基团和荧光猝灭基团的单链报告探针加入步骤（b）所得的反应液中，混合，孵育；
（d）反应完成后，对蛋白进行灭活，得到荧光传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）中，探针C和探针B的摩尔比为1:1；
和/或，所述步骤（a）中，探针C和B通过变性退火组装制得所述C-B复合物；
和/或，所述步骤（b）中，所述单链F的核苷酸序列为：
5'- TTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA -3'；
和/或，所述步骤（b）中，C-B复合物和单链F的摩尔比为1:1；
和/或，所述步骤（b）中，C-B复合物与单链F、靶序列T混合形成的混合液中，C-B复合物的浓度为1-15 nM，靶序列T的终浓度≥66.4fM；
和/或，所述步骤（b）中，孵育温度为35-40℃；
和/或，所述步骤（b）中，孵育时间为20-80min；
和/或，所述步骤（c）中，Cas12a-crRNA复合物的预组装方法为：将 Cas12a与crRNA等比例混合，在室温下放置10-20min；
和/或，所述步骤（c）中，所述单链crRNA的核苷酸序列为：
5'- UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGAUGUAGCUUAUCAGACUG-3'；
和/或，所述步骤（c）中，所述单链报告探针的核苷酸序列为：5'- FAM-TTATT-BHQ1-3'；和/或，所述步骤（c）中，孵育在避光条件下进行；
和/或，所述步骤（c）中，孵育温度为35-40℃；
和/或，所述步骤（c）中，孵育时间为40-80min；
和/或，所述步骤（d）中，蛋白灭活温度为60-80℃；
和/或，所述步骤（d）中，蛋白灭活时间为5-15min。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）中，变性温度为90-100℃；
和/或，所述步骤（a）中，变性时间为5-10min；
和/或，所述步骤（a）中，先将探针C和B溶解于缓冲液中，进行变性反应，变性反应结束后立即复性，制得所述C-B复合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）中，复性温度为35-40℃；
和/或，所述步骤（a）中，复性时间为0.5-2h；
和/或，所述步骤（a）中，所述缓冲液选自NEBuffer 3.0NEBuffer 2.1、NEBuffer 3.1。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（b）中，C-B复合物与单链F、靶序列T混合形成的混合液中，C-B复合物的浓度为10 nM；
和/或，所述步骤（b）中，孵育温度为37℃；
和/或，所述步骤（b）中，孵育时间为60min；
和/或，所述步骤（c）中，孵育温度为37℃；
和/或，所述步骤（c）中，孵育时间为60min；
和/或，所述步骤（d）中，蛋白灭活温度为65℃；
和/或，所述步骤（d）中，蛋白灭活时间为10min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）中，制备C-B复合物所用的反应溶液包括：20μL 10×NEBuffer3.0缓冲液、10μL 10μM探针C和10μL 10μM探针B、60μL无酶水；
和/或，所述步骤（b）中，构建CTSDR所用的反应溶液包括：10μL 10× NEBuffer3.0缓冲液、1μL 1μM C-B复合物、1μL 1μM 单链F、20μL 靶物质miRNA、56μL无酶水；
和/或，所述步骤（c）中，反应溶液包括：5μL 1μM Cas12、5μL 1μM crRNA、1μL 40×RNA酶抑制剂、1μL 50μM报告探针。
7.一种根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的用于检测miRNA的荧光传感器，所述miRNA为miR-21。
8.根据权利要求7所述的荧光传感器在检测miRNA上的应用，所述miRNA为miR-21。
9.一种采用权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的荧光传感器检测miRNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：将步骤（d）得到的反应液加入比色皿中，采用荧光分光光度计检测荧光信号，即可获知靶物质miRNA的含量，所述miRNA为miR-21。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述荧光传感器检测miRNA的方法包括如下步骤：
（1）清洗石英比色皿；
（2）设置参数：设置激发波长为490nm，发射波长范围为500-600nm，电压为600V；
（3）调零：向石英比色皿中加入ddH2O，进行调零；
（4）进行检测：将反应液加入石英比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。
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