CN113960136B - 一种动态范围可调的伏马菌素b1电化学传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

一种动态范围可调的伏马菌素b1电化学传感器的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器制备方法及其应用。具体通过单链DNA自组装制备DNA四面体纳米结构，通过控制碱基数目调整四面体尺寸，实现探针在电极表面可控组装，提高检测灵敏度；同时利用FB1适配体作为消耗剂，通过调控适配体浓度进而实现对目标物的定制化检测。本发明中，引入FB1的适配体，实现目标物‑适配体特异性识别，从而提高电化学传感器用于FB1检测的特异性；所构建的电化学适配体传感器用于FB1的检测，灵敏度高、选择性好，其检测范围跨越7个数量级，检测限是目前所报道的检测FB1的传感器中最低的，突破了目前高浓度检测的限制，取得了显著的成果。

Description

一种动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器的制备方法及 其应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器制备方法及其应用。
背景技术
伏马菌素(Fumonisin，FB)是由串珠镰刀菌产生、由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物。目前发现的伏马菌素有FA1、FA2、FB1、FB2等11种，其中FB1是其主要组分，同时也是导致伏马菌素毒性作用的主要组分。伏马菌素具有一定的植物毒性，可干扰植物的正常生理代谢功能，引起植物细胞程序性死亡。其次伏马菌素会引起家畜急性中毒，对肝、肾、肺和神经系统均有毒害，具有潜在的致癌性，是目前国际上最受关注的真菌毒素之一。因此，对FB1的高灵敏、高选择性分析具有重要意义。
目前FB1的检测方法中，高效液相色谱串联质谱法具有精准度高、灵敏度高的特点，然而预处理繁琐且依赖专业精密仪器设备；免疫层析法具有检测速度快、操作简单等优点，但假阳性概率较高；酶联免疫法将抗原与抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用结合起来，具备灵敏度高和特异性强的优点，但复杂基质对其准确性存在干扰；比色法具有操作简便的优点，但其灵敏度有待提高。与以上方法相比，电化学法通过电信号强度变化实现对被测物的检测，具有操作简单、灵敏度高的特点，且基于适配体的电化学传感器具有特异性强的优点，近年来受到广泛关注。
然而由于适配体电化学信号与探针的动态变化密切相关，传感器的性能很大程度上依赖于电极上自组装单层的性质。电化学传感器界面自组装层一般由DNA探针和封闭剂组成。 DNA探针密度是目标物捕获效率的控制因素，也是目标物与探针杂交动力学的控制因素。另一个关键挑战是动态范围不可调控，这降低了电化学生物传感器在监测等应用中的效用。
发明内容
本发明旨在利用四面体结构探针实现探针在电极表面的有序组装，提高检测灵敏度；利用辅助适配体作为消耗剂，实现对传感器动态范围的调控，构建新型电化学适配体传感器，最终实现FB1的高灵敏、高选择性检测。
一种检测FB1的动态范围可调电化学适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)DNA四面体纳米结构(DTN)溶液的制备：取四种单链DNA固体，分别记为S1、 S2、S3、S4；分别用TE缓冲液中稀释，得到四种TE稀释溶液；随后，将四种TE稀释溶液在TM缓冲液中稀释，得到四种TM稀释液，在TM稀释液中加入TCEP(三(2-羧乙基)膦)，最后将四种单链DNA溶液按照等比例混合后的混合液，进行加热反应，加热反应后再进行降温反应，反应后得到DNA四面体纳米结构溶液，记为DTN溶液；
(2)金(Au)电极的预处理：首先将金电极用氧化铝在麂皮上抛光，然后分别在乙醇和超纯水中超声处理以去除表面残留物；在H2SO4溶液中通入一段时间氮气，再将超声处理后的电极在通入氮气后的H2SO4溶液中进行循环伏安(CV)扫描，对电极进行电化学清洗，直至得到稳定的曲线；
(3)将步骤(1)制备的DTN溶液滴加到步骤(2)处理的金电极表面，进行第一次孵育，利用Au-S键相互作用，将DTN固定在电极表面，之后用PBS缓冲液进行清洗，去除未固定到电极表面的DTN；
然后将巯基己醇(MCH)再滴加在金电极表面，进行第二次孵育，以封闭金电极表面的非特异性活性位点；
(4)然后将电极浸泡到亚甲基蓝(MB)溶液中一段时间，吸附MB，产生电化学信号；随后将FB1适配体(FB1 Apt)溶液滴加在电极表面，进行孵育，孵育后得到高灵敏、高选择性检测FB1的电化学传感器。
优选的，步骤(1)中所述四种TE稀释溶液的浓度均为50μM；所述四种TM稀释液的浓度1～3μM；所述TCEP在四种TM稀释液中的终浓度均为3mM。
优选的，步骤(1)中所述S1、S2、S3、S4的5'到3'端的序列依次为：
S1、SH-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC；
S2、SH-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC；
S3、SH-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT；
S4、ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA TTTTTAGATTGCACGGACTATCTAATTGAATAAGC。
进一步地，步骤(1)中，所述加热反应的温度为95℃持续2min；所述降温反应是降至4℃，持续30s以上。优选的，所述加热反应和降温反应在PCR仪中进行。
进一步地，步骤(2)中，所述超声的处理时间为30s；所述H2SO4溶液浓度为1M；所述通入氮气时间为20min；所述循环伏安(CV)扫描电位范围为-0.2～1.6V，扫描速率为100 mVs-1。
进一步地，步骤(3)中，所述DTN溶液滴加到金电极表面的用量为8μL；所述DTN 溶液浓度为1～3μM；所述第一次孵育的温度为4℃，时间为2-12h。
优选的，DTN溶液浓度为2.5μM，DTN孵育时间为10h。
进一步地，步骤(3)中，所述MCH的浓度为1mM，滴加到金电极表面的用量为8μL；所述第二次孵育的温度为室温，时间为40min。
进一步地，步骤(4)中，所述MB溶液浓度为10μM；所述吸附的时间为1min；所述 FB1Apt溶液滴加到电极表面的用量为8μL；所述FB1 Apt溶液浓度为3μM，孵育时间为20～120min。优选的，FB1 Apt溶液孵育时间为100min。
本发明还涉及一种动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器用途，步骤如下：
(1)取多个上述步骤中已经构建的电化学生物传感器，在其表面分别修饰浓度为0.5fg mL-1-5pg mL-1的FB1溶液，室温孵育一段时间，得到已完成识别检测的电化学生物传感器界面；一个浓度的FB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；
(2)用三电极体系(Au工作电极，Pt对电极，Ag/AgCl参比电极)在CHI660E电化学工作站上选择差分脉冲伏安法(DPV)检测步骤(1)中的电化学生物传感器界面的电流，由于FB1 Apt对FB1存在特异性识别，FB1存在时FB1 Apt从电极界面剥离，电极界面位阻减小，此时MB产生的电化学信号与FB1溶液的浓度正相关，每一个浓度的FB1会对应一个电流值，其中浓度为0.5fg mL-1时所对应的电流值记为I1，浓度为5pg mL-1时所对应的电流值记为I2，根据电流值和FB1浓度的对数构建得到标准曲线1；
(3)对于浓度超过5pg mL-1FB1样品液，记为样品液A；由于其浓度超出步骤(2)构建的标准曲线浓度范围的最高浓度，因此其产生的响应电流大于步骤(2)中的电流值I2，传感器无法对此进行检测；此时通过在浓样品液A中加入FB1适配体(作为消耗剂，起到辅助作用)，减少样品液A中游离FB1的数量；使得样品液A中游离适配体的浓度已经降低到传感器可以响应的浓度范围；然后将样品液A按照步骤(1)的操作修饰在电化学生物传感器表面，孵育后，进一步按照步骤(2)的操作检测电流值，最后根据电流值和FB1浓度的对数重新构建得到标准曲线2，实现传感器动态范围调控。
(4)待测样品中FB1的检测：将样品处理后得到待测样品液，修饰一定体积的待测样品液于传感器表面，孵育后按照步骤(2)进行操作，然后测定电流值；如果电流值在I1～I2 范围内；则将电流值代入步骤(2)构建的标准曲线1，实现未知样品中FB1的检测；
如果电流值超过I2，这说明样品液中FB1浓度过高，超过5pg mL-1；需要在待测样品液中加入FB1适配体，然后后再修饰于传感器表面，孵育后按照步骤(2)进行操作，测定电流值，代入步骤(3)构建的标准曲线2，即可获知样品中FB1的浓度。
进一步地，步骤(1)中，所述FB1溶液修饰的用量为8μL；所述室温孵育一段时间为1～50min。优选的，所述室温孵育一段时间为40min。
进一步地，步骤(3)中，所述样品液A为一个统称，其实质可指代多个样品液，其中FB1的浓度均超过5pg mL-1。
进一步地，步骤(3)中，所述添加FB1适配体在样品液A中的终浓度为1nM；所述孵育均为室温条件孵育40min。
进一步地，步骤(4)中，所述添加FB1适配体在待测样品液中的终浓度为1nM；所述孵育均为室温条件孵育40min。
进一步地，步骤(4)中，所述待测样品液或添加FB1适配体的待测样品液修饰于传感器表面的用量均为8μL。
本发明的有益效果：
(1)本发明的传感器中DTN起到多重作用：第一，固定尺寸的DTN有利于FB1 Apt 的可控组装，保证了高识别效率；第二，DTN相对较大的尺寸增强了MB的吸收；第三，在动态范围调控后的检测过程中，DTN通过静电排斥有效地抑制了辅助适配体的吸附，减小了其对检测的影响。
(2)本发明构建的电化学适配体传感器用于FB1的检测，灵敏度高、选择性好，其检测范围跨越7个数量级，检测限是目前所报道的检测FB1的传感器中最低的，突破了目前高浓度检测的限制，取得了显著的成果。
附图说明
图1中(A)为电化学适配体传感器构建工艺过程图；(B)为动态范围调控示意图。
图2中(A)为DTN的凝胶电泳图；(B)为DTN的原子力显微镜图；(C)为计时电量曲线。
图3中(A)为传感器构建过程能奎斯特图；(B)为可行性验证图。
图4中(A)为DTN的浓度优化；(B)为DTN的孵育时间优化；(C)为Apt的孵育时间优化；(D)为FB1的孵育时间优化。
图5中(A)为本发明的电化学传感器与FB1浓度的变化关系图；(B)为本发明的电化学传感器与FB1浓度的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例在本发明的技术方案为前提下进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明所提及的试剂：FB1适配体购买自上海生物工程公司；合成DTN的四种单链DNA (S1、S2、S3、S4)购买自金唯智生物科技有限公司，序列如表1
表1：实验中所用的DNA序列
本发明所用的溶液：DTN自组装溶液为TM缓冲液(20mM Tris，50mM MgCl2，pH＝8.0) 和TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH＝8.0)；电极冲洗液为0.1M PBS(pH＝7.4)；杂交缓冲液是Tris-HCl缓冲液(0.05M Tris,0.2M NaCl,1mM EDTA,pH＝7.4)；用于DTN密度测定的溶液是10mM PBS(含240μM RuHex，pH＝7.4)。所有溶液都是用超纯水制备的。
(1)DTN的合成探究
探究具体方法操作为：四种单链DNA(S1、S2、S3、S4)分别在TE缓冲液中稀释，得到浓度为50μM的四种溶液。随后，将浓度为50μM的四种单链DNA溶液分别在TM缓冲液中稀释，在稀释过程中均加入TCEP固体，最终TCEP在四种溶液中终浓度均为3mM，得到四种单链DNA溶液。
设置七组对照实验，分别为S3；S4；S1、S2等比例混合；S3、S4等比例混合；S1、S2、S3等比例混合；S1、S2、S4等比例混合；S1、S2、S3、S4等比例混合，此七组实验分别记为组1、组2、组3、组4、组5、组6、组7。将7组溶液在PCR仪中95℃持续2min，然后迅速降温到4℃，持续30s以上。
从图2(A)可以看出，组1处于最低分子量带，迁移速率最快；组1到组7，随着分子量的增加，迁移速率逐渐减慢；由于只有四条单链DNA组合才可以形成DTN，因此组7处于最高分子量带，与任何其他组合结构相比，由于DTN尺寸最大且分子量最高，其迁移速率最慢，说明组7中DTN合成成功。从图2(B)可以看出，原子力显微镜的尺寸图中所有纳米结构的尺寸基本一致。深度直方图表明四面体高度主要集中在3.0-3.5nm。DTN高度理论为4.73nm，但实际上，由于三维结构坍塌，其高度低于4.73nm。
(2)DTN在电极界面密度计算
具体方法操作为：设置两组实验，分别在10mM不含RuHex的PBS；10mM含有RuHex 的PBS中测计时库伦曲线，此两组实验分别记为组a、组b。
组a：将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点。然后在10mM不含RuHex 的PBS中用CHI660E电化学工作站测得计时库伦曲线。
组b：将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点。然后在10mM含有RuHex 的PBS中用CHI660E电化学工作站测得计时库伦曲线。
从图2(C)可以看出，当电解液中没有RuHex时，CC电量很小，只是双电层电量；当加入RuHex时，CC电量有很大的增加。通过Cottrell方程，以及在加钌离子前后电量的变化，计算钌离子在电极组装层中吸附的电量值；通过其摩尔数与DNA表面密度的换算，计算出 DTN在电极表面的组装密度为2.631×1012cm-2。由组装密度可以计算探针之间的距离为6.781nm，理论上，DTN在电极上紧密组装，相邻探针之间的距离是6.649nm。所以，实验结果和理论值基本保持一致，DTN在电极表面的自组装是紧密排列的单分子层。
(3)本发明制备的电化学适配体传感器构建探究
探究具体方法操作为：设置六组实验，分别为金电极，金电极上修饰DTN；金电极上依次修饰DTN、MCH；金电极上依次修饰DTN、MCH、MB；金电极上依次修饰DTN、MCH、 MB、FB1Apt；金电极上依次修饰DTN、MCH、MB、FB1 Apt、FB1，此六组实验分别记为组a、组b、组c、组d、组e、组f。
组a操作为：将处理好的金电极在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中用Autolab PGSTAT 302N电化学工作站检测其位阻，此时观察到一个小的半圆，显示了快速的电子转移。
组b操作为：将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中用Autolab PGSTAT 302N电化学工作站检测其位阻，此时电阻增大。
组c操作为：将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点，在室温下封闭40 min。在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中用Autolab PGSTAT 302N电化学工作站检测其位阻，此时电阻增大。
组d操作为：将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点，在室温下封闭40 min。然后将电极浸泡到10μM MB溶液中吸附1min MB。然后在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中用 Autolab PGSTAT302N电化学工作站检测其位阻，此时电阻增大。
组e操作为：将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点，在室温下封闭40 min。然后将电极浸泡到10μM MB溶液中吸附1min MB；随后将8μL，3μMFB1 Apt溶液滴加在电极表面，并在室温下孵育100min。在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中用Autolab PGSTAT 302N电化学工作站检测其位阻，此时电阻增大。
组f操作为：将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点，在室温下封闭40 min。然后将电极浸泡到10μM MB溶液中吸附1min MB；随后将8μL，3μM FB1 Apt溶液滴加在电极表面，并在室温下孵育100min。加入8μL，10fg mL-1目标物FB1，室温下孵育 40min。然后在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中用Autolab PGSTAT 302N电化学工作站检测其位阻，此时电阻减小。根据六组对照实验的位阻变化，通过图3中(A)图证明了该传感器构建成功且可以用于FB1检测。
(4)本发明制备的电化学适配体用于FB1检测的可行性探究
探究具体方法操作为：设置三组实验，分别为无目标物FB1，有10fg mL-1目标物FB1，有1pg mL-1目标物FB1，此三组实验分别记为组a、组b、组c。
组a操作为：将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点,在室温下封闭40min。然后将电极浸泡到10μM MB溶液中吸附1min MB，产生电化学信号；随后将8μL，3μM FB1 Apt溶液滴加在电极表面，并在室温下孵育100min。在CHI660E电化学工作站上选择差分脉冲伏安法(DPV)检测传感器界面的电流，传感器表面由于吸附的大量MB，产生电化学信号
组b操作为将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育 10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点，在室温下封闭40min。然后将电极浸泡到10μM MB溶液中吸附1min MB，产生电化学信号；随后将8μL，3μM FB1 Apt溶液滴加在电极表面，并在室温下孵育100min。加入8μL，10fg mL-1目标物FB1，室温下孵育40min。在CHI660E电化学工作站上选择差分脉冲伏安法(DPV)检测传感器界面的电流，由于FB1Apt对FB1存在特异性识别，FB1存在时，FB1 Apt从电极界面剥离，电极界面位阻减小，此时MB产生的电化学信号增大。
组c的操作为：将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点，在室温下封闭40min。然后将电极浸泡到10Μm MB溶液中吸附1minMB，产生电化学信号；随后将8μL，3μM FB1 Apt溶液滴加在电极表面，并在室温下孵育100min。加入8μL，1pg mL-1目标物FB1，室温下孵育40min。在CHI660E电化学工作站上选择差分脉冲伏安法(DPV)检测传感器界面的电流，由于FB1Apt对FB1存在特异性识别，FB1存在时，FB1 Apt从电极界面剥离，电极界面位阻减小，此时MB产生的电化学信号增大。
根据三组对照实验的结果通过图3中(B)可以看出有目标物时MB信号相较无目标物时显著增强，且浓度越大信号增强越大，证明该传感器可以进行FB1的检测。
(5)DTN的浓度优化
将体积为8μL，最终浓度为1～3μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点，在室温下封闭40min。然后将电极浸泡到10μM MB溶液中吸附1min MB，产生电化学信号。在CHI660E电化学工作站上选择差分脉冲伏安法(DPV)检测传感器界面的电流。
图4(A)显示，从1.0μM到2.0μM，MB信号随着DTN浓度的增加而增加，之后趋于稳定，表明DTN在电极表面达到饱和。因此，2.5μM被选为最佳浓度。
(6)DTN的孵育时间优化
将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育2-12h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点，在室温下封闭40min。然后将电极浸泡到10μM MB溶液中吸附1min MB，产生电化学信号。在CHI660E电化学工作站上选择差分脉冲伏安法(DPV)检测传感器界面的电流。
图4(B)显示，从2h到8h，MB信号随着DTN孵育时间的增加而增加，之后趋于稳定。因此，10h被选为DTN最佳孵育时间。
(7)Apt的孵育时间优化
将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点，在室温下封闭40min。然后将电极浸泡到10μM MB溶液中吸附1min MB，产生电化学信号；随后将8μL，3μM FB1 Apt溶液滴加在电极表面，并在室温下孵育20～120min。在CHI660E电化学工作站上选择差分脉冲伏安法(DPV)检测传感器界面的电流。
图4(C)显示，从20min到80min，MB信号随着Apt孵育时间的增加而减小，之后趋于稳定。因此，100min被选为Apt最佳孵育时间。
(8)FB1的反应时间优化
将体积为8μL，最终浓度为2.5μM的DTN溶液修饰到金电极表面在4℃孵育10h。然后，用8μL，1mM MCH滴在电极表面，封闭Au活性位点，在室温下封闭40min。然后将电极浸泡到10μM MB溶液中吸附1min MB，产生电化学信号；随后将8μL，3μM FB1 Apt溶液滴加在电极表面，并在室温下孵育100min。加入8μL，1pg mL-1目标物FB1，室温下孵育 1～50min。在CHI660E电化学工作站上选择差分脉冲伏安法(DPV)检测传感器界面的电流。
图4(D)显示，从1min到30min，MB信号随着FB1孵育时间的增加而增大，之后趋于稳定。因此，40min被选为FB1最佳反应时间。
实施例1：
(1)DTN的制备：四种单链DNA固体(S1、S2、S3、S4)在TE缓冲液中稀释，得到 50μM的溶液。随后，50μM的单链DNA溶液在TM缓冲液中稀释为10μM，在稀释过程中中加入TCEP固体，最终TCEP在溶液中浓度为3mM；将所得的四种单链DNA溶液等量混合，在PCR仪中95℃持续2min，然后迅速降温到4℃，持续30s以上，得到2.5uM DTN 溶液。
(2)金电极的预处理：首先将3mm金电极用氧化铝在麂皮上抛光，然后分别在乙醇和超纯水中超声处理30s，以去除表面残留物；在1M H2SO4溶液中通入氮气，时间为20min，将超声处理后的电极在所得H2SO4溶液中进行循环伏安(CV)扫描，CV扫描电位范围为 -0.2～1.6V；扫描速率为100mV s-1，对电极进行电化学清洗，直至得到稳定的曲线。
(3)将8μL，2.5μM的DTN溶液滴加到处理好金电极表面，并在4℃下孵育10h，利用Au-S键相互作用，将DTN固定在电极表面，之后用PBS进行清洗，去除未固定到电极表面的DTN。
然后将1mM MCH滴加在金电极表面，室温孵育40min，以封闭金电极表面的非特异性活性位点；
(4)然后将电极浸泡到10μM MB溶液中1min，吸附MB，产生电化学信号；随后将8 μL，3μM FB1 Apt溶液滴加在电极表面，并在室温下孵育100min，得到高灵敏、高选择性检测FB1的电化学传感器。
(5)取多个上述步骤中已经构建的电化学生物传感器，在其表面分别修饰浓度为0.5fg mL-1,5fg mL-1,10fg mL-1,50fg mL-1,100fg mL-1,500fg mL-1,1000fg mL-1,5000fgmL-1FB1溶液，常温孵育40min，得到已完成识别检测的电化学生物传感器界面；一个浓度的FB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系。
(6)用三电极体系(Au工作电极，Pt对电极，Ag/AgCl参比电极)在CHI660E电化学工作站上选择差分脉冲伏安法(DPV)检测步骤(1)中的电化学生物传感器界面的电流，由于FB1 Apt对FB1存在特异性识别，FB1存在时FB1 Apt从电极界面剥离，电极界面位阻减小，此时MB产生的电化学信号与FB1溶液的浓度正相关，每一个浓度的FB1会对应一个电流值，根据电流值和FB1浓度的对数构建得到标准曲线；
计算标准液中FB1浓度CFB1与Ip的线性回归方程，方程公式为Ip＝624+33.0LogCFB1作为实际检测中FB1低浓度范围的线性方程。
(7)对于超出步骤(6)中标准曲线浓度范围的FB1样品液，首先取不同浓度FB1样品液，在FB1样品液中加入的FB1适配体作为消耗剂，减少样品液中游离FB1的数量；此时 FB1样品液中FB1浓度分别为5pg mL-1,10pg mL-1,50pg mL-1,100pg mL-1,500pg mL-1, 1000pgmL-1，FB1适配体的终浓度为1nM；然后再修饰于传感器表面，室温孵育40min后，按照步骤(6)进行操作，测定电流值，重新得到一条标准曲线，实现传感器动态范围调控。
计算标准液中FB1浓度CFB1与Ip的线性回归方程，方程公式为Ip＝726+54.1LogCFB1作为实际检测中FB1高浓度范围的线性方程。
通过图5可以看出提出的传感策略，针对FB1检测的线性范围为0.5fg mL-1到1ngmL-1，跨越7个数量级。
(8)大米样品中FB1的检测：将大米样品研磨成米粉，将3克米粉浸泡于甲醇-水(60： 40，v/v，30mL)混合液中。振荡提取30分钟，然后以6000转离心15分钟，取上清液用0.22 微米的超滤膜进行透析，作为大米样品提取液。分别加入0、100、500、1000ng mL-1FB1，稀释107倍后，进行检测，并代入图5中的线性回归方程中，获得其检测回收率，具体如表1所示。
表2：大米样品中FB1的检测回收率
通过表2可以看出，本实施例制备的传感器可以灵敏定量可靠检测待测样品中的FB1，不需要专业培训，操作简便；突破了目前高浓度检测的限制，取得了显著的成果。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器的制备方法及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagtattttt 60
agattgcacg gactatctaa ttgaataagc 90
<210> 5
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ataccagctt attcaattaa tcgcattacc ttataccagc ttattcaatt acgtctgcac 60
ataccagctt attcaattag atagtaagtg caatct 96

Claims (10)

1.一种动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）DNA四面体纳米结构溶液的制备：取四种单链DNA，记为S1、S2、S3、S4，分别用TE缓冲液稀释，得到四种TE稀释溶液；随后，将四种TE稀释溶液在TM缓冲液中稀释，得到四种TM稀释液，在TM稀释液中加入三(2-羧乙基)膦；最后将四种单链DNA溶液按照等比例混合后的混合液，进行加热反应，加热反应后再进行降温反应，反应后得到DNA四面体纳米结构溶液，记为DTN溶液；
所述S1、S2、S3、S4的5'到 3'端的序列依次为：
S1、SH-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC；
S2、SH-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC；
S3、SH-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT；
S4、ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA
TTTTTAGATTGCACGGACTATCTAATTGAATAAGC；
（2）金电极的预处理：首先将金电极用氧化铝在麂皮上抛光，然后分别在乙醇和超纯水中超声处理；在H2SO4溶液中通入一段时间氮气，再将超声处理后的电极在通入氮气后的H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，对电极进行电化学清洗，直至得到稳定的曲线；
（3）将步骤（1）制备的DTN溶液滴加到步骤（2）处理的金电极表面，进行第一次孵育；之后用PBS缓冲液进行清洗；
清洗后将巯基己醇再滴加在金电极表面，进行第二次孵育，以封闭金电极表面的非特异性活性位点；
（4）然后将电极浸泡到亚甲基蓝溶液中一段时间；随后将FB1适配体溶液滴加在电极表面，进行孵育，孵育后得到电化学传感器。
2. 根据权利要求1所述的动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述四种TE稀释溶液的浓度均为50 μM；所述四种TM稀释液的浓度为1~3μM；所述TCEP在四种TM稀释液中的终浓度均为3mM；
所述加热反应的温度为95 ℃持续2 min；所述降温反应是降至4 ℃，持续30 s以上。
3. 根据权利要求1所述的动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述超声的处理时间为30s；所述H2SO4溶液浓度为1 M；所述通入氮气时间为20 min；所述循环伏安扫描电位范围为-0.2~1.6 V，扫描速率为100 mV s-1。
4. 根据权利要求1所述的动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述DTN溶液滴加到金电极表面的用量为8 μL；所述DTN溶液浓度为1~3μM；所述第一次孵育的温度为4℃，时间为2-12 h；所述MCH的浓度为1 mM，滴加到金电极表面的用量为8 μL；所述第二次孵育的温度为室温，时间为40 min。
5. 根据权利要求4所述的动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述DTN溶液浓度为2.5 μM，孵育时间为10 h。
6. 根据权利要求1所述的动态范围可调的伏马菌素B1电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述MB溶液浓度为10μM，一段时间为1 min；所述FB1适配体溶液滴加到电极表面的用量为8 μL；所述FB1适配体溶液浓度为3 μM，孵育时间为20~120 min。
7.根据权利要求1-6任一所述方法制备的电化学生物传感器用于检测伏马菌素B1的用途，其特征在于，步骤如下：
（1）取多个已经构建的电化学生物传感器，在其表面分别修饰浓度为0.5 fg mL-1-5 pgmL-1的FB1溶液，室温孵育一段时间，得到已完成识别检测的电化学生物传感器界面；一个浓度的FB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；
（2）用三电极体系，以Au为工作电极，Pt为对电极，Ag/AgCl为参比电极；在CHI660E电化学工作站上选择差分脉冲伏安法检测步骤（1）中的电化学生物传感器界面的电流，由于FB1适配体对FB1存在特异性识别，FB1存在时FB1适配体从电极界面剥离，电极界面位阻减小，此时MB产生的电化学信号与FB1溶液的浓度正相关，每一个浓度的FB1会对应一个电流值，其中浓度为0.5 fg mL-1时所对应的电流值记为I1，浓度为5 pg mL-1时所对应的电流值记为I2，根据电流值和FB1浓度的对数构建得到标准曲线1；
（3）对于浓度超过5 pg mL-1 FB1样品液，记为样品液A；由于其浓度超出步骤（2）构建的标准曲线浓度范围的最高浓度，因此其产生的响应电流大于步骤（2）中的电流值I2，传感器无法对此进行检测；此时通过在浓样品液A中加入FB1适配体，减少样品液A中游离FB1的数量；使得样品液A中游离适配体的浓度已经降低到传感器可以响应的浓度范围；然后将样品液A按照步骤（1）的操作修饰在电化学生物传感器表面，孵育后进一步按照步骤（2）的操作检测电流值，最后根据电流值和FB1浓度的对数重新构建得到标准曲线2，实现传感器动态检测范围的调控；
（4）待测样品中FB1的检测：将样品处理后得到待测样品液，修饰一定体积的待测样品液于传感器表面，孵育后按照步骤（2）进行操作，然后测定电流值；如果电流值在I1~ I2范围内；则将电流值代入步骤（2）构建的标准曲线1，实现未知样品中FB1的检测；
如果电流值超过I2，这说明样品液中FB1浓度过高，超过5 pg mL-1；需要在待测样品液中加入FB1适配体，然后再修饰于传感器表面，孵育后按照步骤（2）进行操作，测定电流值，代入步骤（3）构建的标准曲线2，即可获知样品中FB1的浓度。
8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于，步骤（1）中，所述FB1溶液修饰的用量为8μL；所述室温孵育一段时间为1~50 min。
9. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于，步骤（3）或（4）中，加入FB1适配体在样品液A或待测样品液中的终浓度均为1nM；所述孵育均为室温条件下孵育40 min。
10. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于，步骤（4）中，所述待测样品液或添加FB1适配体的待测样品液修饰于传感器表面的用量均为8 μL。
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