CN102516456A - 一种酵母菌表面原子转移印迹吸附剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境材料制备技术领域，特指一种酵母菌表面原子转移印迹吸附剂及其制备方法和应用。通过原子转移自由基聚合过程，首先在酵母菌表面载入引发剂，获得带有引发剂的基质材料，随后以头孢氨苄为模板分子，甲基丙稀酸（MAA）为功能单体，乙二醇二（甲基丙烯酸）酯（EGDMA）为交联剂，CuCl为催化剂，制备酵母菌表面印迹吸附剂。球形的印迹吸附剂有显著的热和磁稳定性。用紫外研究了模板分子和功能单体之间的作用，表明有作用力的存在。静态吸附实验用来研究了制备的印迹吸附剂的吸附平衡、动力学和选择性识别性能。结果表明利用本发明获得的酵母菌表面印迹吸附剂具有较高的吸附容量，快速的吸附动力学性质和明显的头孢氨苄分子识别性能。

Description

一种酵母菌表面原子转移印迹吸附剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及环境材料制备技术领域，特指一种酵母菌表面原子转移印迹吸附剂及其制备方法和应用。

背景技术

分子印迹技术是以目标待测物为模板分子,将具有结构上互补的功能化聚合物单体通过共价或非共价键与模板分子结合并，加入交联剂进行聚合反应，反应完成后将模板分子洗脱出来，形成的一种具有固定空穴大小和形状及有确定排列功能团的分子印迹聚合物(MIPs)的技术，表面印迹技术通过把分子识别位点建立在基质材料的表面，较好的解决了传统分子印迹技术整体还存在的一些严重缺陷，如活性位点包埋过深，传质和电荷传递的动力学速率慢，吸附-脱附的动力学性能不佳等，原子转移自由基聚合法是90年代以来最新发展的活性自由基聚合技术。它借鉴有机化学合成中原子转移自由基加成法生成碳-碳键的思路，利用卤原子在聚合物增长链与引发、催化体系之间的转移，即存在一个休眠自由基活性种和增长自由基活性种可逆的化学平衡，以达到延长自由基寿命、降低自由基活性种浓度，使链终止等副反应尽量减少，最终使聚合反应达到可控的目的，将原子转移自由基聚合法引入表面印迹的实验方法既解决了传统分子印迹技术整体存在的一些严重缺陷，又使聚合反应最终达到可控的目的。常用的基质材料有SiO₂和TiO₂等硅钛基微/纳米材料。

为了降低合成材料的成本以及提高材料的相容性，生物材料是理想的印迹基质材料，酵母菌作为一类廉价、易得、安全的工业微生物，其表面丰富的基团可提高与聚合物的稳定性，近期，我们原子转移的引发剂载在酵母菌表面，随后在其表面实施印迹聚合过程，目前用原子转移自由基聚合方法在酵母菌表面印迹获得印迹聚合吸附剂的研究尚未有报道。

头孢氨苄是头孢类抗生素，是广谱抗生素，广泛应用于用于敏感菌所致的呼吸道感染、泌尿道感染、妇产科感染、皮肤及软组织感染、淋病等疾病的治疗。医学研究表明，头孢氨苄有较强的副作用，所以，实时监测和分离去除环境水体中的抗生素类药物已是摆在我们面前刻不容缓的问题，考虑到合成的印迹聚合物对头孢氨苄具有选择识别性能，为分离体系中的头孢氨苄提供一类新方法，并不断在药物分离领域发挥不可替代的作用。

发明内容

本发明首先在酵母菌表面载入引发剂，获得带有引发剂的基质材料。随后以头孢氨苄为模板分子，甲基丙稀酸(MAA)为功能单体，乙二醇二(甲基丙烯酸)酯(EGDMA)为交联剂，CuCl为催化剂，通过原子转移自由基聚合过程，制备酵母菌表面印迹吸附剂，并将吸附剂用于水溶液中头孢氨苄抗生素的选择性识别和分离。

本发明采用的技术方案是：

（1）酵母菌表面载入引发剂的制备

 将酵母菌加入到按体积比为(10~100):10的氯化亚砜和苯的混合液中，其中酵母菌与混合液中的苯按质量与体积比为(0.1~2 g):10 mL加入，在65-85℃下反应20~30 h，用四氢呋喃洗涤三次，20~40 ℃真空烘干，取烘干的所得物分散在体积比为(25~45):1 的四氢呋喃和无水三乙胺混合溶液中，其中烘干所得物与无水三乙胺按质量与体积比为(0.1-2 g):1 mL，在冰浴中通氮气排空氧气后_，逐滴加入与无水三乙胺体积比为(0.5~2.5):1 的异丁酰溴，室温反应12~18 h，用乙醇洗涤三次，20~40 ℃真空烘干，得到的酵母菌引发剂。

（2）酵母菌表面印迹吸附剂(MIPs)的制备

将模板分子头孢氨苄加入到按体积比为1:(6-20) 的甲基丙稀酸与乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的混合溶液中，其中头孢氨苄与混合溶液中的甲基丙稀酸的质量比为(0.1~1.5):1，之后加入体积比为(3~6):1甲醇与蒸馏水的混合溶液中，其中蒸馏水与上述乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的体积比为(0.5~3.0):1，在氮气保护下加入酵母菌引发剂，酵母菌引发剂与上述乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的质量比为(0.1~1.5):1，室温搅拌0.5~2 h，形成预聚合溶液。

在预聚合溶液中，氮气保护下加入五甲基二乙烯三胺，加入的五甲基二乙烯三胺与上述甲基丙稀酸的物质的量的比为(0.01~0.15):1，随后加入氯化亚铜，氯化亚铜与五甲基二乙烯三胺的物质的量的比为(0.5~2.5):1，预聚合溶液在氮气保护下，15-35℃下反应10~18 h，最后产物用甲醇和醋酸的混合液为提取液索式提取48~60 h，甲醇和醋酸体积比为(75~95):10，脱除模板分子头孢氨苄，在40~60 ℃下真空干燥。

对应的非印迹吸附剂（NIPs）制备方法与上述相同，但不加模板分子头孢氨苄。

利用本发明采用表面原子转移分子印迹技术制备出的具有选择性识别作用的印迹聚合物，对头孢氨苄具有很好的吸附性能、选择性识别和富集性能。

    本发明的优点：利用原子转移自由基聚合反应合成表面分子印迹聚合物，自由基反应具有活性高，反应迅速、反应中副产物较少、所预测反应方向重现性好、产率高；利用表面官能团比较丰富的酵母菌作为印迹聚合反应的支架材料，酵母菌价格便宜，无毒，容易获得并且生物数量多，以及具有很好的生物相容性；通过一系列的吸附实验可证明分子印迹对模板分子即头孢氨苄有很好的选择识别性能。

附图说明

图1 为实施例1中的酵母菌（a），酵母菌-Cl（b），酵母菌-Br（c）和MIPs（d）的红外谱图，从图中可知酵母菌表面含有丰富的基团，从图中可知印迹聚合过程在酵母菌表面成功进行了；

图2 为实施例1中的酵母菌（a）和MIPs（b）的透射电镜图，从图中可以看出包覆在酵母菌表面印迹聚合物的包覆层厚度约为0.5微米；

图3 为实施例1中的酵母菌（a），MIPs（b）和NIPs（c）的热差和热重谱图；从图3中可以看出NIPs和MIPs在200℃以下有较好的热稳定性，并且洗过的印迹聚合物中还有残留的抗生素；

图4 为实施例2中的不同pH值对MIPs和NIPs吸附头孢氨苄的影响，以及吸附头孢氨苄前后介质pH值的变化图示，从图中可以看出，在pH =3.0–7.0区间，MIPs对头孢氨苄的吸附容量变化不大，在pH =3.0–8.0区间，NIPs对头孢氨苄的吸附容量变化也不大，随后MIPs和NIPs对头孢氨苄吸附容量急剧下降，且吸附前后介质pH值变化不大； .

图5 为实施例2中的甲基丙烯酸与头孢氨苄分别按摩尔比为2：1，4：1，8：1，12：1，15：1和30：1的混合水溶液的光谱图（5a），和甲基丙烯酸水溶液、头孢氨苄水溶液及其混合溶液的光谱图（5b），其中甲基丙烯酸的物质的量浓度是头孢氨苄物质的量浓度的15倍，从图5a可以看出，随着甲基丙烯酸的摩尔量的增加，头孢氨苄在215nm处的峰发生偏移并且峰的强度有所增加，从图5b可看出，摩尔比为15：1甲基丙烯酸与头孢氨苄混合水溶液的实际吸光度明显小于甲基丙烯酸水溶液与头孢氨苄水溶液的吸收光谱的理论加和值。

具体实施方式

本发明中具体实施方案中吸附性能评价：利用静态吸附实验完成，将10ml一定浓度的头孢氨苄溶液加入到比色管中，放在恒温水域中静置，考察吸附剂用量、溶液pH值、静置时间、温度对吸附剂吸附头孢氨苄分子的影响，吸附后，测试液中上层清液通过离心分离收集得到，未吸附的头孢氨苄分子浓度用紫外可见光谱测得，并根据结果计算出吸附容量(Q _e，mg/g)。

         （1）

其中C ₀ (mg/L) 和C _e (mg/L)分别是吸附前后头孢氨苄的浓度，W (g)为吸附剂用量，V (mL)为测试液体积。

下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。

实施例1：

（1）酵母菌表面载入引发剂的制备

 将酵母菌加入到按体积比为50:10（mL）的氯化亚砜和苯的混合液中，其中酵母菌与苯按质量与体积比为1 g:10 mL加入，在70℃下反应24 h，用四氢呋喃洗涤三次，25 ℃真空烘干，取烘干的所得物分散在体积比为30:1（mL）的四氢呋喃和无水三乙胺混合溶液中，其中烘干所得物与无水三乙胺按质量与体积比为1 g:1 mL，在冰浴中通氮气排空氧气后逐滴加入与无水三乙胺体积比为1:1（mL）的异丁酰溴，室温反应12 h，用乙醇洗涤三次，25 ℃真空烘干，得到的酵母菌引发剂。

（2）酵母菌表面印迹吸附剂(MIPs)的制备

将模板分子头孢氨苄加入到按体积比为1:10（mL）的甲基丙稀酸与乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的混合溶液中，其中头孢氨苄与甲基丙稀酸的质量比为0.25:1（g），之后加入体积比为4:1（mL）甲醇与蒸馏水的混合溶液中，其中蒸馏水与上述乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的体积比为1:1（mL），在氮气保护下加入酵母菌引发剂，酵母菌引发剂与上述乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的质量比为0.25:1（g），室温搅拌0.5 h，形成预聚合溶液。

在预聚合溶液中，氮气保护下加入五甲基二乙烯三胺，加入的五甲基二乙烯三胺与上述甲基丙稀酸的物质的量的比为0.03:1（mmol），随后加入氯化亚铜，氯化亚铜与五甲基二乙烯三胺的物质的量的比为1:1（mmol），预聚合溶液在氮气保护下25℃下反应12 h，最后产物用甲醇和醋酸的混合液为提取液索式提取48 h，甲醇和醋酸体积比为90:10（mL），脱除模板分子头孢氨苄，在60 ℃下真空干燥。

对应的非印迹吸附剂（NIPs）制备方法与上述相同，但不加模板分子头孢氨苄。

实施例2：

（1）酵母菌表面载入引发剂的制备

 将酵母菌加入到按体积比为100:10（mL）的氯化亚砜和苯的混合液中，其中酵母菌与苯按质量与体积比为1.5 g:10 mL加入，在80 ℃下反应28 h，用四氢呋喃洗涤三次，35 ℃真空烘干，取烘干的所得物分散在体积比为40:1（mL）的四氢呋喃和无水三乙胺混合溶液中，其中烘干所得物与无水三乙胺按质量与体积比为1.5 g:1 mL，在冰浴中通氮气排空氧气后_，逐滴加入与无水三乙胺体积比为2:1（mL）的异丁酰溴，室温反应16 h，用乙醇洗涤三次，40 ℃真空烘干，得到的酵母菌引发剂。

（2）酵母菌表面印迹吸附剂(MIPs)的制备

将模板分子头孢氨苄加入到按体积比为1:15（mL）的甲基丙稀酸与乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的混合溶液中，其中头孢氨苄与甲基丙稀酸的质量比为0.75:1（g），之后加入体积比为6:1（mL）甲醇与蒸馏水的混合溶液中，其中蒸馏水与上述乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的体积比为2.0:1（mL），在氮气保护下加入酵母菌引发剂，酵母菌引发剂与上述乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的质量比为1:1（g），室温搅拌1.5 h，形成预聚合溶液。

在预聚合溶液中，氮气保护下加入五甲基二乙烯三胺，加入的五甲基二乙烯三胺与上述甲基丙稀酸的物质的量的比为0.1:1（mmol），随后加入氯化亚铜，氯化亚铜与五甲基二乙烯三胺的物质的量的比为2:1（mmol），预聚合溶液在氮气保护下20 ℃下反应16 h，最后产物用甲醇和醋酸的混合液为提取液索式提取60 h，甲醇和醋酸体积比为80:10（mL），脱除模板分子头孢氨苄，在45 ℃下真空干燥。

对应的非印迹吸附剂（NIPs）制备方法与上述相同，但不加模板分子头孢氨苄。

试验例1：

按甲基丙烯酸与头孢氨苄分别按摩尔比为2：1，4：1，8：1，12：1，15：1和30：1加入到水溶液中形成混合水溶液，再制备甲基丙烯酸水溶液和头孢氨苄水溶液，其中甲基丙烯酸水溶液的物质的量浓度是头孢氨苄水溶液物质的量浓度的15倍，分别将上述的混合水溶液、甲基丙烯酸水溶液和头孢氨苄水溶液放在25 ℃的水浴中静置12 h后，用紫外光谱检测头孢氨苄峰和甲基丙烯酸峰的变化，从图5a可以看出随着甲基丙烯酸的摩尔量的增加，头孢氨苄在215nm处的峰发生偏移并且峰的强度有所增加，从图5b可看出摩尔比为15：1甲基丙烯酸与头孢氨苄混合水溶液的实际吸光度明显小于甲基丙烯酸水溶液与头孢氨苄水溶液的吸收光谱的理论加和值，结果表明，在水溶液中功能单体甲基丙烯酸与模板分子头孢氨苄之间存在着较强的相互作用。

试验例2：

取10ml初始浓度为10mg/l、20 mg/l、30 mg/l、50 mg/l、80 mg/l、100 mg/l、120 mg/l、150 mg/l、和200 mg/l的头孢氨苄溶液分别加入九个比色管中，用稀盐酸或稀氨水调节pH值为7.0，加入10mg实施例1制备的印迹吸附剂，另取10ml上述九个浓度的头孢氨苄溶液分别加入九个比色管中，用稀盐酸或稀氨水调节pH值为8.0，分别加入10mg实施例1制备的非印迹吸附剂，把所有测试液放在25℃的水浴中静置12h后，离心分离后收集上层清液，未吸附的头孢氨苄分子浓度用紫外可见光谱测定，并根据结果计算出吸附容量，印迹吸附剂在平衡浓度为130 mg/l时达到饱和，饱和吸附容量为68.36748 mg/g，非印迹吸附剂的在平衡浓度为80 mg/l时达到饱和，饱和吸附容量为20.08369 mg/g，结果表明，酵母菌表面印迹吸附剂比非印迹吸附剂达到饱和的平衡浓度大，并且印迹吸附剂的饱和吸附容量远高于非印迹吸附剂。

试验例3：

取10ml初始浓度为50mg/l头孢氨苄溶液加入到比色管中，用稀盐酸或稀氨水调节pH值为7.0，加入实施例2制备的10mg印迹吸附剂，把测试液放在25℃的水浴中分别静置5、10、20、40、60、120和180min，静置时间完成离心分离，收集上层清液，未吸附的头孢氨苄分子浓度用紫外可见光谱测定，并根据结果计算出t时间吸附容量进而分别根据假一级动力学方程（2）和假二级动力学方程（3）计算理论平衡吸附容量。

       （2）

             （3） 

其中Q _e (mg/g)代表理论平衡吸附容量，Q _t (mg/g)代表t时刻的吸附容量，是k ₁是假一级动力学吸附常数，k ₂是假二级动力学吸附常数。

根据理论平衡吸附容量与实际平衡吸附容量计算假一级动力学和假二级动力学平衡吸附容量的偏差R²，经计算得出印迹吸附剂的假一级动力学R²为0.9684，假二级动力学R²为0.9993，结果表明，假二级动力学比假一级动力学更适合印迹吸附剂对头孢氨苄的吸附过程，即化学吸附过程为吸附的决速度。

试验例4：

将头孢氨苄分别与四环素、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、芝麻酚和双酚A混合溶于水中；在上述两两混合水溶液中，头孢氨苄、四环素、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、芝麻酚和双酚A浓度都为20mg/l；分别考察上述二元体系的竞争吸附，取10ml上述的混合水溶液分别加入到五个比色管中，用稀盐酸或稀氨水调节pH值为7.0，分别加入实施例2制备的10mg印迹吸附剂，另取10ml上述的混合水溶液分别加入到五个比色管中，用稀盐酸或稀氨水调节pH值为和8.0，分别加入实施例2制备的10mg非印迹吸附剂，将全部测试液放在25℃的水浴中静置4.0h，静置时间完成后，离心分离后收集上层清液，未吸附的头孢氨苄浓度用紫外可见光谱测定；另配上述头孢氨苄、四环素、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、芝麻酚和双酚A的单独水溶液，浓度均为20mg/l，之后步骤同上，根据结果计算出吸附容量进而计算吸附率，二元体系吸附中印迹吸附剂吸附头孢氨苄的最大吸附率和最小吸附率为43%和36%，非印迹吸附剂吸附头孢氨苄的最大吸附率和最小吸附率为33%和20%，单组分中印迹吸附剂对头孢氨苄的吸附率最大，值为55%，非印迹吸附剂对头孢氨苄的吸附率为25%，结果表明，印迹吸附剂和非印迹吸附剂对头孢氨苄的吸附在二元体系或单组分体系中有一定的影响，主要受体系中其它分子的结构和官能团等影响，但是印迹吸附剂的吸附率始终高于非印迹吸附剂的。

Claims (3)

1.一种酵母菌表面原子转移印迹吸附剂，其特征在于采用如下方法制备：

（1）酵母菌表面载入引发剂的制备

 将酵母菌加入到按体积比为(10~100):10的氯化亚砜和苯的混合液中，其中酵母菌与混合液中的苯按质量与体积比为(0.1~2 g):10 mL加入，在65-85℃下反应20~30 h，用四氢呋喃洗涤三次，20~40 ℃真空烘干，取烘干的所得物分散在体积比为(25~45):1 的四氢呋喃和无水三乙胺混合溶液中，其中烘干所得物与无水三乙胺按质量与体积比为(0.1-2 g):1 mL，在冰浴中通氮气排空氧气后_，逐滴加入与无水三乙胺体积比为(0.5~2.5):1 的异丁酰溴，室温反应12~18 h，用乙醇洗涤三次，20~40 ℃真空烘干，得到的酵母菌引发剂；

（2）酵母菌表面印迹吸附剂(MIPs)的制备

将模板分子头孢氨苄加入到按体积比为1:(6-20) 的甲基丙稀酸与乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的混合溶液中，其中头孢氨苄与混合溶液中的甲基丙稀酸的质量比为(0.1~1.5):1，之后加入体积比为(3~6):1甲醇与蒸馏水的混合溶液中，其中蒸馏水与上述乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的体积比为(0.5~3.0):1，在氮气保护下加入酵母菌引发剂，酵母菌引发剂与上述乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的质量比为(0.1~1.5):1，室温搅拌0.5~2 h，形成预聚合溶液；

在预聚合溶液中，氮气保护下加入五甲基二乙烯三胺，加入的五甲基二乙烯三胺与上述甲基丙稀酸的物质的量的比为(0.01~0.15):1，随后加入氯化亚铜，氯化亚铜与五甲基二乙烯三胺的物质的量的比为(0.5~2.5):1，预聚合溶液在氮气保护下，15-35℃下反应10~18 h，最后产物用甲醇和醋酸的混合液为提取液索式提取48~60 h，甲醇和醋酸体积比为(75~95):10，脱除模板分子头孢氨苄，在40~60 ℃下真空干燥。

2.  如权利要求1所述的一种酵母菌表面原子转移印迹吸附剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）酵母菌表面载入引发剂的制备

 将酵母菌加入到按体积比为(10~100):10的氯化亚砜和苯的混合液中，其中酵母菌与混合液中的苯按质量与体积比为(0.1~2 g):10 mL加入，在65-85℃下反应20~30 h，用四氢呋喃洗涤三次，20~40 ℃真空烘干，取烘干的所得物分散在体积比为(25~45):1 的四氢呋喃和无水三乙胺混合溶液中，其中烘干所得物与无水三乙胺按质量与体积比为(0.1-2 g):1 mL，在冰浴中通氮气排空氧气后_，逐滴加入与无水三乙胺体积比为(0.5~2.5):1 的异丁酰溴，室温反应12~18 h，用乙醇洗涤三次，20~40 ℃真空烘干，得到的酵母菌引发剂；

（2）酵母菌表面印迹吸附剂(MIPs)的制备

将模板分子头孢氨苄加入到按体积比为1:(6-20) 的甲基丙稀酸与乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的混合溶液中，其中头孢氨苄与混合溶液中的甲基丙稀酸的质量比为(0.1~1.5):1，之后加入体积比为(3~6):1甲醇与蒸馏水的混合溶液中，其中蒸馏水与上述乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的体积比为(0.5~3.0):1，在氮气保护下加入酵母菌引发剂，酵母菌引发剂与上述乙二醇二(甲基丙烯酸)酯的质量比为(0.1~1.5):1，室温搅拌0.5~2 h，形成预聚合溶液；

在预聚合溶液中，氮气保护下加入五甲基二乙烯三胺，加入的五甲基二乙烯三胺与上述甲基丙稀酸的物质的量的比为(0.01~0.15):1，随后加入氯化亚铜，氯化亚铜与五甲基二乙烯三胺的物质的量的比为(0.5~2.5):1，预聚合溶液在氮气保护下，15-35℃下反应10~18 h，最后产物用甲醇和醋酸的混合液为提取液索式提取48~60 h，甲醇和醋酸体积比为(75~95):10，脱除模板分子头孢氨苄，在40~60 ℃下真空干燥。

3.如权利要求1所述的一种酵母菌表面原子转移印迹吸附剂在分离去除环境水体中的头孢氨苄中的应用。

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