CN111175365A - 一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学传感器技术领域,具体公开了一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用,其工作电极制备方法如下:将T型结构复合物(Ts)、燃料链F、靶序列T混合,得混合液,孵育得扩增产物;将捕获探针固定至金电极表面,再将扩增产物滴加到固定有捕获探针的金电极表面,制得熵驱动的链置换循环放大体系;将亚甲蓝(MB)与DNA纳米片混合反应得到MB‑DNS混合物,然后将DNS混合物滴加到金电极表面,孵育,得到DNA纳米片纳米分子放大检测体系,即完成所述工作电极的制备。本发明成功构建了一种DNS纳米分子和级联T型结构相结合的电化学传感器,用于检测外泌体miRNA,灵敏度高,反应速度快,稳定性和重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及电化学传感器技术领域,特别是涉及一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用。
背景技术
外泌体是30-200nm的细胞外小囊泡,通过与细胞质膜的融合释放到外周循环中,包含了各种生物活性物质,如miRNA、蛋白质和DNA,外泌体被赋予独特的抗原提呈和细胞间通讯的生物学功能。研究表明,存在于外泌体中的miRNA(Exo-miRNA)与乳腺癌、胃癌和结肠癌密切相关,并且外泌体miRNA可免受RNase降解,已成为临床早期诊断中重要的肿瘤生物标志物。目前,检测外泌体的常用方法是定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。然而,这种方法费时费力,因此,开发一种快速和高灵敏度的新方法来准确测量外泌体miRNA尤为重要。
近年来,熵驱动循环反应(EDCR)、催化发夹组装(CHA)和杂交链反应(HCR)等无酶信号放大方法被探索用于miRNA的放大检测。为了明显提高反应速度,参与信号放大传感系统的可扩散反应物被组装在一个紧凑的空间中。例如,Ju等人(Ren,K.;Xu,Y.;Liu,Y.;Yang,M.;Ju,H.A Responsive“Nano String Light”for Highly Efficient mRNA Imagingin Living Cells via Accelerated DNA Cascade Reaction.ACS Nano 2018,12(1),263-271.)设计了一种定位的HCR,即发夹探针交替结合到滚环扩增(RCA)产生的长DNA链上进行mRNA的检测,与传统的HCR相比,表现出极快的反应速度。类似地,Wei等人(Wei,Q.;Huang,J.;Li,J.;Wang,J.;Yang,X.;Liu,J.;Wang,K.DNA nanowire based localized catalytichairpin assembly reaction for microRNA imaging.Chem.Sci.2018,9(40),7802-7808)开发了一种用于miRNA成像的定位CHA,其中CHA反应物通过多条单链杂交被固定在组装的DNA纳米线上。
虽然上述传感系统中的局域化的反应底物可以大幅度提高反应速度,但这些策略存在以下缺陷:1)定域底物的构建需要多个组装步骤,导致费时费力;2)可扩散反应物与DNA纳米线的杂交效率在物理条件下可能较低,直接导致定位结构不完全;3)CHA和HCR的固有特性,例如不可接受的电路泄漏和严格的反应条件,即二价金属离子(如Mg2+)总是对分析性能有不利影响,限制了它们在早期肿瘤诊断中的进一步应用。此外,泄漏可能更严重,因为紧凑空间中增加的DNA发夹数量更容易发生非特异性相互作用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用,基于局域化的T结构熵驱动循环反应和多功能DNA纳米片作为电化学标签,用于快速和高灵敏地检测外泌体miRNA。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明第一方面提供一种检测外泌体miRNA的电化学传感器的制备方法,所述电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极,所述工作电极的制备方法包括以下步骤:
(1)金电极表面处理:将裸金电极表面处理干净,备用;
(2)制备扩增产物:将T型结构复合物(Ts)、燃料链F、靶序列T混合,得混合液,孵育,得扩增产物;
(3)将捕获探针固定至处理干净的金电极表面,再将步骤(2)所得的扩增产物滴加到固定有捕获探针的金电极表面,孵育,制得熵驱动的链置换循环放大体系;
(4)将亚甲蓝(MB)与DNA纳米片(DNS)混合反应得到MB-DNS混合物,然后将MB-DNS混合物滴加到步骤(3)所得的金电极表面,孵育,得到DNA纳米片纳米分子放大检测体系,即完成所述工作电极的制备。
进一步,步骤(2)中,所述T型结构复合物(Ts)采用DNA单链P、R、L1和L2制备而成。
可选地,所述DNA单链P、R、L1和L2的摩尔比为1∶1∶1∶1。
可选地,制备T型结构复合物(Ts)时,先将DNA单链P、R、L1和L2分别溶解于杂交液中,再进行混合。其中,所述杂交液包括10mM Tris、480mM NaCl和5mM MgCl2。
可选地,所述单链P的核苷酸序列为:
5′-CCACATACATCATATTCCCTTAGCTTATCAGACTGA-3′(SEQ ID NO.1)。
可选地,所述单链R的核苷酸序列为:
5′-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGG-3′(SEQ ID NO.2)。
可选地,所述单链L1的核苷酸序列为:
5′-CAAACTAAACAACCACCGTAAGTTAGTTGGAGACGTAGGAGGAGGTAATGAATG-3′(SEQ IDNO.3)。
可选地,所述单链L2的核苷酸序列为:
5′-CATTCATTACCTCCTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGGGTTGGTTGTTTAGTTTG-3′(SEQID NO.4)。
可选地,步骤(2)中,所述燃烧链F的核苷酸序列为:
5′-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGGCCCTTAGCTTATCAGACTGA-3′(SEQ ID NO.5)。
可选地,步骤(2)中,所述靶序列T的核苷酸序列为:
5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′(SEQ ID NO.6)。
进一步,步骤(2)中,T型结构复合物(Ts)、燃料链F的等摩尔混合。
进一步,步骤(2)中,混合液中靶序列T的终浓度≥65aM,优选为0.1fM-1nM,更优选为100pM。
进一步,步骤(2)中,孵育时间≥30min,优选为30-90min,更优选为60min。
进一步,步骤(3)中,所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针,序列为:
5′-AGGGAATATGATGTATGTGGTTTTT-SH-3′(SEQ ID NO.7)。
进一步,步骤(3)中,所述捕获探针的浓度为100~1000nmol/L,优选为1000nmol/L。
进一步,步骤(3)中,捕获探针固定在金电极表面上后,需采用MCH封闭非特异性吸附位点。
进一步,步骤(4)中,DNA纳米片(DNS)的制备方法具体包括:将DNA单链1-9混合,退火得到DNA纳米片(DNS)。
可选地,所述单链1-9的核苷酸序列如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.16所示。
进一步,步骤(1)的金电极表面处理步骤为:将裸金电极表面采用铝粉进行抛光处理,去离子水清洗后用食人鱼溶液(H2SO4∶H2O2=3∶1)处理金电极10-20min,再用去离子水清洗,吹干备用。
进一步,所述参比电极选自饱和甘汞电极或银氯化银电极(Ag/AgCl)中的任意一种;优选地,所述参比电极为甘汞电极。
进一步,所述对电极为铂丝电极。
进一步,步骤(3)和步骤(4)中,孵育反应时间为30-90min,优选为60min。
进一步,步骤(3)和步骤(4)中,孵育温度为4-48℃,优选为37℃。
进一步,步骤(2)中,所述T型结构复合物(Ts)末端凸出的胸腺嘧啶核苷数为为2个。
进一步,步骤(4)中,所述DNA纳米片(DNS)的浓度为0.5-1.5μM,优选为1μM。
本发明第二方面提供了一种采用上述方法制备得到的电化学传感器。
本发明第三方面提供上述电化学传感器在检测外泌体miRNA上的应用。
进一步,检测外泌体miRNA时,先将外泌体miRNA加入到T型结构复合物Ts和燃料链F的混合物中,孵育后得到扩增产物,再将扩增产物滴加至修饰有捕获探针的金电极上,再在金电极上滴加DNA自组装结构的DNS混合物,孵育得到工作电极;最后将工作电极、参比电极以及对电极连接到电化学工作站上,用磷酸缓冲液作为反应基底液,用差分脉冲伏安法(DPV)进行测定。
进一步,所述外泌体miRNA的检测浓度为0.1fM-1nM,检测限为65aM。
如上所述,本发明的检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用,具有以下有益效果:
本发明成功构建了一种基于局域化T型结构熵驱动循环反应和多功能DNA纳米片作为信号标签的电化学传感器,本发明首次将DNS纳米分子和级联T型结构相结合并且用于外泌体miRNA的检测,局域化T型结构熵驱动循环反应设计增加了电化学传感器对靶物质突变的检测灵敏度。将本电化学传感器用于检测外泌体miRNA,灵敏度高,反应速度快,稳定性强,重现性好,其线性范围为0.1fM-1nM,线性方程式为i=0.7021g C+9.676(R2=0.9928),检测限为65aM,线性相关系数为0.9928。
与现有技术比较,本发明的传感器成本低、灵敏度高、反应速度快等优点,有望应用于实际样品和临床标本的测定,发展成为具有临床应用价值的传感器。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中电化学传感器检测外泌体miRNA的原理图。
图2显示为本发明实施例2中电化学传感器在含0.4M KCl的5×10-3M[Fe(CN)6]3-/4-中,不同修饰电极(a)GE,(b)CP/GE,(c)MCH/CP/GE,(d)P/CP/MCH/GE,(e)MB-DNSIP/MCH/CP/GE的电化学阻抗谱(A)和循环伏安图(B),以及用100pM miRNA-21在PBS缓冲液中进行对照实验后,所制备的电化学生物传感器的DPV信号结果图(C)。
图3显示为本发明实施例2中检测外泌体miRNA电化学传感器的可行性的电泳结果图(A)、传统EDCR策略原理图(B)、EDCR和L-TEDCR策略的电化学DPV响应曲线图(C)。
图4显示为本发明实施例2中验证DNS自组装的电泳结果图(A)、原子力显微镜结果图(B)和电化学DPV响应曲线图(C/D/E)。
图5显示为本发明实施例2中外泌体的表征结果图(A)和粒径图(B)。
图6显示为本发明实施例3中电化学传感器的使用条件优化,即反应时间(A)、孵育温度(B)、DNS浓度(C)优化的的电化学DPV响应曲线图。
图7显示为本发明实施例4中电化学传感器检测外泌体miRNA的电化学DPV响应曲线图。
图8显示为本发明实施例5中电化学传感器对五个不同批次的miRNA-21样品进行检测的结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明是在国家自然科学基金委员会(项目批准号:81572080、81873980)、重庆市基础前沿研究项目(cstc2016jcyjA0194)及重庆市自然科学基金项目(cstc2018jcyjAX0349,cstc2018jcyjAX0132)的资助下完成的。
本发明的电化学传感器检测方法的原理为:基于局域化的T型结构熵驱动循环反应和多功能DNA纳米片作为电化学标签用于快速和高灵敏的外泌体miRNA检测。
结构DNA纳米技术通过简单的DNA自组装和化学修饰为生物传感提供了不同的放大信号标签,如辣根过氧化物酶标记的四面体、链霉亲和素共轭的树状大分子和纳米球。通过Watson-Crick碱基配对进行交联,可赋予这些标签在复杂体液中很好的稳定性。此外,高寻址能力和精确的可控性使得基于DNA的纳米结构能够以自定义的模式锚定信号分子。特别是片状纳米结构具有很大的表面积,为信号分子提供了许多结合位点。因此,我们推测DNA纳米片(DNS)可能是一种很有前途的纳米材料,通过容易地嵌入电活性物质而成为一种多功能和放大的信号标签。
为了避免现有技术中局域化反应的缺点,进一步提高电化学生物传感器的灵敏度,本发明采用可扩散的EDCR,基于局域T结构熵驱动电路反应(L-TEDCR)和通用DNS标签,开发了一种稳定且高灵敏度的无酶外泌体miRNA检测生物传感策略,并表现出低背景和优异的热稳定性。
L-TEDCR物质(Ts)仅通过简单的一步退火过程组装,以确保多个短单链的充分杂交。一旦加入Exo-miRNA,与经典的EDCR相比,L-TEDCR被快速触发,导致大量P链的产生。然后,释放的P链特异性地与捕获探针(CP)和DNS标签结合,从而产生用于检测Exo-miRNA的显著放大的电化学信号。此外,DNS的多功能性通过无标记负载的电活性分子,如亚甲蓝(MB)、阿霉素(Dox)和核酸酶得到证明。
进一步地,本发明通过对SGC7901细胞来源的外泌体miRNA的检测和回收试验,验证了该策略的实用性和可靠性。
具体实施过程如下:
实施例1
制备电化学传感器并检测外泌体miRNA
1、材料与方法
1.1、材料
从Sigma-Aldrich(St Louis,MO,USA)获得6-巯基-1-己醇(MCH)。HPLC纯化的寡核苷酸由上海生工合成。亚甲蓝溶液购于上海生工。细胞SGC7901购自American TypeCulture Collection(ATCC,Manassas,VA,USA)。胎牛血清(FBS),Dulbecco‘s改良老鹰培养基(DMEM)和青霉素-链霉素购自HyClone。
1.2、检测仪器
上海辰华CHI660D电化学工作站,检测系统为三电极系统,包括参比电极、对电极和工作电极,其中,参比电极为Ag/AgCl电极,对电极为铂丝电极,工作电极直径为3mm的金电极。
1.3、检测原理
如图1所示,本实施例中的电化学传感器是由T-结构复合物(Ts)、F链和亚甲蓝-DNA纳米片组成。Ts通过一锅法退火组装而成,其由P链、R链、L1链和L2链组成。在T型结构的末端,通过I2和I2*的部分互补设计了两个凸起的碱基(方案1A中的T2),加入到生物传感系统中,靶标可以与第一个立足点(蓝色区域)结合,并通过立足点介导的链置换反应取代P链,暴露位于L1链中的封闭的立足点(绿色结构域)。随后,F链与暴露的立足点结构域杂交,随着碱基配对的延伸置换目标和R链。然后,移位的靶快速结合到相邻的立足点以触发下一个循环反应,从而导致大量P链的替换。置换的P链与固定在电极表面的捕获探针CP特异性杂交,进一步捕获构建的MB-DNS。在退火形成的DNA纳米片溶液中滴加适当浓度的亚甲蓝溶液,使得亚甲蓝(MB)和DNA纳米片充分结合,得到MB-DNS混合溶液。将MB-DNS混合溶液滴加至电极表面,MB-DNS与P链部分杂交,形成了三层结构复合材料。通过对电化学信号的检测即可获知靶物质的含量。以上详细说明了基于L-TEDCR和MB-DNS标签的无酶、无标记电化学生物传感器检测外泌体miRNA的原理。本实施例中的电化学传感器的具体制备过程如下:
(1)金电极表面处理:
用0.05mm氧化铝浆料对裸金电极进行抛光处理至“镜面状”,去离子水超声清洗3次,每次3min;然后,用食人鱼溶液(70%H2SO4,30%H2O2)处理金电极10min,去离子水冲洗干净后用洗耳球吹干金电极表面。
(2)固定捕获探针:将10μL 0.5μmol/L巯基标记的捕获探针(CP)滴加在处理好的金电极表面,置于4℃过夜;所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针,具体序列为:5′-AGGGAATATGATGTATGTGGTTTTT-SH-3′。
(3)采用MCH封闭电极:将捕获探针组装好的金电极表面用Tris-HCl缓冲液冲洗电极三次后,滴加10μL 1μM MCH封闭0.5h(室温),去除非特异性吸附。重复冲洗电极得到探针修饰的工作电极备用。
(4)将制备好的探针修饰的工作电极用Tris-HCl缓冲液清洗后用氮气吹干。
(5)将等摩尔量的R链、P链、L1链和L2链在杂交缓冲液中从95℃到20℃恒速退火超过4h,制得T型结构复合物Ts。
(6)将DNA单链1-9混合,根据表1所示的退火程序组装得到DNA纳米片(DNS);在DNS退火组装完成后,将100μL溶液与100μL的1mM的MB混合,在37℃下轻微摇动1h,以确保MB或DOX插入到双链DNA的双链中,制得MB-DNS标签。
表1用于组装DNA纳米片(DNS)的退火程序
(7)将不同浓度的外泌体miRNA加入到T型结构复合物Ts(0.5μM)和燃料链F(0.5μM)的混合物中,然后将8μL混合物滴在制备的工作电极表面(MCH/CP/GE),并在37℃下反应1h;用Tris-HCl缓冲液洗涤后,将MB-DNS标签滴在电极上孵育1h。
(8)以PBS缓冲液作为电化学测量的基底溶液,将经步骤(4)处理后的待测电极置于其中,以Ag/AgCl电极为参比电极,铂丝电极为对电极,在室温下,用差分脉冲伏安法(DPV)进行测定。
以上所用的物质的核苷酸序列如表1所示。
表1
实施例2
验证检测外泌体miRNA电化学传感器的可行性
1、方案的可行性
利用电化学阻抗谱(EIS)、循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)分别验证了外泌体miRNA检测策略的可行性。首先,在含有[Fe(CN)6]3-/4-的溶液中,用电化学阻抗谱(EIS)和循环伏安法(CV)表征了裸金电极的逐步修饰过程。如图2A所示,半圆形直径等于电子转移电阻(Ret)的曲线,裸金电极只显示了一条几乎直线(曲线a),表明了良好的电子转移能力。捕获探针CP成功固定在裸电极上后,Ret增加(曲线b)。随后,由于CP和MCH阻碍了电子从溶液到电极表面的传输,MCH的组装进一步触发了Ret(曲线c)的增加。外泌体miRNA、T型反应底物Ts和F链在电极表面孵育后,Ret含量增加(曲线d),表明靶向介导的L-TEDCR释放的P链已成功结合到CP上。当MB-DNS加入上述电极后,Ret急剧增加(曲线e),证明通过CP和MB-DNS的部分杂交,DNS在修饰电极表面组装成功,在电极表面形成了MB-DNS/P/CP三层复合物。图2B显示,不同阶段的CV结果与EIS测量的结果一致。如图2C所示,在存在外泌体miRNA的情况下可以检测到极强的DPV信号,而在空白对照试验中没有明显的DPV信号。根据这些结果,所设计的电化学生物传感器可用于外泌体miRNA的检测。
2、L-TEDCR的表征
通过PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)实验确定Exo-miRNA是否触发L-TEDCR。
如图3A所示,泳道1、2、3和8分别对应于Exo-miRNA、P链、F链和T-结构(Ts)复合物。在没有Exo-miRNA的情况下,几乎没有P链产生(通道4),表明构建的L-TEDCR策略具有可忽略的背景泄漏。在不同浓度的Exo-miRNA存在下,燃料链F减少,同时出现大量的P链(泳道5,6和7),证明L-TEDCR如预期那样成功进行,具有信号放大能力。
为了证明所开发的L-TEDCR具有更高的反应速率和更低的电路泄漏,在相同的反应条件下比较了传统EDCR(图3B)和L-TEDCR策略的DPV响应。如图3C所示,在没有目标的情况下,两种策略不会产生P链,从而获得可以忽略不计的电流响应(曲线c和d)。这些结果表明所构建的L-TEDCR策略存在可忽略的背景泄漏,即使EDCR的底物是在紧凑的空间中组装的。然而,在Exo-miRNA存在下,L-TEDCR方法得到的DPV信号(曲线a)明显强于常规EDCR(曲线b),表明L-TEDCR具有快速反应动力学。与传统的EDCR相比,开发的L-TEDCR在相同的反应时间下信噪比提高到15倍。
本发明所开发的L-TEDCR的反应速率提高和背景泄漏低的原因在于:
(1)位于T-结构末端的两个凸起的胸腺嘧啶(T2)促进了结构的稳定性并提高了链置换反应的速度。
(2)在紧凑的空间中保持高浓度的反应物改善了底物的运输。
3、DNS的表征
通过PAGE验证了DNS的自组装。
如图4A所示,单条DNA链(1-9)的迁移速度比9条DNA链组装的DNS(通道10)的迁移速度快,证实了DNS的成功组装。
为了进一步表征DNS的形成过程,采用原子力显微镜(AFM)对其形貌进行了鉴定。如图4B所示,DNS清晰可见。
为了证明所构建的DNS具有较大的表面积,将镶嵌在MB中的双链DNA(DsDNA)捕获到电极表面。如图4C所示,曲线a为与1μM的MB-DNS孵育后的电极产生的电化学信号,曲线b为与1μM的MB-dsDNA孵育后的电极产生的电化学信号,曲线c为空白对照,由图4C可知,MB-dsDNA产生的信号(曲线b)明显小于MB-DNS的信号(曲线a),表明DNS为信号分子提供了许多结合位点。通过无标记负载的电活性分子如MB、DOX和DNAzyme进一步验证了DNS的多功能性。如图4D和4E所示,MB-DNS(图4D中曲线a)、DOX-DNS(图4D中曲线b)和DNAzyme-DNS(图4E中曲线a)在相应的电位中产生不同的电化学信号。DNAzyme可以通过催化过氧化氢产生电化学信号。
这些结果证明所构建的DNS是一种通用的信号放大指示剂。
4、外泌体的表征
在检测Exo-miRNA之前,从SGC7901细胞培养上清液中收集Exosome。
如图5A所示,TEM成像清楚地描述了分离的外泌体,显示出完整的结构和典型的杯状,大小在30-200nm之间。形态与文献(①Zhang,W.;Peng,P.;Kuang,Y.;Y ang,J.;Cao,D.;Y ou,Y.;Shen,K.473 Characterization of exosomes derived from ovarian cancercells and normal ovarian 474 epithelial cells by nanoparticle trackinganalysis.Tumour.Biol.2016,37(3),4213-21.475;②Lee,J.;Kwon,M.H.;Kim,J.A.;Rhee,W.J.Detection of exosome miRNAs 476 using molecular beacons for diagnosingprostate cancer Artif.Cells.Nanomed 477 Biotechnol.2018,46,S52-S63.)报道的外泌体一致。随后,NTA用于定量外泌体并计算颗粒的平均直径。如图5B所示,收集的外泌体的浓度约为1.73×1012颗粒/mL,外泌体的平均大小约为112.6nm。这些实验结果表明,本发明成功地分离出了外泌体。
实施例3
检测外泌体miRNA电化学传感器及其使用条件的优化
为提高电化学传感器的检测灵敏度和特异性,本实施例对实验过程中几个对实验测定影响较大的条件(即反应时间、孵育温度、和DNS浓度)进行了进一步的优化,并对每一个优化条件都由低值到高值分别选取至少五个点进行了一系列实验。
为考察反应时间对本电化学传感器检测结果的影响,本实验采用了不同的反应时间构建电化学传感器。如图6A可见,DPV信号强度随反应时间的变化而变化,当反应时间为60min时,信号强度达到平台期,而后续继续增加反应时间信号强度并不明显增加,说明60min为最佳反应时间。
为考察策略反应温度对外泌体miRNA检测结果的影响,本实验采用了不同的反应温度构建电化学传感器。如图6B可见,随着反应温度的增加,DPV信号强度也随反应温度的升高而增强;当反应温度为37℃时,信号强度达到最高,其后随着温度的升高信号强度不再增加,因此,选择37℃作为自组装反应的最佳时间。
为考察策略中DNS浓度对外泌体miRNA检测结果的影响,本实验采用了不同的DNS浓度构建电化学传感器。如图6C可见,随着DNS浓度的增加,DPV信号强度也随之增强;当DNS浓度为1μM时,信号强度达到最高,其后随着浓度的升高信号强度不再增加,说明捕获探针结合的DNS已到达饱和状态,因此,选择1μM作为反应的最佳浓度。
实施例4
检测外泌体miRNA电化学传感器的性能分析
为了评估检测外泌体miRNA电化学传感器的性能,在实施例3和实施例4所得最优实验条件下,配制了不同浓度的miRNA-21进行了试验分析。
如图7所示,检测实验结果显示,当miRNA-21浓度在0.1fM到1nM之间时,得到的电化学信号与miRNA-21浓度的对数呈线性相关,线性方程为Y=0.7021g C+9.676(R2=0.9928),检测限为0.065fM,线性相关系数为0.9928。将传感器在空白溶液中重复检测3次,并重复检测3次,计算平均值和标准差。
实施例5
制备的检测外泌体miRNA电化学传感器的稳定性和重现性分析
在实施例3和实施例4所得最优实验条件下,采用所构建的电化学生物传感器分别对100pM的miRNA-21样品进行了五个不同批次的检测,每个批次进行三次测定。
如图8A和8B所示,峰值电流值的可变系数约为2.8%,表明所开发的电化学生物传感器具有良好的重现性和稳定性。
综上所述,本发明成功构建了一种基于局域化T型结构熵驱动循环反应和多功能DNA纳米片作为信号标签的电化学传感器,本发明首次将DNS纳米分子和级联T型结构相结合并且用于外泌体miRNA的检测,局域化T型结构熵驱动循环反应设计增加了电化学传感器对靶物质突变的检测灵敏度。本电化学传感器用于检测外泌体miRNA,灵敏度高,反应速度快,稳定性强,重现性好,有望应用于实际样品和临床标本的测定,发展成为具有临床应用价值的传感器。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学
<120> 一种检测外泌体 miRNA的电化学传感器及其制备与应用
<130> PCQYK202230
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA单链P
<400> 1
ccacatacat catattccct tagcttatca gactga 36
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA单链R
<400> 2
cctacgtctc caactaactt acgg 24
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA单链L1
<400> 3
caaactaaac aaccaccgta agttagttgg agacgtagga ggaggtaatg aatg 54
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA单链L2
<400> 4
cattcattac ctccttcaac atcagtctga taagctaagg gttggttgtt tagtttg 57
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 燃烧链F
<400> 5
cctacgtctc caactaactt acggccctta gcttatcaga ctga 44
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶序列T
<400> 6
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 捕获探针
<400> 7
agggaatatg atgtatgtgg tttttsh 27
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链1
<400> 8
tcgaccgagc gtgaattagt gatccggaac tcgcgcaatg aacc 44
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链2
<400> 9
tcagctggcc tatctaagac tgaactcgca ccgccggcat aagctatgcg ctctgccgc 59
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链3
<400> 10
cgagagaagg cttgccaggt tacgttcgta catcgtctga gtt 43
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链4
<400> 11
ggcagcagtt caggccagct ga 22
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链5
<400> 12
ggttcattgc ggagttcagt cttagatgga tctcggatgc aaggccttct ctcg 54
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链6
<400> 13
tcgaccgagc gtgaattagt gatccggaac tcgcgcaatg aacc 44
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链7
<400> 14
ggtgccgagt tccggatcac taattccata gcttatgccg gcaacccaga ctgatgttgc 60
taatcgtgat aggggtaaac tattcattaa cgtgtgtacg aacgtaacct ggcaatggag 120
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链8
<400> 15
tgggtagggc gggttttgcg gcagagcgac gctcggtcg 39
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链9
<400> 16
aactcagacg accatctcct aattttttgg gt 32
Claims (10)
1.一种检测外泌体miRNA的电化学传感器的制备方法,所述电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极,其特征在于,所述工作电极的制备方法包括以下步骤:
(1)金电极表面处理:将裸金电极表面处理干净,备用;
(2)制备扩增产物:将T型结构复合物(Ts)、燃料链F、靶序列T混合,得混合液,孵育,得扩增产物;
(3)将捕获探针固定至处理干净的金电极表面,再将步骤(2)所得的扩增产物滴加到固定有捕获探针的金电极表面,孵育,制得熵驱动的链置换循环放大体系;
(4)将亚甲蓝(MB)与DNA纳米片(DNS)混合反应得到MB-DNS混合物,然后将MB-DNS混合物滴加到步骤(3)所得的金电极表面,孵育,得到DNA纳米片纳米分子放大检测体系,即完成所述工作电极的制备。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述T型结构复合物(Ts)采用DNA单链P、R、L1和L2制备而成。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述DNA单链P、R、L1和L2的摩尔比为1∶1∶1∶1;
和/或,制备T型结构复合物(Ts)时,先将DNA单链P、R、L1和L2分别溶解于DNA杂交液中,再进行混合;
和/或,所述单链P的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
和/或,所述单链R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
和/或,所述单链L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
和/或,所述单链L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述燃烧链F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
和/或,步骤(2)中,所述靶序列T的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;
和/或,步骤(2)中,混合液中靶序列T的终浓度≥65aM,优选为0.1fM-1nM,更优选为100pM;
和/或,步骤(2)中,孵育时间≥30min,优选为30-90min,更优选为60min。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(3)中,所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针,序列如SEQ ID NO.7所示;
和/或,步骤(3)中,所述捕获探针的浓度为100~1000nmol/L,优选为1000nmol/L;
和/或,步骤(3)中,捕获探针固定在金电极表面上后,需采用MCH封闭非特异性吸附位点。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(4)中,DNA纳米片(DNS)的制备方法具体包括:将DNA单链1-9混合,退火得到DNA纳米片(DNS)。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述单链1-9的核苷酸序列如SEQ IDNO.8-SEQ ID NO.16所示。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(3)和步骤(4)中,孵育反应时间为30-90min,优选为60min;
和/或,步骤(3)和步骤(4)中,孵育温度为4-48℃,优选为37℃;
和/或,步骤(2)中,所述T型结构复合物(Ts)末端凸出的胸腺嘧啶核苷数为2个;
和/或,步骤(4)中,所述DNA纳米片(DNS)的浓度为0.5-1.5μM,优选为1μM。
9.一种采用权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的电化学传感器。
10.根据权利要求9所述的电化学传感器在检测外泌体miRNA上的应用。
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