CN110823979B - 一种超敏电化学生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超敏电化学生物传感器及其制备方法和应用，所述传感器包括以碳纤维纸（CFP）为导电基底，所述导电基底上垂直生长连续层层叠加呈波浪形的石墨烯墙（GWs），所述石墨烯墙的骨架和壁上均布沉积有金纳米颗粒（AuNPs），所述金纳米颗粒和DNA四面体捕获探针（DNA‑T）通过Au‑S化学共轭作用，将所述DNA四面体捕获探针固定于CFP/GWs/AuNPs上。本发明制备的电化学传感平台为生物分子探针的固定化提供了超大的表面积和导电网络，其交错纵横的迷宫结构所带来的“纳米限域效应”增强了靶标分子与DNA‑T捕获探针的碰撞机率，协同提升了传感器的检测灵敏度，具有选择性好、灵敏度高、检测限低，且检测范围宽等优点，在环境、化学、生物和医疗检测等领域的有着很好的发展潜力。

Description

一种超敏电化学生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别的涉及一种超敏电化学生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

电化学与生物传感器的发展是目前分析化学研究中最活跃的领域之一。电化学生物传感器是以固定化的生物活性材料(包括核酸、酶、微生物、抗体、细胞等)为敏感元件，以电化学换能器即电化学电极为信号转换器，以电势或电流等为特征检测信号的生物传感器。开辟了分子生物学与电化学分析等学科的研究新领域，为生命科学的研究提供了新技术和新方法，对临床医学以及遗传工程的研究具有深远的意义。

发明专利CN201910624843.1公开了一种适配体电化学传感器的制备方法及应用，制备方法为：首先将丝网印刷碳电极(SPCE)进行活化，随后利用聚(3,4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)(PEDOT:PSS)与超纯水体积比1:1的溶液将石墨烯分散，石墨烯分散液修饰于SPCE表面，在红外灯下干燥得到石墨烯修饰的SPCE(GR/SPCE)；随后采用电沉积法制备纳米金修饰的GR/SPCE(AuNPs/GR/SPCE)，最后通过金硫键共价结合的方式将一端修饰有巯基的适配体修饰于电极表面，得到适配体修饰的AuNPs/GR/SPCE(Apt/AuNPs/GR/SPCE)。但上述方法传感界面的活性比表面积小，探针的固定效率低，导致传感器的灵敏度低。在复杂的实际样本中，对许多超低水平生物分子的超灵敏检测是非常必要的。并且像癌症这样的复杂疾病的特征是多发性的，在临床样本分析中，通常涉及多个靶标分子，单一的靶标检测效率低并且其临床诊断意义较低。所以，需要开发一个高灵敏且具有与普适性的检测平台可用于多种生物标志物的检测。

导电碳纸(CFP)作为由一根根碳纤维相互交织形成的三维网络结构的电极基底提供丰富的离子扩散通道，并且具有大比表面积、高导电性、价格低廉、易于加工等优势，有利于高灵敏的电化学生物传感界面构建。此外，CFP作为电极衬底，其表面特别适合于各种生物活性功能化纳米材料的修饰和生长。研究表明，控制电极的纳米结构和固定生物分子耦合方式对于控制生物传感器的界面特性和提高分析灵敏度至关重要。构建具有大比表面积和不同几何形状的纳米材料以增加活性表面积或探针固定效率，已被证明在提高分析灵敏度方面具有部分效果。然而，大多数不同几何形貌的粉体材料修饰电极基底不可避免的会出现材料不均一和不稳定现象，从而影响了传感电极的稳定性。为了满足可控形貌和活性位点均匀分散的双重要求，以保证最优的电子传输效率，迫切需要在电极表面原位制备均匀可控界面。

石墨烯是一种新型的二维碳纳米材料，具有由单层碳原子紧密堆积而成的二维蜂窝状晶体结构，具有大比表面积(2600m².g^-1)、高导电性、热稳定性、多孔网络结构和良好的生物相容性等显著优势而成为电化学生物传感器构建很有前途的候选材料。三维石墨烯是以二维石墨烯纳米片为基本单元构建的宏观材料。具有柔韧性好、多孔性、高活性表面积、突出的电子传递性能等独特的性质，在能源、环境、传感器和生物分析等领域展现出潜在的应用前景。

许多研究表明，单链核酸探针杂交过程中容易相互缠绕、拥挤效应造成杂交效率降低等严重的影响传感器的灵敏度。DNA纳米技术的发展为这一问题的有效解决带来了光明，其中，三维自组装的DNA四面体纳米结构探针(DNA-T)具有好的机械刚性、空间定向性、可控性、重现性以及精确性，从而减少了传感界面DNA-T分子与靶标分子的杂交的空间位阻，增加其碰撞机率，有利于生物传感界面调控，提高传感器的灵敏度。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种超敏电化学生物传感器及其制备方法和应用，解决现有传感器存在探针的固定数量有限、效率低以及灵敏度低的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种超敏电化学生物传感器，所述传感器包括以碳纤维纸CFP为导电基底，所述导电基底上垂直生长连续层层叠加呈波浪形的石墨烯墙GWs，所述石墨烯墙的骨架和壁上均布沉积有金纳米颗粒AuNPs，所述金纳米颗粒和DNA四面体捕获探针通过Au-S化学共轭作用，将所述DNA四面体捕获探针固定于CFP/GWs/AuNPs电极上；所述DNA四面体捕获探针由四条交叉相互互补的核酸双链构成以及四面体顶角延伸出一段能与目标物特异性识别的发夹结构序列。所述传感器的传感电极呈三维纳米迷宫结构。

本发明还提供了上述超敏电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将碳纤维纸清洗并干燥，然后放入真空管式炉中，在甲烷和氢气的混合气体下进行射频增强等离子体化学气相沉积，使CFP上垂直生长连续层层叠加的石墨烯墙，沉积结束后，所述管式炉在氢气气氛下降至室温，即得到CFP/GWs电极；

2)将步骤1)得到的CFP/GWs电极浸泡于含有HAuCl₄的酸性溶液中，采用计时电流法进行电沉积，沉积结束后，用去离子水清洗电极数次，即得到CFP/GWs/AuNPs传感电极；

3)将步骤2)得到的CFP/GWs/AuNPs传感电极置于四面体DNA捕获探针溶液中，于4℃下过夜孵育，或25～40℃下孵育1～3h，再用PBS缓冲液清洗干净，即得到所述超敏电化学生物传感器。

作为优选的，所述射频增强等离子体化学气相沉积过程中系统压力为40Pa，功率为200W，沉积生长时间为30～60min。

作为优选的，步骤1)在进行射频增强等离子体化学气相沉积前还包括在氢气恒流下将管式炉的温度升至750℃，用氢等离子体轰击CFP表面5～10min，用于去除CFP基板表面的氧气和杂质。

作为优选的，所述混合气体中甲烷和氢气的的体积比为3:2。

作为优选的，所述计时电流法的工作电位为-0.6～0V，电沉积时间为50～500s。

作为优选的，所述酸性溶液中HAuCl₄的浓度为1～5mM；所述酸性溶液为H₂SO₄和Na₂SO₄的水溶液。

作为优选的，所述四面体DNA探针溶液的浓度为0.4～1μM。

本发明还提供了上述超敏电化学传感器同时检测一种或多种miRNA的方法，包括以下步骤：

S1：根据各待检测目标物miRNA的序列自组装设计相应不同的DNA四面体捕获探针，然后固定于CFP/GWs/AuNPs电极上，即得到超敏电化学生物传感器；

S2：将待检测目标物miRNA溶液和信号探针混合形成反应体系，再将步骤1所述的超敏电化学生物传感器的电极侵入反应体系中反应；所述信号探针具有与DNA四面体捕获探针上的发夹结构序列互补结合序列，并且标记有电活性物质；

S3：通过所述信号探针带有标记物的工作电极输出电化学信号，再通过所述电化学信号对所述目标物miRNA的浓度进行表征。

作为优选的，所述目标物miRNA为miR-155时，所述DNA四面体捕获探针由序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的4条DNA单链通过自组装形成；所述信号探针具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列。

作为优选的，所述为目标物miRNA为miRNA-21时，所述DNA四面体捕获探针由序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8所示的4条DNA单链通过自组装形成；所述信号探针具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明制备的三维纳米迷宫结构的CFP/GWs/AuNPs传感电极(CAM电极)具有高导电性，并且原位垂直生长的石墨烯墙提供了巨大的活性比表面积，为均匀负载了大量的AuNPs提供了机构基础，进一步有利于DNA-Ts的固定；可控的三维DNA-T捕获探针保证了探针阵列在CAM电极表面的刚性空间构象和探针的取向，控制探针的密度，提高了溶液条件下靶标与捕获探针杂交的效率；CAM电极的三维纳米迷宫结构所产生的局部约束效应增加微量靶标分子在其中的碰撞机率，从而大大提高了目标物与CAM上捕获探针的杂交效率。实现了对靶标分子检测识别的高灵敏度。

2、本发明通过在交错排列的碳纤维CFP上原位垂直生长致密连续的石墨烯墙，并将AuNPs电沉积在CFP/GWs的片层和骨架上，进一步将具有刚性空间构象且可控自组装的巯基修饰DNA-T探针通过Au-S固定在传感界面上，开发了一种具有独特三维迷宫结构的CAM生物传感平台，四面体结构具有较好的机械刚性和探针定向性，以保证生物探针的可控排列，具有良好的重现性和稳定性。通过RF-PECVD法将石墨烯垂直于表面的高电场形成了垂直方向石墨烯独特的结构，具有更高的比表面积可负载更多的纳米催化颗粒，更锋利的边缘和更多的固定探针反应活性位点等，此过程无需任何金属催化剂，并且简单可控，这极大地保证了传感电极的重现性和稳定性。并且垂直生长形成的CFP/GWs具有可弯曲性，易操作。另外，三维石墨烯的形貌和微观结构可以通过H₂和CH₄气体比例、等离子体功率、生长温度和生长时间进行调整，具有可控性、可重复性和稳定性，有利于大规模的应用于电化学生物传感器构建。

3、本发明制备的CAM传感平台为生物分子探针的固定化提供了超大的表面积和导电网络，其交错纵横的迷宫结构所带来的“纳米限域效应”增强了靶标分子与DNA-T探针的碰撞机率，协同提升了传感器的检测灵敏度，实现了对miR-155单独检测，以及miR-155和miR-21高灵敏的同时检测分析，获得了0.1aM到100nM的线性范围内的0.023aM(23zM)的超低检测限，对miRNA实现了zM级别的检测。所制备的CAM生物传感平台对临床血清样本中miR-155和miR-21分析检测结果与qRT-PCR具有良好的一致性，在临床诊断分析中的应用潜力，具有选择性好、灵敏度高、检测限低，且检测范围宽等优点。此外，该具有超敏感性的CAM平台仅需将DNA-T顶端延伸序列简单替换成各种感兴趣的靶标生物分子探针，就可应用于多种生物分子(如核酸、蛋白、小分子、包外囊泡甚至细胞等)的分析检测，本发明在环境、化学、生物和医疗检测等领域的有着很好的发展潜力。

4、本发明在检测核酸时所设计的DNA四面体捕获探针，可特异性捕获靶标，并与信号探针发生链置换反应，从而实现检测信号的放大。

附图说明

图1为裸CFP、CFP/GWs和CFP/GWs/AuNPs的SEM图和3D模型图；A～C为裸CFP，D～F为CFP/GWs，G～I为CFP/GWs/AuNPs。

图2为不同沉积时间制备的CFP/GWs电极的拉曼光谱图。

图3为CFP/GWs和CFP/GWs/AuNPs的XRD图；a为CFP/GWs；b为CFP/GWs/AuNPs。

图4为CFP/GWs/AuNPs电极的XPS表征；A为全谱图；B为C1s高分辨图；C为Au 4f高分辨图。

图5为不同电极的电化学性能研究实验；A为不同电极在N₂饱和的1.0M H₂SO₄溶液中的CV曲线；B和D分别为不同电极在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中的CV曲线和EIS图；C为不同电极的有效面积柱形图；a曲线为AuE、b曲线为GCE/AuNPs、c曲线为CFP/AuNPs和d曲线为CFP/GWs/AuNPs。

图6为DNA四面体纳米探针(DNA-T)组装示意图。

图7为原子力显微镜(AFM)表征DNA-T的大小和形态，左是顶视图，右是侧视图，箭头处为DNA-T放大图。

图8为本发明传感电极CAM对miR-155和双靶标(miR-155和miR-21)的传感检测的原理示意图。

图9为不同DNA-T复合物的SWV响应曲线；a曲线为CAM/DNA-T-H1、b曲线为CAM/DNA-T H1/H2、c曲线为CAM/H1/miR-155/H2和d曲线为CAM/DNA-T H1/miR-155/H2。

图10为电化学生物传感器CAM对不同浓度靶标分子检测的SWV曲线及其校准曲线。

图11为电化学生物传感器CAM的选择性和重现性的实验图。

图12为CAM传感电极和qRT-PCR对检测样品的检测分析；A为样本中的miR-155和miR-21的表达丰度；B为检测结果的相关性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。需要说明的是，以下各实施例中所述试剂和仪器无特别说明均为普通市售，以下实施例中采用场发射电子显微镜(FESEM)用来表征所制备电极的表面形态和尺寸，并用能量色散X射线光谱仪(EDS)对其化学成分及分布进行了表征。拉曼光谱(Raman)用于鉴定CFP/GWs/AuNPs传感电极上石墨烯的本质。X射线衍射仪(XRD，采用Cu Kα特征x射线)用于表征所制备电极的晶体结构，得到衍射图谱。采用X射线光电子能谱(XPS，Al Kα激发光源)对所制备样品的化学组分进行了确定。所有的电化学实验由CHI 760E电化学工作站在室温下进行测试，以传统的三电极系统，其中铂丝电极(Pt)为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，和修饰的CFP电极为工作电极。所制备传感电极的电化学行为表征在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中测试，其中CV的测试参数：工作电压范围为-0.2～0.6V，扫描速率为50mV s-1；EIS的测试参数：频率范围为10-1～105Hz，振幅为0.005V。CFP/GWs/AuNPs电极修饰DNA四面体纳米探针(DNA-T)对microRNA进行传感检测时，方波伏安法(SWV)实验在0.01M pH 7.4的PBS缓冲液中进行测试。SWV的测试参数：工作电压范围为-0.6～+0.6V，振幅为0.025V。所涉及的寡核苷酸链均由中国上海生工生物有限公司合成，并经过高效液相色谱法纯化(HPLC)方式纯化。

实施例1

一种电化学生物传感器CFP/GWs/AuNPs的制备方法，包括以下步骤：

1)将碳纤维纸(CFP)依次浸泡在丙酮和乙醇中，超声10min，去除表面有机杂质，然后用去离子水清洗数次并烘干备用；

2)将步骤1)得到的CFP放入真空管式炉的中心，在氢气恒流下将管式炉的温度升至750℃，然后用氢等离子体轰击CFP表面10min，以去除CFP基板表面的氧气和杂质。然后,按照体积比为3：2的甲烷和氢气的混合气体，参数如下：系统压力为40Pa，功率为200W，生长时间分别为30min、45min和60min，使CFP上垂直生长连续层层叠加的石墨烯墙，再将管式炉温度在H₂保护下降至室温，得到的产物即为CFP/GWs电极；

3)将步骤2)得到的CFP/GWs电极浸泡于5mL含有2mM HAuCl₄溶液的0.01M H₂SO₄和Na₂SO₄的混合溶液中，采用计时电流法(i-t)在-0.2V的工作电位下电沉积200s，沉积结束后，用去离子水清洗电极数次，即得到CFP/GWs/AuNPs传感电极。

1、将裸CFP和本实施例制备的CFP/GWs及CFP/GWs/AuNPs在扫描电镜下进行观察，结果如图1所示。

从图中可以看出，GWs连续垂直生长在CFP光滑的纤维上(图1D和图1E)，与易堆叠和团聚的粉体石墨烯纳米片相比，采用RF-PECVD原位生长的GWs具有三维多孔结构且均匀可控等优点，其左侧的3D模型图对所形成的3D迷宫结构进行了模拟，该结构可以有效增加电极的比表面积，有利于AuNPs纳米颗粒的负载，并且其丰富的溶液扩散通道可以大大提高电子传递效率。通过CFP(图1C)和CFP/GWs(图1F)截面图对比，可以看到，GWs在裸CFP的进行了60min生长以后得到了其平均厚度为1.13±0.12μm。接下来，CFP/GWs的骨架和壁上均匀的覆盖了大量球形的AuNPs(图1G和图1H)，其平均粒径大小为25±10nm，均匀分布的AuNPs有利于DNA-Ts生物分子的可控固定。EDS面扫结果分析表明(图1I)，整个CFP/GWs/AuNPs电极中只存在C和Au两种元素，且均匀分布，进一步验证了所需电极制备成功。并且本实施例所制备的CFP/GWs/AuNPs传感电极，具有可弯曲性、轻盈、且易于切割和加工成不同形状，可以满足不同的实验要求等优点。

2、采用Raman研究了本实施例不同沉积时间所制备电极的分子结构分析，结果如图2所示。

如图中可以看出，GWs直接生长在CFP上30min、45min和60min的拉曼光谱(图2A)。其中，出现在～2697cm^-1和～1585cm^-1的两个突出峰分别表示石墨烯的2D峰和G峰，其比值I_2D/I_G<1表示生长的GWs为少层石墨烯，在～1346cm^-1处的具有较高强度的D峰是由于GWs中结构边缘缺陷而产生，这非常有利于AuNPs的沉积。随着生长时间从30min到60min过程中,I_2D/I_G的比值从0.37增加到0.69，而I_D/I_G的比值从1.67下降到1.29，与生长时间呈现高度的线性相关(图2B)。

3、采用XRD和XPS研究了本实施例所制备电极的晶体结构和化学组成，结果如图3和图4所示。

从图3中可以看出，位于26.3°处的强衍射峰为GWs(002)晶面特征峰，而位于38.3°、44.6°、64.8°和77.8°四个特征衍射峰(插图)分别对应于(111)、(200)、(220)和(311)晶面，表明该AuNPs为面心立方(fcc)结构。

从图4可以看出，CFP/GWs/AuNPs电极的C1s和Au 4f的2个特征峰明显，其中C1s中284.4eV处的强峰可归因于sp²杂化的C＝C/C-C键，结合能在285.1eV处的峰可能是石墨烯缺陷引起的sp³杂化，而结合能位于286.5eV处的弱峰对应于C-O峰。83.9eV和87.6eV结合能分别归属于Au 4f的Au 4f_7/2和Au 4f_5/2化学结合态，表明AuNPs已成功电沉积在CFP/GWs上，进一步证明了CAM(CFP/GWs/AuNPs)传感电极的成功制备。

4、采用循环伏安法(CV)研究了四种不同电极在N₂饱和的1.0M H₂SO₄溶液中的CV曲线，其扫描电位范围为0.2V～1.6V，扫描速率为10mVs^-1，确定Au在所制备电极上的活性区域，结果如图5A所示。

从图中可以看出，AuE(a)、GCE/AuNPs(b)、CFP/AuNPs(c)和CFP/GWs/AuNPs(d)四种修饰了AuNPs的电极均在0.9V处出现了Au的还原特征峰。其中，CFP/GWs/AuNPs在+0.9V处的电流信号明显大于其他三个电极。根据Au电极表面吸附氧形成AuO单分子层所需的双电层电荷系数-386μC cm^-2计算四种不同电极的Au氧化还原反应活性有效面积，分别计算得到5.4mm²(AuE)、13.13mm²(GCE/AuNPs)、162.8mm²(CFP/AuNPs)和287.8mm²(CFP/GWs/AuNPs)，其中，CFP/GWs/AuNPs对比AuE的Au氧化还原反应活性有效面积增加了53倍，表明该三维多孔蓬松迷宫结构的CFP/GWs，有利于AuNPs的大量沉积。

5、对四种不同电极在含0.1M KCl的5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-(1:1)溶液中CV和交流阻抗(EIS)测试，探索其电化学性能，结果如图5所示。

从图5B中看出AuE(a)、GCE/AuNPs(b)、CFP/AuNPs(c)和CFP/GWs/AuNPs(d)四种不同的电极在+0.31V和+0.15V分别观察到一对清晰的氧化还原峰，这属于典型的Fe^2+/3+氧化还原特征峰。CFP/AuNPs和CFP/GWs/AuNPs的响应显著高于AuE和GCE/AuNPs，尤其是CFP/GWs/AuNPs电极的电流信号比AuE高约55倍。根据Randled-Sevcik方程计算了四种不同电极的电化学有效活性面积:

式中：Ip是峰值电流(A)，n是电子的数量(n＝1)，A是指电极的有效面积(cm²)，D是扩散系数((6.7±0.02)×10^-6cm² s^-1)，υ为扫描速率(V s^-1)，C是氧化还原反应物的浓度(5×10^-6mol cm^-3)。

由上式得到所制备CFP/GWs/AuNPs电极的电活性有效面积为1.7128cm²，是GCE/AuNPs(0.0987cm²)的17倍，是AuE电极(0.0312cm²)的55倍(图5C)。

图5D为四种电极的Nyquist图，其高频时半圆直径表示电子传递电阻(Rct)。在四个电极中，AuE的电阻Rct最大约为592Ω，然后，GCE/AuNPs(b)、CFP/AuNPs(c)和CFP/GWs/AuNPs(d)的Rct依次减小，其中CFP/GWs/AuNPs的高频处的几乎为一条直线，说明该CAM电极具有极其优越的导电性。EIS结果与CV观察到的电流信号结果变化一致。结果表明，具有优异导电性的三维多孔蓬松纳米迷宫结构CFP/GW/AuNPs电极(CAM电极)可以有效改善电化学性能，为AuNPs的沉积提供了巨大的有效面积，有利于生物分子探针的固定。

实施例2

一种超敏电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)将碳纤维纸(CFP)依次浸泡在丙酮和乙醇中，超声10min，去除表面有机杂质，然后用去离子水清洗数次并烘干备用；

2)将步骤1)得到的CFP放入真空管式炉的中心，在氢气恒流下将管式炉的温度升至750℃，然后用氢等离子体轰击CFP表面10min，以去除CFP基板表面的氧气和杂质。然后,按照体积比为3：2的甲烷和氢气的混合气体，参数如下：系统压力为40Pa，功率为200W，生长时间为45min，使CFP上垂直生长连续层层叠加的石墨烯墙，再将管式炉温度在H₂保护下降至室温，得到的产物即为CFP/GWs电极；

3)将步骤2)得到的CFP/GWs电极浸泡于5mL含有2mM HAuCl₄溶液的0.01M H₂SO₄和Na₂SO₄的混合溶液中，采用计时电流法(i-t)在-0.2V的工作电位下电沉积200s，沉积结束后，用去离子水清洗电极数次，即得到CFP/GWs/AuNPs传感电极。

4)根据如SEQ ID NO.5所示miR-155或SEQ ID NO.7所示miR-21的序列设计了DNA四面体捕获探针的4条单链DNA(B链、C链、D链和A-H1链(A-H3链))，按1:1:1:1的摩尔比例混合于TM Buffer(20mM Tris、50mM MgCl₂、pH 8.0)中，使混合溶液中每条单链的浓度为1μM。将配好的样品放入PCR仪的管槽中，95℃持续5min，然后迅速降温冷却至4℃，并维持10min以上，即可获得所需的DNA四面体捕获探针(DNA-T-H1或DNA-T-H3)。

5)将步骤3)得到的CFP/GWs/AuNPs传感电极置于浓度为0.4μM四面体DNA捕获探针(DNA-T-H1或DNA-T-H3)溶液中，于室温下自由组装5～12小时；去离子水中浸泡清洗1小时，得到能特异性识别miR-155或miR-21的电化学生物传感器。

所述DNT四面体捕获探针中各链的序列如下：

B链序列：

5’-SH-(CH₂)₆-ACGAGCGAGTTGATGTGATGCAAGCTGAATGCGAGGGTCCT-3’；

C链序列：

5’-SH-(CH₂)₆-TCAACTCGCTCGTAACTACACTGTGCAATACTCTGGTGACC-3’；

D链序列：

5’-SH-(CH₂)₆-TCTGACGTAGTGTATGCACAGTGTAGTAAGGACCCTCGCAT-3’；

A-H1序列：

5’-ACCCCTATCACGATTAGCATTAACCATGTGTAGATAATGCTAATCGTGTTTTTTTTTTACACTACGTCAGAACAGCTTGCATCACTGGTCACCAGAGTA-3’；

A-H3序列：

5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGCCATGTGTAGACTAGCTTATCAGATTTTTTTTTTACACTACGTCAGAACAGCTTGCATCACTGGTCACCAGAGTA-3’；

实施例3

1)将碳纤维纸(CFP)依次浸泡在丙酮和乙醇中，超声10min，去除表面有机杂质，然后用去离子水清洗数次并烘干备用；

2)将步骤1)得到的CFP放入真空管式炉的中心，在氢气恒流下将管式炉的温度升至750℃，然后用氢等离子体轰击CFP表面10min，以去除CFP基板表面的氧气和杂质。然后,按照体积比为3：2的甲烷和氢气的混合气体，参数如下：系统压力为40Pa，功率为200W，生长时间为45min，使CFP上垂直生长连续层层叠加的石墨烯墙，再将管式炉温度在H2保护下降至室温，得到的产物即为CFP/GWs电极；

3)将步骤2)得到的CFP/GWs电极浸泡于5mL含有2mM HAuCl4溶液的0.01M H₂SO₄和Na₂SO₄的混合溶液中，采用计时电流法(i-t)在-0.2V的工作电位下电沉积200s，沉积结束后，用去离子水清洗电极数次，即得到CFP/GWs/AuNPs传感电极。

4)将步骤3)得到的CFP/GWs/AuNPs传感电极置于浓度为0.4μM四面体DNA捕获探针(DNA-T-H1和DNA-T-H3)溶液中，于室温下自由组装5～12小时；去离子水中浸泡清洗1小时，得到能同时特异性识别miR-21和miR-155的电化学生物传感器。

采用AFM考察本发明传感器DNA四面体结构，首先将平整的金片电极用丙酮、乙醇分别超声清洗5min除去表面杂质，再用去离子水清洗数次后，氮气吹干。然后，将10μL 0.1μMDNA-T(按照上述步骤组装好)滴加到上述金片电极表面，1h后再冲洗3次，采用原子力显微镜(AFM·IPC-208B)在88nm×88nm扫描范围内对DNA-T的组装进行表征。

该DNA四面体纳米探针(DNA-T)如图6所示，由由A链、B链、C链和D链四条交叉相互互补的核酸双链构成以及四面体顶角延伸出一段能与目标物特异性识别的发夹结构序列。从图7中的俯视图(图7左)和侧视图(图7右)图像可以观察到其类似于四面体形貌，制备的DNA-T捕获探针的平均高度约为4.1nm，这与我们理论计算的3.98nm相符。

综上，证实了DNA-T的成功组装，并且DNA-T可以通过Au-S键高度有序锚定在CAM电极上，该四面体结构的存在保证了所有固定的探针都以纳米尺度距离上均匀的分布在CAM电极上，从而降低了阻碍效应，保持了空间方向，从而提高了生物分子识别能力。

二、超敏电化学生物传感器用于microRNA的传感检测。

检测原理：本发明超敏电化学生物传感器上的DNA四面体捕获探针DNA-T-H1的发夹结构H1在目标miRNA(miR-155)存在的条件下，H1发夹结构打开，并捕获miR-155，而标记有电活性物质亚甲基蓝(MB)的信号探针(H2-MB)与H1上的互补序列杂交，发生链置换反应形成H1:H2双链。随后，释放目标miR-155又进入下一个循环，N个周期后，大量标记在H2上的MB分子接近CAM电极表面，导致MB电化学信号显著增加，通过采集MB的电化学特征峰信号，从而实现miR-155精准定量检测(图8A)。基于同样的设计原理，设计了DNA-T-H1和DNA-T-H3两个捕获探针，采集亚甲基蓝(MB)和二茂铁(Fc)的信号用于miR-155和miR-21的同时定量检测(图8B)。

采用方波伏安法(SWV)对CAM传感平台在0.01M PBS缓冲溶液中对miR-155的传感检测进行了可行性分析，其扫描电位范围为：-0.5V～0V，结果图9所示。

从图中可以看出，在没有靶标miR-155存在的两条SWV响应曲线(曲线a和b)上没有任何出现MB的特征峰，只有在靶标miR-155存在情况下，才能触发链置换反应，形成DNA-T-H1:H2杂交产物，在-0.28V处(曲线d)出现了显著的MB特征峰，并且该特征峰信号明显高于(约～2.5倍)无四面体结构所形成的H1:H2杂交产物(曲线c)所产生的的电流信号(ΔI:53.4μA vs 21.2μA)。这一结果也验证了该DNA-Ts结构能够提供稳定刚性支架，使得位于顶点的核酸发夹探针能够定向的、有序的在四面体结构顶端，均匀可控的固定CAM传感表面，减小了探针杂交过程中的空间位阻，从而提高生物分子杂交效率。

1、将实施例2构建的CAM/DNA-T传感平台置于不同浓度的miR-155和信号探针H2-MB的溶液中，采用SWV考察不同溶液中电流响应变化，其中H2-MB为H1上的互补序列，并标记有电活性物质亚甲基蓝(MB)，结果如图10A所示。

从图中可以看出，随着靶标物质miR-155浓度的递增(从a到h：0aM、0.1aM、1aM、100aM、10fM、1pM、100pM和10nM)，其MB的特征峰的SWV响应信号也逐渐增大。根据其浓度和电流信号的关系进行线性拟合，在0.1aM～10nM范围内，其线性拟合方程为：ΔI(μA)＝4.683logC_miR-155(M)+98.809(R²＝0.998)，其中ΔI为峰值电流差，C为miR-155浓度得(图10C)。其检测限(LOD)通过计算为0.023aM(23zM)(S/N＝3)，如此低的检测限在目前报道的同类型电化学传感器中尚未报道。

2、CFP/GWs/AuNPs传感电极用于miR-155和miR-21的同时定量检测

将实施例3构建的CAM/DNA-T传感平台置于不同浓度的miR-155和miR-21及其发夹探针H2-MB和H4-Fc的溶液中，分别采集电活性材料MB(-0.28V)和Fc(0.2V)的电流信号，用于miR-155和miR-21的同时定量检测，结果如图10B。

其中，miR-155序列：

5’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3’；

H2-MB序列：

5’-MB-ATTAGCATTATCTACACATGGTTAATGCTAATCGTGATCCATGTGTAGAT-3’

miR-21序列：

5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’；

H4-Fc序列：

5’-Fc-GATAAGCTAGTCTACACATGGCTAGCTTATCACATGTGTAGAC-3’；

从图中可以看出，当miR-155和miR-21浓度增加时，其SWV峰值电流随着miRNA的浓度增加而增大。在1aM～10nM的浓度范围内，分别对其浓度与电流信号进行线性拟合，得到miR-155的线性回归方程为：ΔI(μA)＝5.88logC_miR-155(M)+108.4(R²＝0.986)(图10C)，miR-21的线性回归方程为：ΔI(μA)＝3.46logC_miR-155(M)+66.8(R²＝0.991)(图10D)，这两条校准曲线都显示了良好的线性关系，其LODs分别计算得到0.34aM和0.42aM(S/N＝3)。值得注意的是，在如此低的浓度下进行双靶标的同时检测是很难实现的。

3、CFP/GWs/AuNPs传感电极的选择性和重现性

将实施例3制备的CAM传感电极分别置于浓度为100nM的单碱基不匹配的miRNAs(SM)：miR-21-1mis和miR-155-1mis；三碱基不匹配的miRNAs(TM)：miR-21-3mis和miR-155-3mis；完全不匹配的miRNAs：miR-16和let-7a作为干扰物，及其浓度为10nM互补靶标miR-155和miR-21(CM)，进行杂交孵育，所有实验至少重复三次，结果如图11A所示。

所述干扰物的序列若下：

miR-21-1mis：

5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUCA-3’；

miR-155-1mis：

5’-UAGCUUAUCAGACUCAUCUUCA-3’；

miR-21-3mis：

5’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGCU-3’；

miR-155-3mis：

5’-UUAAUGCUAAUCGUCAUACGGCU-3’；

miR-16：

5’-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’；

let-7a：

5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’；

其中，下划线处为不匹配的碱基。

从图中可以看出，本发明的传感电极只有与互补靶标杂交后，其峰值电流变化(ΔI)达到最大值，其它任何不匹配干扰物仅产生了很弱电流信号，几乎可以忽略不计，该实验结果说明所提出的CAM传感电极在识别miRNA方面具有很高的特异性。

取10片本发明不同批次制备的CAM传感电极，测试浓度为10nM miRNAs(miR-155和miR-21)的SWV电流响应，结果如图11B所示。

从图中可以得到，不同的传感电极对miR-155和miR-21的相对标准偏差(RSD)分别为3.03％和3.29％，表明所制备的CAM传感电极具有较满意的重现性。

4、采用CAM传感电极对实际临床样本中的miRNA进行传感检测，并与qRT-PCR检测结果相比较来评价所制备电极的可行性和可靠性。

临床样本为30例来自重庆大学附属肿瘤医院的临床血液样本(包括10例非小细胞肺癌患者、10例乳腺癌患者和10例健康个体(阴性对照))正常受试者来源于正常体检人员，这项研究得到了伦理委员会的批准。所有外周血静脉血标本收集于BD真空管中，然后在1500rpm下离心20min，将血清立即分离并均分成2份，并于-80℃保存，避免反复冻融。分别用CAM传感电极和qRT-PCR进行检测(引物序列具体见表1)，两种方法得到数据结果进行比较和分析，结果如图12所示。

表1 qRT-PCR实验所用的核酸序列

从图12A中可以看出，通过CAM传感电极和qRT-PCR都检测到miR-155在血液样本中表达丰度依次为乳腺癌患者>非小细胞肺癌患者>阴性对照，而miR-21的表达丰度顺序为：非小细胞肺癌>乳腺癌患者>健康人群，与文献中报道结果相符。另外，本发明所构建的CAM传感器与经典qRT-PCR对同一血液样本中的miRNAs进行定量检测，结果如图12B所示，两种方法用于对于非小细胞肺癌患者和乳腺癌患者样本的具有相同的鉴别能力，并且所提出检测方法与qRT-PCR具有良好的一致性(R²＝0.984和R²＝0.979)，表明所构建的CAM电极在临床检测领域具有良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆大学；

<120> 一种超敏电化学生物传感器及其制备方法和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgagcgagt tgatgtgatg caagctgaat gcgagggtcc t 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcaactcgct cgtaactaca ctgtgcaata ctctggtgac c 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tctgacgtag tgtatgcaca gtgtagtaag gaccctcgca t 41

<210> 4

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acccctatca cgattagcat taaccatgtg tagataatgc taatcgtgtt ttttttttac 60

actacgtcag aacagcttgc atcactggtc accagagta 99

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attagcatta tctacacatg gttaatgcta atcgtgatcc atgtgtagat 50

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 8

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcaacatcag tctgataagc tagccatgtg tagactagct tatcagattt tttttttaca 60

ctacgtcaga acagcttgca tcactggtca ccagagta 98

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gataagctag tctacacatg gctagcttat cacatgtgta gac 43

<210> 10

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

uagcuuauca gacugauguu ca 22

<210> 11

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

uagcuuauca gacucaucuu ca 22

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

uuaaugcuaa ucgugauagg gcu 23

<210> 13

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

uuaaugcuaa ucgucauacg gcu 23

<210> 14

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

uagcagcacg uaaauauugg cg 22

<210> 15

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

ugagguagua gguuguauag uu 22

Claims (4)

1.一种利用超敏电化学生物传感器检测miRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：根据待检测目标物miRNA的序列自组装设计相应不同的DNA四面体捕获探针，然后固定于CFP/GWs/AuNPs传感电极上，即得到超敏电化学生物传感器；

S2：将待检测目标物miRNA溶液和信号探针混合形成反应体系，再将S1所述的超敏电化学生物传感器的电极侵入反应体系中反应；所述信号探针具有与DNA四面体捕获探针上的发夹结构序列互补结合序列，并且标记有电活性物质；

S3：通过所述信号探针带有标记物的工作电极输出电化学信号，再通过所述电化学信号对所述目标物miRNA的浓度进行表征；

所述超敏电化学生物传感器包括以碳纤维纸CFP为导电基底，导电基底上垂直生长连续层层叠加呈波浪形的石墨烯墙GWs，所述石墨烯墙的骨架和壁上均布沉积有金纳米颗粒AuNPs，所述金纳米颗粒和DNA四面体捕获探针通过Au-S化学共轭作用，将所述DNA四面体捕获探针固定于CFP/GWs/AuNPs传感电极上；所述DNA四面体捕获探针由四条交叉相互互补的核酸双链构成以及四面体顶角延伸出一段能与目标物特异性识别的发夹结构序列；

其中，所述超敏电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：1）将碳纤维纸清洗并干燥，然后放入真空管式炉中，在甲烷和氢气的混合气体下进行射频增强等离子体化学气相沉积，使CFP上垂直生长连续层层叠加的石墨烯墙，沉积结束后，所述管式炉在氢气气氛下降至室温，即得到CFP/GWs电极；

2）将步骤1）得到的CFP/GWs电极浸泡于含有HAuCl₄的酸性溶液中，采用计时电流法进行电沉积，沉积结束后，用去离子水清洗电极数次，即得到CFP/GWs/AuNPs传感电极；

3）将步骤2）得到的CFP/GWs/AuNPs传感电极置于四面体DNA捕获探针溶液中，于4℃下过夜孵育，或25~40℃下孵育1~3 h，再用PBS缓冲液清洗干净，即得到所述超敏电化学生物传感器。

2.根据权利要求1所述利用超敏电化学生物传感器检测miRNA的方法，其特征在于，所述CFP/GWs/AuNPs传感电极的制备方法，包括以下步骤：

将碳纤维纸（CFP）依次浸泡在丙酮和乙醇中，超声10min，去除表面有机杂质，然后用去离子水清洗数次并烘干备用；

将步骤1）得到的CFP放入真空管式炉的中心，在氢气恒流下将管式炉的温度升至750℃，然后用氢等离子体轰击CFP表面10 min，以去除CFP基板表面的氧气和杂质；然后, 按照体积比为3：2的甲烷和氢气的混合气体，参数如下：系统压力为40 Pa，功率为200 W，生长时间分别为30 min、45 min和60 min，使CFP上垂直生长连续层层叠加的石墨烯墙，再将管式炉温度在H₂保护下降至室温，得到的产物即为CFP/GWs电极；

3）将步骤2）得到的CFP/GWs电极浸泡于5 mL含有2 mM HAuCl₄溶液的 0.01 M H₂SO₄和Na₂SO₄的混合溶液中，采用计时电流法（i-t）在-0.2 V的工作电位下电沉积200 s，沉积结束后，用去离子水清洗电极数次，即得到CFP/GWs/AuNPs传感电极。

3.根据权利要求1所述利用超敏电化学生物传感器检测miRNA的方法，其特征在于，所述目标物miRNA为miR-155时，所述DNA四面体捕获探针由序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的4条DNA单链通过自组装形成；所述信号探针具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述利用超敏电化学生物传感器检测miRNA的方法，其特征在于，所述目标物miRNA为miRNA-21时，所述DNA四面体捕获探针由序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8所示的4条DNA单链通过自组装形成；所述信号探针具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。

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