CN107271410B - 细菌或真菌的活性快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种细菌或真菌的活性快速检测方法。细菌或真菌的活性快速检测方法，包括步骤：1)首先配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后将多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、靶细胞和载体混合均匀，在载体表面进行聚合反应得到靶细胞‑丹磺酰多巴胺/多巴胺‑载体复合体；最后利用洗脱剂将靶细胞从复合体上洗脱下来，得到靶细胞的荧光分子印迹聚合物；2)向荧光分子印迹聚合物中加入样品后即刻测定荧光值为I0，待样品中的细菌或真菌与荧光分子印迹聚合物结合完全后，测定荧光值为I，I0/I‑1表示荧光变化水平，通过荧光变化水平确定样品中靶细菌或靶真菌的含量。该方法能快速准确地检测出样品中细菌或真菌的活性。

Description

细菌或真菌的活性快速检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种细菌或真菌的活性快速检测方法。

背景技术

细菌和真菌广泛存在于自然界和人体内，致病性细菌和真菌可严重危害生命体健康。据统计，全球约有三分之一的死亡与细菌感染性疾病相关。病原菌侵染机体引起病变，通常需要：①侵入并定植于机体；②在宿主体内增殖并向其它部位扩散；③逃避机体防御机制；④释放毒素或引发超敏反应。其中有活性的病原菌侵入机体是细菌感染的第一步，是致病菌引起机体病变的首要条件，因此快速、准确、灵敏的细菌活性检测方法对减少相关疾病发生，维护人类的健康至关重要。

细菌或真菌的活性检测的传统方法是分离和选择性培养，有平板计数法、滤膜法、多管发酵法等，这些方法不需要大型仪器，可以检测活细菌或真菌，其缺点是耗时长、效率低，不能满足水质监测、食品卫生、临床诊断所需的快速检测的要求。常见细菌或真菌的活性快速检测方法是基于PCR技术的研究。普通PCR难以区分活菌与死菌，但可通过核酸交联剂透过细胞膜与死菌DNA结合，抑制死菌DNA扩增；或扩增仅存在于活菌中的mRNA，达到检测活菌的目的。但是由于PCR对很少的DNA即可有很好的扩增效果，这种方法难以将死菌的DNA或mRNA完全去除，导致假阳性很高，无法满足实际需要。因此，开发更快速且更准确的细菌活性检测方法，在环境、医学、农业、食品等多个领域具有重要的用途。

为了开发快速准确的细菌或真菌的活性检测方法，本发明利用分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)，目前，已有不少研究者对细菌或真菌的MIPs进行研究，在细菌MIPs中，部分研究者以细菌表面蛋白为模板制备MIPs，例如Khan等人在单壁碳纳米管上，以金黄色葡萄球菌外层有代表性的蛋白A为模板，通过循环伏安法使3-氨基酚发生电聚合制备MIPs，在有牛血清白蛋白干扰的情况下，MIPs对模板仍有良好的选择性(Khan MSR,Moreira FTC,Riu J et al.Plastic antibody for the electrochemicaldetection of bacterial surface proteins.Sensor Actuat B-Chem,2016,233:697-704.)。Jiang等人在磁性纳米颗粒表面，以革兰阴性菌的信号分子AHLs为模板，通过表面印迹制备了MIPs，可对细菌进行间接检测(Jiang H,Jiang D,Shao J et al.Magneticmolecularly imprinted polymer nanoparticles based electrochemical sensor forthe measurement of Gram-negative bacterial quorum signaling molecules(N-acyl-homoserine-lactones).Biosens Bioelectron,2016,75:411-419.)。Idil等人以整个大肠杆菌为模板，以N-甲基丙烯酰-L-组氨酸、2-甲基丙烯酸羟乙酯为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸为交联剂，用紫外光进行引发，制备大肠杆菌MIPs，可特异性吸附模板大肠杆菌。对大肠杆菌的检出限为70CFU/mL，检测范围为1.0×10²-1.0×10⁷CFU/mL。该方法用于果汁和河水中加标大肠杆菌的检测，回收率为81-97％(Idil N,Hedstrom M,Denizli A etal.Whole cell based microcontact imprinted capacitive biosensor for thedetection of Escherichia coli.Biosens Bioelectron,2017,87:807-815.)。Roy等人以整个大肠杆菌为模板，以N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为功能单体制备大肠杆菌MIPs。与亚铁/铁氰化物氧化还原探针连用，可实现对大肠杆菌的检测，且与大肠杆菌在10-109CFU/mL范围线性相关，检出限为10CFU/mL。除了能检测外，该材料还可从水样中捕获超过98％的大肠杆菌。最后该材料还可以通过光热在5分钟内杀死10⁵CFU/mL大肠杆菌(Roy E,Patra S,Tiwari A et al.Single cell imprinting on the surface of Ag-ZnO bimetallicnanoparticle modified graphene oxide sheets for targeted detection,removaland photothermal killing of E.Coli.Biosens Bioelectron,2017,89(Pt 1):620-626.)。以上研究均表明细菌MIPs可特异性结合并检测靶细菌，但以上工作均未研究MIPs是否可以测定细菌或真菌活性，而且上述检测细菌或真菌的MIPs的操作较为复杂。

发明内容

为解决以上问题，本发明的目的是提供一种细菌或真菌的活性快速检测方法，能快速准确地检测出细菌或真菌样品中细菌或真菌的活性。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

细菌或真菌的活性快速检测方法，包括以下步骤：

1)制备靶细胞的荧光分子印迹聚合物：

首先称取多巴胺和丹磺酰多巴胺，配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后将多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、靶细胞和载体混合均匀，以靶细胞为模板、丹磺酰多巴胺为荧光功能单体、多巴胺为功能单体，在载体表面进行聚合反应得到靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体；最后利用洗脱剂将靶细胞从靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体上洗脱下来，得到靶细胞的荧光分子印迹聚合物；

2)检测细菌活性：

向荧光分子印迹聚合物中加入细菌或真菌样品后即刻测定荧光值为I0，待细菌或真菌样品中的细菌或真菌与荧光分子印迹聚合物结合完全后，测定荧光值为I，I0/I-1表示荧光变化水平，通过荧光变化水平确定样品中是否含有靶细菌或靶真菌以及该靶细菌或靶真菌的含量。

作为优选方案，所述步骤1)中载体为经聚多巴胺修饰后得到的多巴胺-载体复合体，所述多巴胺-载体复合体是通过将多巴胺和载体材料混合，并在过硫酸铵催化作用下，多巴胺在载体材料表面发生自聚合反应而制得。

作为优选方案，所述载体材料为纳米微球、微米微球或多孔板。

作为优选方案，所述靶细胞为靶细菌或靶真菌，所述靶细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，所述靶细菌的浓度为10⁴～10⁶CFU/mL。

作为优选方案，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌或蜡样芽孢杆菌；所述靶真菌为酵母菌。

作为优选方案，所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中包括多巴胺、丹磺酰多巴胺和催化剂。

作为优选方案，所述催化剂为过硫酸铵。

作为优选方案，所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中多巴胺、丹磺酰多巴胺、过硫酸铵的摩尔比为4:1:1。

作为优选方案，所述洗脱剂为去离子水。

本发明制得的荧光分子印迹聚合物在检测水样中细菌活性及其含量的应用。具体方法为，将以荧光分子印迹聚合物为敏感膜制成荧光分子印迹聚合物传感器(fMIPs传感器)，将fMIPs传感器投置于待检测的水样中，通过fMIPs传感器的荧光值变化得出水样中的靶细菌和靶真菌的含量。

本发明的细菌或真菌的活性快速检测方法的原理是：

分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)是化学合成的高分子聚合物，通过特定的空间结构和化学键(包括共价键、离子键、氢键等)特异性识别和结合靶分子，其吸附特异性与天然抗体类似，但耐受有机溶剂、离子、酸碱、高温和高压。其中含荧光的MIPs，又称荧光分子印迹聚合物(fluorescent molecularly imprinted polymers,fMIPs)，不仅可以特异性结合模板分子，同时模板分子的结合还可以导致荧光MIP发生荧光信号的改变(如荧光波长改变，或者荧光强度改变)，根据荧光信号的改变，即可测定与fMIPs特异性结合的模板分子的含量。

结合图1所示，本发明以靶细胞为模板、丹磺酰多巴胺作为荧光功能单体，多巴胺作为功能单体，在载体表面制备靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体，然后再从复合体上将靶细胞洗脱，即得到可特异性吸附靶细胞的荧光分子印迹聚合物(fMIPs)。

当细菌样品中活靶细胞与fMIPs结合时，可导致fMIPs的荧光减弱，通过比较加样前后的荧光改变，即可快速测定样品中是否存在活细菌，并初步确定活细菌的含量。

本发明中采用的丹磺酰多巴胺的制备方法参阅中国发明专利(授权公告号CN103992252B授权公告日2016.06.22)公开的一种多巴胺衍生物及分子印迹聚合物制备方法和应用。

本发明的优点在于：

1，本发明通过使用丹磺酰多巴胺和多巴胺在载体表面进行聚合反应制备得到靶细胞的fMIPs，由于丹磺酰多巴胺和多巴胺在水相条件下即可进行聚合反应，在水相条件下保证了靶细胞的结构稳定性，而且聚多巴胺可为细菌印迹提供丰富的羟基，提高了fMIPs的印迹效果。

2，靶细胞的fMIPs对靶细胞具有特异性识别能力。fMIPs集特异性吸附和荧光检测于一体，不仅可以特异性吸附靶细胞，还可以根据荧光的改变，直接快速测定其结合的靶细胞含量。

3，利用靶细胞的fMIPs还可有效地区分活细菌和死细菌，可直接测定水中的靶细胞，并且耐受水中其他细菌、死的同类细菌、离子、有机物的干扰，适用于多种环境条件。

附图说明

图1为本发明细菌或真菌的活性快速检测方法的流程图；

图2a为使用经聚多巴胺修饰的多巴胺-载体复合体和不使用聚多巴胺修饰的多巴胺-载体复合体，所制备的fMIPs吸附靶细菌前后的荧光变化水平图；

图2b为多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液的过硫酸铵、多巴胺和丹磺酰多巴胺配比优化图；

图2c为使用不同洗脱剂所制备的fMIPs吸附靶细菌后的荧光变化水平图；

图2d为使用不同的靶细菌浓度制备的fMIPs吸附靶细菌后的荧光变化水平图；

图3a为实施例1制得的E.Coli-fMIPs-Ⅰ的电镜扫描图；

图3b为对比例1制得的fNIP的电镜扫描图；

图3c为fMIPs膜的厚度的测量；

图3d为聚多巴胺修饰多孔板得到的多巴胺-载体复合体上的单层多巴胺膜(PDA)厚度的测量；

图3e为单层多巴胺膜(PDA)、E.Coli-fMIPs-Ⅰ和fNIP膜的热重曲线；

图4a为E.Coli-fMIPs-Ⅰ对E.Coli 285的吸附等温曲线图；

图4b为E.Coli-fMIPs-Ⅰ吸附动力学曲线；

图4c为E.Coli-fMIPs-Ⅰ吸附E.Coli 285时荧光随时间变化趋势线图；

图5a为E.Coli 285-fMIP吸附不同大肠杆菌后的荧光变化水平；

图5b为E.Coli 285-fMIPs吸附不同的细菌和真菌后的荧光变化水平；

图5c为以不同种的大肠杆菌为模板制备的各种fMIPs，结合不同大肠杆菌后的荧光变化值；

图5d为分别以不同的细菌和真菌为模板所制备的fMIPs，吸附不同靶细菌和靶真菌后的荧光变化水平；

图6a为E.Coli 285-fMIP对活菌、高压灭活菌、酒精灭活菌的荧光响应；

图6b为E.Coli 285-fMIPs分别吸附不同起始滴度(约50～3000CFU/mL)的E.Coli285菌液的荧光变化标准曲线；

图6c为E.Coli 285-fMIPs分别吸附不同起始滴度(约50～3000CFU/mL)的灭活E.Coli 285菌液的荧光变化标准曲线；

图中各部件标号如下：靶细胞(大肠杆菌)1、多巴胺2、丹磺酰多巴胺3、96孔酶标板4、靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体5、大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物6、加入大肠杆菌后的荧光分子印迹聚合物7；其中，荧光值的大小为6>7。

具体实施方式

为解决现有技术中存在耗时长、效率低，无法准确地检测细菌活性的问题，本发明提供一种细菌或真菌的活性快速检测方法，本方法从制备靶细胞的荧光分子印迹聚合物为设计思路的出发，通过以靶细胞为模板、丹磺酰多巴胺作为荧光功能单体，多巴胺作为功能单体，在载体表面发生聚合反应，制备靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体材料复合体，再从复合体上将靶细胞洗脱，得到可特异性吸附靶细胞的荧光分子印迹聚合物(fMIPs)来达到上述设计目的。以下通过具体的实施例来对本发明的病毒活性快速检测方法进行详细地说明。

实施例1制备大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅰ

制备大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅰ的方法，包括步骤：

1)试剂的配制：

多巴胺溶液Ⅰ：过硫酸铵与多巴胺以2:1的摩尔比溶于10mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液pH＝8)；

多巴胺溶液Ⅱ：多巴胺溶于10mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液pH＝8)；

多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液：多巴胺：丹磺酰多巴胺：过硫酸铵摩尔比＝4：1：1的摩尔比溶于10mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液pH＝8)；

载体材料：以96孔酶标板作为载体材料；

靶细胞：10⁴～10⁶CFU/mL的大肠杆菌菌液，大肠杆菌采用E.Coli285；

洗脱液：去离子水；

2)多巴胺-载体复合体的制备(聚多巴胺修饰载体材料)：

向在96孔酶标板中的每孔加300μL多巴胺溶液Ⅰ，置于37℃的空气中96孔酶标板与多巴胺发生自聚合反应，反应24h后将孔中多巴胺溶液倒去，得到多巴胺-载体复合体；

3)大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体的制备：

向多巴胺-载体复合体中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和靶细胞(大肠杆菌)，置于摇床中(温度为37℃，转速为150rpm)缓慢振摇72h后倒去孔中的液体，即得大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体；

4)洗脱靶细胞：

用去离子水反复洗涤大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体，将大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体中的大肠杆菌洗脱下来，每次洗涤30min，共洗涤6次，得到大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅰ，大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅰ以下均采用简称E.Coli-fMIPs-Ⅰ。

实施例2制备大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅱ

实施例2的制备方法与是实施例相比，区别在于：实施例2不进行实施例1中的步骤2)，即实施例2不采用经聚多巴胺修饰的多巴胺-载体复合体作为载体，而是直接将多巴胺，丹磺酰多巴胺，大肠杆菌在载体材料上聚合。具体过程如下：

1)大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体的制备：向96孔酶标板中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和靶细胞(大肠杆菌)，置于摇床中(温度为37℃，转速为150rpm)缓慢振摇72h后倒去孔中的液体，即得大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体；；

2)洗脱靶细胞：用洗脱剂反复洗涤大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体，将大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体中的大肠杆菌洗脱下来，每次洗涤30min，共洗涤6次，得到大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅱ。

实施例3制备大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅲ

大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅲ的制备方法与实施例1相同，不同之处在于：本实施例将实施例1步骤2)中的多巴胺溶液Ⅰ改为多巴胺溶液Ⅱ，多巴胺溶液Ⅰ与多巴胺溶液Ⅱ的区别在于过硫酸铵的是否添加。本实施例制备的大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅲ的方法在此不再赘述。

实施例4制备蜡样芽孢杆菌的荧光分子印迹聚合物

蜡样芽孢杆菌的荧光分子印迹聚合物的制备方法与实施例1相同，不同之处在于：本实施例将实施例1步骤3)中的靶细胞改为蜡样芽孢杆菌，本实施例制得的蜡样芽孢杆菌的荧光分子印迹聚合物以下均采用简称蜡样芽孢杆菌-fMIPs。

实施例5制备金黄色葡萄球菌的荧光分子印迹聚合物

金黄色葡萄球菌的荧光分子印迹聚合物的制备方法与实施例1相同，不同之处在于：本实施例将实施例1步骤3)中的靶细胞改为金黄色葡萄球菌，本实施例制得的金黄色葡萄球菌的荧光分子印迹聚合物以下均采用简称金黄色葡萄球菌-fMIPs。

实施例6制备酵母菌的荧光分子印迹聚合物

酵母菌的荧光分子印迹聚合物的制备方法与实施例1相同，不同之处在于：本实施例将实施例1步骤3)中的靶细胞改为酵母菌，本实施例制得的酵母菌的荧光分子印迹聚合物以下均采用简称酵母菌-fMIPs。

实施例7制备大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅳ

1)试剂的配制：

多巴胺溶液Ⅰ：过硫酸铵与多巴胺以2:1的摩尔比溶于10mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液pH＝8)；

多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液：多巴胺：丹磺酰多巴胺：过硫酸铵摩尔比＝4：1：1的摩尔比溶于10mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液pH＝8)；

载体材料：以150mg/mL硅胶微球为载体材料；

靶细胞：10⁴～10⁶CFU/mL的大肠杆菌菌液，大肠杆菌采用E.Coli285；

洗脱液：去离子水

2)多巴胺-载体复合体的制备：

将150mg/mL硅胶微球与多巴胺溶液Ⅰ在37℃搅拌混合10小时，硅胶微球与多巴胺发生自聚合反应，10小时后取出硅胶微球，得到多巴胺-载体复合体；

3)大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体的制备：

向多巴胺-载体复合体中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和靶细胞(大肠杆菌E.Coli 285)，置于摇床中(温度为37℃，转速为150rpm)缓慢搅拌10小时后取出硅胶微球，即得大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体；

4)洗脱靶细胞：

用洗脱剂反复洗涤大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体，将大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体中的大肠杆菌洗脱下来，每次洗涤30min，共洗涤6次，得到大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅳ。

实施例8制备大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅴ

大肠杆菌的荧光分子印迹聚合物Ⅴ制备方法与实施例7相同，不同之处在于：本实施例将实施例5中的硅胶微球载体改为1mg/mL四氧化三铁纳米微球。

实施例9空白印迹聚合物(NIP)的制备

分别制备实施例1～8的对比例，分别为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7和对比例8。对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5和对比例6、对比例7和对比例8与对应的实施例的制备方法相同，区别在于：不添加靶细胞。以对比例1为例，其他在此不在赘述。

对比例1的制备方法与实施例1的制备方法相同，区别在于：步骤3)中不添加靶细胞(大肠杆菌)。对比例1～8制得的空白印迹聚合物以下以及说明说附图中均使用简称fNIP。

实施例10反应参数的优化试验

向实施例1～8中制备的细菌或真菌的荧光分子印迹聚合物(fMIPs)以及各实施例对应的空白印迹聚合物(fNIPs)中，分别加入300μL PBS缓冲溶液，测其荧光值作为I0，倒掉PBS缓冲溶液后，加入模板菌液或细胞液300μL后测其荧光值，作为I，用I0/I-1表示荧光变化程度。每个浓度平行测定3次取平均值，结果分别见图2a、图2b、图2c、图2d。以下分别对图2a、图2b、图2c和图2d作详细的说明。

图2a为实施例1和实施例2的荧光变化水平对比图，即使用聚多巴胺修饰的载体材料和不使用聚多巴胺的载体材料所制备的fMIPs吸附靶细胞前后的荧光变化水平图；实施例1中使用载体为聚多巴胺修饰的多巴胺-载体复合体，实施例2未对载体进行修饰；分别测定fMIPs吸附靶细胞前后的荧光变化水平。由图2a可见，修饰在载体上的聚多巴胺膜(PDA)的孔上再合成MIPs，荧光变化效果优于未修饰聚多巴胺膜的。其原理是：聚多巴胺膜能提供大量的氨基和儿茶酚基，可与细菌壁外层的功能基团发生作用，增加了与细菌的结合能力，从而使荧光变化明显。

图2b为多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液的过硫酸铵、多巴胺和丹磺酰多巴胺配比优化图；通过测定过硫酸铵、多巴胺和丹磺酰多巴胺，在不同的摩尔比之下制备的fMIP和fNIP吸附靶细菌前后的荧光变化水平，选择最佳的配比。图2b可以看出，使用了过硫酸铵的MIP荧光变化量提高了两倍以上，可知催化剂过硫酸铵的使用是成功制备抗病毒MIP的前提。多巴胺：丹磺酰多巴胺与过硫酸铵的比例选为4:1:1时，fMIP的荧光变化量最大，表明该条件下所制备的fMIPs吸附性能最佳。

图2c为使用不同洗脱液，所制备的fMIPs吸附靶细胞后的荧光变化水平图；由图2c可以看出，以去离子水为洗脱液的效果明显优于3％乙酸与1mol/L NaCl的混合液。其原理是在低渗环境中，细菌可因吸水过度而膨胀死亡。本实验中以去离子水为洗脱液，提供低渗环境，可使大肠杆菌发生死亡而洗脱下来。

图2d为使用不同的靶细胞浓度时，所制备的fMIPs吸附靶细胞后的荧光变化水平图；由图2d可以看出，当E.Coli 285菌悬液浓度为10⁵CFU/mL时，荧光变化最为明显，在小于10⁵CFU/mL时，随着模板滴度增加，能与模板结合的功能单体数量也增加，致使结合位点数量增加，荧光变化增加。

实施例11理化性质分析试验

图3a为实施例1制得的E.Coli-fMIPs-Ⅰ的电镜扫描图；

图3b为对比例1制得的fNIP的电镜扫描图；

由图3a和图3b可看出，E.Coli-fMIPs-Ⅰ与fNIP均为膜状物，图3a可见，大肠杆菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体在洗脱完靶细胞后存在形态、大小不一的孔穴，这些孔穴为大肠杆菌去除后留下的三维孔穴结构，形状有圆形、椭圆形，为大肠杆菌的横断面、不同侧面留下的印迹。孔穴直径为0.8～1.7μm，这与大肠杆菌的大小一致。图3b的fNIPs膜并没有看出明显的孔穴。

在以硅胶微球为载体材料，制备多巴胺-载体复合体，对多巴胺-载体复合体上的单层聚多巴胺膜(PDA)、大肠杆菌285-fMIPs和fNIPs膜用元素分析仪对N、C、H元素含量进行分析，结果见表1。从表1可以看出，fMIPs、fNIPs膜中N、C元素含量相比单层PDA膜明显增加，说明成功地在PDA单层膜上制备了含更多N元素的丹磺酰多巴胺和多巴胺的fMIPs、fNIPs。

表1Element composition of PDA,fMIPs,fNIPs membrane

图3c为fMIPs膜的厚度的测量；

图3d为修饰在载体上的单层多巴胺膜(PDA)厚度的测量；

由图3c和图3d可以看出，fMIPs膜的厚度并不均一，范围从16.0～48.0μm，而且明显厚于单层多巴胺膜(约为2.8μm)。

图3e为单层多巴胺膜(PDA)、E.Coli-fMIPs-Ⅰ和fNIP膜的热重曲线；不同物质会随着温度不断升高而发生分解，导致重量下降，通过热重分析可判断形成的薄膜量。多巴胺在248℃开始分解，而交联后形成的聚多巴胺比较耐热，在400℃开始分解。从图3e中可以看出，从425℃开始三条线的重量有明显的下降，该温度正是聚多巴胺开始分解的温度，说明三种膜均有聚多巴胺。至700℃单层PDA膜失重约0.4％，fMIP膜约失重2％，fNIP膜约失重1.3％，说明fMIP和fNIP膜明显厚于单层PDA膜，成功在单层PDA膜上制备了fMIP。

实施例12E.Coli-fMIPs-Ⅰ对E.Coli 285的吸附特性

如图4a，E.Coli-fMIPs-Ⅰ对E.Coli 285的吸附等温曲线图；配制不同浓度的E.Coli 285菌悬液，分别加入到E.Coli-fMIPs-Ⅰ和对应的fNIP中，吸附平衡后，用平板涂布法测定上清液中细菌的滴度。以吸附量Adsorption(CFU/cm²)为纵坐标，菌液起始滴度C₀(CFU/mL)为横坐标，绘制吸附等温线。从图4a可见当起始菌液滴度小于800CFU/mL时，吸附容量随着菌液的浓度增加而增加，大于800CFU/mL时，曲线趋于平缓，说明此时fMIP上的识别位点均已与大肠杆菌模板结合，达到吸附饱和状态。

图4b为E.Coli-fMIPs-Ⅰ吸附动力学曲线；将100CFU/mL的E.Coli 285加入到fMIP和fNIP中，分别在0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h时间点用平板涂布法测上清菌液滴度，同时测其荧光变化。以吸附量Adsorption(CFU/cm2)为纵坐标，时间(h)为横坐标，绘制吸附动力学曲线；图4b显示，出在前1个小时，随时间增加，吸附量明显增加，吸附速率较快，吸附在1h后达到平衡。

图4c为E.Coli-fMIPs-Ⅰ吸附E.Coli 285时荧光随时间变化趋势线图；将100CFU/mL的E.Coli 285加入到fMIP和fNIP中，分别在0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h时间点测定fMIPs和fNIPs的荧光；图4c显示，fMIPs和fNIPs的荧光，与吸附率对应，均在吸附1h后达到平衡。显示荧光变化量可以准确反映靶细胞的吸附率。

实施例13靶细胞fMIPs的吸附特异性

在大肠杆菌285(E.Coli 285)为模板所制备的fMIPs中，分别加入E.Coli 285，E.Coli TG1，E.Coli BL21，吸附2h后测定荧光变化量，图5a显示，E.Coli 285-fMIPs对其它大肠杆菌菌株也有一定的荧光响应，但对E.Coli 285的响应要略优于其它菌株。不同大肠杆菌菌株可能存在血清型、基因型的差别，但其整体形态、结构、大小差别不大，因此E.Coli285-fMIPs对其它大肠杆菌菌株的响应与E.Coli 285差别不大。

在E.Coli 285为模板所制备的fMIPs中，分别加入E.coli285,金黄色葡萄球菌(S.aureus)、蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)和酿酒酵母菌(saccharomycetes)，图5bfMIPs对E.Coli 285的结合量最大，金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和真菌能引起E.Coli285-fMIPs一定的荧光变化，但变化程度没有E.Coli 285大。金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌属于革兰阳性菌，其最外层的磷壁酸，酵母菌最外层的甘露聚糖，都有羟基可与多巴胺和丹磺酰多巴胺上的氨基反应，因此会引起E.Coli 285-fMIPs的荧光发生一定的变化。但荧光变化水平与E.coli285比较，有明显差异，表面fMIPs可以区分属不同的微生物。

分别以大肠杆菌的TG1和BL21、用同样的方法制备fMIPs，比较各种大肠杆菌fMIPs对目标菌和其它菌的选择性。从图4c可以看出E.Coli TG1-fMIPs和E.Coli BL21-fMIPs对目标菌和其它大肠杆菌都有一定的吸附，该结果与E.Coli 285-fMIPs一致，说明该MIPs的制备方法可用于大肠杆菌种这一类细菌的检测。

分别以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、酿酒酵母菌为模板，比较各种不同的微生物fMIPs对不同微生物的识别能力。从图5d可以看出大肠杆菌fMIPs、金黄色葡萄球菌fMIPs、蜡样芽孢杆菌fMIPs、酿酒酵母菌fMIPs，均对模板微生物有较好的响应，而对其它微生物的相应较弱。这主要是因为细菌及真菌因为形状、大小和外层结构不同，对不同的fMIPs的识别能力有明显区别。表明fMIPs具有属特异性识别能力。

实施例14fMIP检测细菌活性(以大肠杆菌为例)

为评价大肠杆菌285-fMIPs在检测过程中是否能区分活菌与死菌，分别在fMIPs、fNIPs中加入大肠杆菌285活菌、高压灭活菌、酒精灭活菌，待吸附平衡后，测定荧光变化I0/I-1。图6a显示fMIPs可以特异性识别活菌，对不同方法灭活的靶细菌均可以有效识别。

用大肠杆菌285-fMIPs分别吸附不同起始滴度(约50～3000CFU/mL)的大肠杆菌285菌液，待吸附平衡后，测其荧光变化I0/I-1，以荧光变化I0/I-1为纵坐标，菌液起始滴度C₀为横坐标绘制标准曲线。图6b可以看出在45～840CFU/mL的范围内，荧光变化随菌液滴度的增加而增加，线性方程为y＝0.0005x+0.2891，R2＝0.8973，其LOD为15CFU/mL。

用大肠杆菌285-fMIPs分别吸附不同起始滴度(约50～3000CFU/mL)的灭活大肠杆菌285菌液，待吸附平衡后，测其荧光变化I0/I-1，以荧光变化I0/I-1为纵坐标，菌液起始滴度C₀为横坐标绘制标准曲线。图6c可以看出该散点图没有明显的线性规律，fMIPs仅对活菌具有线性，对灭活菌的检测无线性。该方法可进行细菌活性检测。

将自来水高压灭菌后加入不同浓度的活菌，同时加入高压灭活菌为干扰，用fMIPs进行吸附后，根据标准曲线计算出目标菌液滴度，结果如表2。经t检验fMIPs传感器测得细菌含量与平板涂布法之间的差异没有统计学意义，尚不能认为fMIPs传感器检测大肠杆菌的结果与平板涂布法有差异，亦可证明灭活菌对于活菌的检测几乎没有干扰。加标回收率为93.50％～102.20％。fMIPs可用于实际样品中细菌活性检测，不受样品中所存在的灭活细菌的影响。

表2实际水样检测结果

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)制备靶细胞的荧光分子印迹聚合物：

首先称取多巴胺和丹磺酰多巴胺，配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后将多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、靶细胞和载体混合均匀，以靶细胞为模板、丹磺酰多巴胺为荧光功能单体、多巴胺为功能单体，在载体表面进行聚合反应得到靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体；最后利用洗脱剂将靶细胞从靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体上洗脱下来，得到靶细胞的荧光分子印迹聚合物；

2)检测细菌或真菌活性：

向荧光分子印迹聚合物中加入细菌或真菌样品后即刻测定荧光值为I0，待细菌或真菌样品中的细菌或真菌与荧光分子印迹聚合物结合完全后，测定荧光值为I，I0/I-1表示荧光变化水平，通过荧光变化水平确定样品中是否含有靶细菌或靶真菌以及该靶细菌或靶真菌的含量；

所述步骤1)中载体为经聚多巴胺修饰后得到的多巴胺-载体复合体，所述多巴胺-载体复合体是通过将多巴胺和载体材料混合，并在过硫酸铵催化作用下，多巴胺在载体材料表面发生自聚合反应而制得。

2.根据权利要求1所述的细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：所述载体材料为纳米微球、微米微球或多孔板。

3.根据权利要求1所述的细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：所述靶细胞为靶细菌或靶真菌，所述靶细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，所述靶细菌的浓度为10⁴～10⁶CFU/mL。

4.根据权利要求3所述的细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌或蜡样芽孢杆菌；所述靶真菌为酵母菌。

5.根据权利要求1所述的细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中包括多巴胺、丹磺酰多巴胺和催化剂。

6.根据权利要求5所述的细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：所述催化剂为过硫酸铵。

7.根据权利要求6所述的细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中多巴胺、丹磺酰多巴胺、过硫酸铵的摩尔比为4:1:1。

8.根据权利要求1所述的细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：所述洗脱剂为去离子水。

9.一种如权利要求1所述细菌的活性快速检测方法在检测水样中细菌活性及其含量的应用。

Images