CN102955012A

CN102955012A - 一种克伦特罗分子印迹整体柱的制备方法

Info

Publication number: CN102955012A
Application number: CN2012104155089A
Authority: CN
Inventors: 姜久英; 王海燕
Original assignee: JIANGSU YIPU TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU YIPU TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2013-03-06

Abstract

一种克伦特罗分子印迹整体柱的制备方法，将克伦特罗模板分子溶于甲醇中，加入功能单体甲基丙烯酸，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，十二醇或者1,4-丁二醇，超声混匀，再分别加入引发剂偶氮二异丁腈，催化剂CuBr和配体五甲基二乙烯三胺，再次超声混匀，通氮气除氧；混合液过滤，注入不锈钢色谱柱管中，用聚四氟封口，水浴聚合反应完成后，将色谱柱与高效液相色谱系统连接，充分洗脱色谱柱管，得到克伦特罗分子印迹整体柱。该整体柱用于固相萃取能有效的富集目标分析物,实现在线选择性萃取,同时除去其它杂质和干扰物,提高分析方法的效率。

Description

一种克伦特罗分子印迹整体柱的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及分子印迹整体柱的制备，特别涉及一种克伦特罗的分子印迹整体柱的制备方法。

背景技术

盐酸克伦特罗（Clenbuterol hydrochloride，CL）即瘦肉精，属于激素类药物，由于其具有持久松弛支气管平滑肌的功能，可用来治疗动物肺部疾病和人类哮喘；此外，也具有能量重分配、改变养分代谢途径等作用，因此被不法商贩用作饲料添加剂，促进动物生长，减少脂肪沉积，促进肌肉合成。然而盐酸克伦特罗具有较稳定的化学性质，在烹调过程中难以破坏，当人类食用残留盐酸克伦特罗过高的肉制品后可能会引发中毒，如：失眠、低磷酸盐血症、肌肉震颤、低血钾、心动过速等，甚至会引发死亡。

为了保证食品安全，监测是重要环节。激素类药物的分析国内外一般采用液相色谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用等方法。目前，常用的前处理手段主要有免疫亲和和固相萃取技术,之后结合液相色谱、气相色谱-质谱以及高效液相色谱-质谱进行测定。在肉制品盐酸克伦特罗的残留分析中,关键的一步是样品的分离、净化与富集。由于这些前处理方法比较复杂，需要大量的有机溶剂,耗时长，影响了对盐酸克伦特罗进行准确的定量分析。

利用分子印迹整体柱对克伦特罗的分子识别能力,能有效的富集目标分析物,实现在线选择性萃取,同时除去其它杂质和干扰物,提高分析方法的效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种克伦特罗分子印迹整体柱，用于肉制品中盐酸克伦特罗的富集。克伦特罗分子印迹整体柱的制备方法采用反向原子转移自由基聚合(reverse atom transfer radical polymerization，简称RATRP)法，以活性/可控的聚合方法制备克伦特罗分子印迹整体柱。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种克伦特罗分子印迹整体柱的制备方法，包括如下步骤：

1）、将克伦特罗模板分子溶于甲醇中，加入功能单体甲基丙烯酸，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，十二醇或者1,4-丁二醇，超声混匀，再分别加入引发剂偶氮二异丁腈(2,2'-azobisisobutyronitrile，简称AIBN)，催化剂CuBr和配体五甲基二乙烯三胺(Pentamethyldiethylenetriamine，简称PMDETA)，再次超声混匀，通氮气除氧；其中，克伦特罗：甲醇：甲基丙烯酸：乙二醇二甲基丙烯酸酯：偶氮二异丁腈：CuBr：五甲基二乙烯三胺的摩尔比为：0.18:6.68：0.7： 3.5：0.0039：0.0039：0.0078；

2)、将步骤1）中的混合液过滤，注入不锈钢色谱柱管中，用聚四氟封口，水浴60±5 ℃聚合反应24±1 小时；

3）、步骤2）聚合反应完成后，将色谱柱与高效液相色谱系统连接，在室温下依次以水/甲醇(90/10，v/v)和甲醇为流动相或者水/乙酸(90/10，v/v)和甲醇为流动相，以0.5~1.0mL/min的流速，充分洗脱色谱柱管，直至从色谱柱管中流出的洗脱液中没有模板分子克伦特罗为止，得到克伦特罗分子印迹整体柱。

采用的不锈钢色谱柱管规格为100×4.6 mm。

步骤2)中水浴温度为60 ℃。

有益效果：本发明提供一种克伦特罗分子印迹整体柱，用于肉制品中盐酸克伦特罗的富集，富集能力强，选择性高，分析速度快，使用寿命长。

附图说明

图1 克伦特罗印迹整体柱制备流程图。

图2为印迹整体柱对克伦特罗和类似化合物沙丁胺醇的分离效率图。

具体实施方式

实施例1、克伦特罗的预处理

将20.00mg盐酸克伦特罗（精确至0. 00001 g）溶于到100mL水溶液中，用氢氧化钠水溶液将溶液pH值调值为10-12，之后用等体积的三氯甲烷萃取两次。将三氯甲烷层蒸干，得到白色或近乎白色的克伦特罗结晶粉末。

实施例2、克伦特罗分子印迹整体柱的制备

克伦特罗分子印迹整体柱的制备：称取0.05克(0.18 毫摩尔)克伦特罗(模板分子)，加入甲醇0.27毫升，功能单体甲基丙烯酸0.06克(0.7 毫摩尔，功能单体)，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯0.7 克 (3.5 毫摩尔，交联剂)，1,4-丁二醇2.1 毫升。将混合溶液超声10 min使之混匀，再分别加入引发剂偶氮二异丁腈(2,2'-azobisisobutyronitrile，简称AIBN)0.0064克（0.0039毫摩尔），CuBr 0.0085克（0.0039毫摩尔）和五甲基二乙烯三胺(Pentamethyldiethylenetriamine，简称PMDETA) 0.0160克（0.0078毫摩尔），再次超声10 分钟，通氮气10分钟，溶液经微孔滤膜过滤，注入不锈钢色谱柱管(ACE3c18-AR 100×4.6 mm)中，用聚四氟封口，60 ℃水浴反应24小时。反应结束后，将色谱柱与高效液相色谱系统连接，在室温下，依次以水/乙酸(90/10，v/v)和甲醇为流动相，以0.5mL/min的流速将聚合物中的模板分子等物质洗去。所得色谱柱即为可作为固相萃取柱的克伦特罗分子印迹整体柱。

实施例3、克伦特罗分子印迹整体柱的制备

克伦特罗分子印迹整体柱的制备：称取0.05克(0.18 毫摩尔)克伦特罗(模板分子)，加入甲醇0.27毫升，功能单体甲基丙烯酸0.06克(0.7 毫摩尔，功能单体)，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯0.7 克 (3.5 毫摩尔，交联剂)，十二醇2.1 毫升。将混合溶液超声10 min使之混匀，再分别加入引发剂偶氮二异丁腈(2,2'-azobisisobutyronitrile，简称AIBN)0.0064克（0.0039毫摩尔），CuBr 0.0085克（0.0039毫摩尔）和五甲基二乙烯三胺(Pentamethyldiethylenetriamine，简称PMDETA) 0.0160克（0.0078毫摩尔），再次超声10 分钟，通氮气10分钟，溶液经微孔滤膜过滤，注入不锈钢色谱柱管（ACE3c18-AR 100×4.6 mm)中，用聚四氟封口，60 ℃水浴反应24小时。反应结束后，将色谱柱与高效液相色谱系统连接，并依次以水/甲醇(90/10，v/v)和甲醇为流动相，以1.0mL/min的流速，将聚合物中的模板分子等物质洗去。所得色谱柱即为可作为固相萃取柱的克伦特罗分子印迹整体柱。

实施例4、克伦特罗分子印迹整体柱的应用

以克伦特罗分子印迹整体柱作为固定相，利用高效液相色谱仪，在常温下，以HAc-NaAc缓冲溶液（pH 4.6）/CH₃OH（20/80，v/v）为流动相，以0.6-1.2mL/min的流速测定印迹整体柱对克伦特罗和类似化合物沙丁胺醇的分离效率，如图2所示，从图2中可以看出用该克伦特罗分子印迹整体柱对沙丁胺醇及克伦特罗进行分离，两者的分离峰不重叠，分离效果较好。

Claims

1.一种克伦特罗分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）、将克伦特罗模板分子溶于甲醇中，加入功能单体甲基丙烯酸，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，十二醇或者1,4-丁二醇，超声混匀，再分别加入引发剂偶氮二异丁腈，催化剂CuBr和配体五甲基二乙烯三胺，再次超声混匀，通氮气除氧；其中，克伦特罗：甲醇：甲基丙烯酸：乙二醇二甲基丙烯酸酯：偶氮二异丁腈：CuBr：五甲基二乙烯三胺的摩尔比为：0.18:6.68：0.7： 3.5：0.0039：0.0039：0.0078；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用的不锈钢色谱柱管规格为100×4.6 mm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于水浴温度为60 ℃。