CN104597178B - 一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱及其制备方法 - Google Patents
一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种3-甲基喹噁啉-2羧酸的免疫亲和柱及其制备方法。该免疫亲和柱由空柱管和琼脂糖凝胶组成，在所述的琼脂糖凝胶上偶联了保藏号为CCTCC？NO：C201147的杂交瘤细胞MQCA？GA/5B10分泌的3-甲基喹噁啉-2羧酸的单克隆抗体。本发明的免疫亲和柱能与3-甲基喹噁啉-2羧酸特异性结合，最大结合容量为240ngDMT。该免疫亲和柱主要用于动物性产品中的3-甲基喹噁啉-2羧酸的纯化，以便后期对样本中3-甲基喹噁啉-2羧酸含量进行高效液相色谱检测。
Description
技术领域
本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱及其制备方法。
背景技术
喹噁啉类作为养殖动物的药物添加剂，具有抗菌和促生长作用，且价格低廉，被广泛应用于生产之中。代谢研究表明，喹乙醇在动物体内迅速生成脱一氧和脱二氧产物等产物，可转化为3-甲基喹噁啉-2羧酸。3-甲基喹噁啉-2羧酸在动物体内消除最慢，被规定为喹乙醇的残留标示物。毒理学研究表明，喹乙醇有致癌、致畸等毒性，欧盟于1998年禁止其使用。中国允许喹乙醇用作育成猪饲料添加剂，规定肌肉和肝脏组织中3-甲基喹噁啉-2羧酸的最大残留限量为4μg/kg和50μg/kg。因此，建立简便、灵敏、符合国际最新规定的喹噁啉类残留分析方法十分必要。现有的检测3-甲基喹噁啉-2羧酸的方法主要是仪器分析，包括高效液相色谱法、液质联用(HPLC-MS)、气质联用(GC-MS)等。但要想使这些检测方法能达到理想的检测效果，则需将样品进行不同程度的前处理，因此实现具有快速、简便优点的样品前处理方法具有现实意义。目前样品前处理方法主要液液萃取方法和常规的固相萃取净化方法，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。免疫亲和色谱(IAC)是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。它的高度选择性和高亲和性无疑使分析过程简化。但用免疫亲和柱净化基质中的3-甲基喹噁啉-2羧酸未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱及其制备方法，为了克服现有样品前处理技术的缺陷，提供一种快速、简便的样品前处理方法。
一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱的制备方法，该方法的具体步骤为：
(1)基质制备：用适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B用ImM盐酸使其溶胀，然后抽滤，使用lmMHCl洗涤；
(2)偶联：预先将纯化好的由保藏号为CCTCCNO：C201147的杂交瘤细胞MQCAGA/5B10分泌的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体置于0.1MNaHC03(pH8.3)偶联缓冲液中透析，使用0.1MNaHC03(pH8.3)的偶联缓冲液洗涤溶涨后的经CNBr活化的Sepharose4B，洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose4B转移到抗体溶液中，混匀，室温下震荡充分反应4h；用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体，得到琼脂糖-单抗偶联复合物；
(3)封闭活性基团：将琼脂糖-单抗偶联复合物转入0.1MTris-HCl缓冲液中，4℃静止16h；
(4)洗涤：将步骤(3)得到的琼脂糖-单抗偶联复合物用5倍载体体积的pH4.0的含0.5MNaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍载体体积的pH8.0的含0.5MNaCl的0.1MTris-HCl缓冲液各淋洗一次，此洗涤过程重复三次；
(5)装柱：采用湿法装柱，将步骤(4)得到的琼脂糖-单抗偶联复合物填充入固相萃取空柱管中，用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01％NaN3-PBS过柱，并使用0.01％NaN3-PBS保存，即制成3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱；
(6)柱子再生：先用0.1M醋酸-醋酸钠，内含0.5MNaCl(pH4.0)缓冲液洗涤，接着再用0.1MTris-HCl(pH8.0，内含0.5MNaCl)缓冲液进行洗涤，洗涤至少3个循环。
本发明的免疫亲和柱能与3-甲基喹噁啉-2羧酸特异性结合，最大结合容量为240ngDMT。该免疫亲和柱主要用于动物性产品中的3-甲基喹噁啉-2羧酸的纯化，以便后期对样本中3-甲基喹噁啉-2羧酸含量进行高效液相色谱检测。
附图说明
图1：3-甲基喹噁啉-2羧酸标准溶液(40μg/L)液相色谱图。
图2：猪肌肉中添加3-甲基喹噁啉-2羧酸(4μg/kg)液相色谱图。
图3：猪肝脏中添加3-甲基喹噁啉-2羧酸(20μg/kg)液相色谱图。
具体实施方式
实施例1：一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱及其制备方法
一种检测3-甲基喹噁啉-2羧酸的免疫亲和柱，由空柱管和凝胶组成，凝胶上偶联了3-甲基喹噁啉-2羧酸的单克隆抗体。该免疫亲和柱按以下步骤制备：
(1)基质制备：将用适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B用ImM盐酸使其溶胀，然后抽滤，使用lmMHCl洗涤。
(2)偶联：预先将纯化好的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体(分泌3-甲基喹噁啉-2羧酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞MQCAGA/5B10，于2011年6月29日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：C201147。本发明的杂交瘤细胞MQCAGA/5B10的制备参照章谷生等.单克隆抗体在医学上的应用[M].上海科学技术出版社,1987；或参考华中农业大学授权专利，专利号201110036167X“一种甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒及应用”公开的方法，或者参考华中农业大学授权专利，专利号2013102142017“抗伏马菌素B1的单克隆重组抗体H7”报道的方法(其中包括缓冲液的制备))置于0.1MNaHC03pH8.3偶联缓冲液中透析。使用0.1MNaHC03pH8.3偶联缓冲液洗涤溶涨后的经CNBr活化的Sepharose4B，洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose4B转移到抗体溶液中，混匀，室温下震荡充分反应4h。用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体，得到琼脂糖-单抗偶联复合物。
(3)封闭活性基团：将琼脂糖-单抗偶联复合物转入0.1MTris-HCl缓冲液中，4℃静止16h，得到琼脂糖-单抗偶联复合物。
(4)洗涤：将步骤(3)得到的琼脂糖-单抗偶联复合物用5倍载体体积的pH4.0的含0.5MNaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍载体体积的pH8.0的含0.5MNaCl的0.1MTris-HCl缓冲液各淋洗一次，重复此洗涤过程三次，得到进一步处理的琼脂糖-单抗偶联复合物。
(5)装柱：采用湿法装柱，将步骤(4)所得的琼脂糖-单抗偶联复合物填充入固相萃取空柱管中，用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01％NaN3-PBS(磷酸盐缓冲液，按照常规方法配制)过柱，并使用0.01％NaN3-PBS保存，即制成3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱。
(6)柱子再生：先用0.1M醋酸-醋酸钠(pH4.0，内含0.5MNaCl)缓冲液洗涤，接着再用0.1MTris-HCl(pH8.0，内含0.5MNaCl)缓冲液进行洗涤，洗涤至少3个循环。
上述缓冲液都是本领域常用的缓冲液或购自商业公司或参照相关的教科书或已经公开的文献，例如华中农业大学授权专利，专利号ZL201110036167X“一种甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒及应用”，或者参考华中农业大学授权专利，专利号ZL2013102142017“抗伏马菌素B1的单克隆重组抗体H7”报道的方法方法。
实施例2：免疫亲和柱和高效液相色谱法测定3-甲基喹噁啉-2羧酸
(1)样品的提取和净化
分别取猪肌肉和猪肝组织样品匀浆物，猪肉和猪肝中分别添加3-甲基喹噁啉-2羧酸。样品采用1.5mol/LHCl和乙酸乙酯超声(按照常规方法)提取，氮气吹干后，用PBS缓冲液溶解残渣。将此溶解液过亲和柱，用PBS缓冲液淋洗亲和柱。用甲醇溶液洗脱，收集甲醇溶液(亲和柱要立即再生)，将甲醇溶液用氮气吹干，再用0.1％甲酸和乙腈溶液(20/80，V/V)溶解，待进行液相色谱测定。
(2)样本测定(技术条件)
色谱柱：ZorbaxEclipseXDBC18柱(250×4.6mm,5μm)；
流动相：0.1％甲酸和乙腈；
流速：1.0mL/min；
紫外检测器测定波长：320nm。
(3)检测结果
在猪肌肉中添加3-甲基喹噁啉-2羧酸浓度为4μg/kg～16μg/kg时，回收率为78.2％～90.6％，批间变异系数为6.8％～7.7％。在猪肝中添加3-甲基喹噁啉-2羧酸浓度为10μg/kg～100μg/kg时，回收率为82.2％～93.1％，批间变异系数为6.1％～8.5％。本方法在猪肌肉和猪肝中定量限分别为4μg/kg和10μg/kg。
从以上数据可以看出，采用本发明制备的3-甲基喹噁啉-2羧酸浓度免疫亲和柱，用于猪肌肉和猪肝样品中3-甲基喹噁啉-2羧酸的检测，添加回收率和变异系数能满足该药物残留检测要求。这表明本发明制备的免疫亲和柱性能稳定、结果可靠，完全，可以满足3-甲基喹噁啉-2羧酸的检测需要。
主要参考文献
1.章谷生等.单克隆抗体在医学上的应用[M].上海科学技术出版社,1987年版.
2.华中农业大学授权专利，金梅林等，专利号201110036167X“一种甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒及应用”，2011年.
3.华中农业大学授权专利，廖玉才等，专利号2013102142017“抗伏马菌素B1的单克隆重组抗体H7”，2013年。
Claims (2)
1.保藏编号为CCTCCNO：C201147的杂交瘤细胞MQCAGA/5B10在制备3-甲基喹噁啉-2羧酸的免疫亲和柱中的应用，其特征在于，所述的应用包括下列步骤：
(1)基质制备：用适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B用1mM盐酸使其溶胀，然后抽滤，使用lmMHCl洗涤；
(2)偶联：预先将纯化好的由保藏编号为CCTCCNO：C201147的杂交瘤细胞MQCAGA/5B10分泌的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体置于0.1M NaHCO3pH8.3的偶联缓冲液中透析，使用0.1M NaHCO3pH8.3的偶联缓冲液洗涤溶胀后经CNBr活化的Sepharose4B，洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose4B转移到抗体溶液中，混匀，室温下震荡充分反应4h；用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体，得到琼脂糖-单抗偶联复合物；
(3)封闭活性基团：将琼脂糖-单抗偶联复合物转入0.1MTris-HCl缓冲液中，4℃静止16h；
(4)洗涤：将步骤(3)所得的琼脂糖-单抗偶联复合物用5倍载体体积的pH4.0的含0.5MNaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍载体体积的pH8.0的含0.5MNaCl的0.1MTris-HCl缓冲液中各淋洗一次，重复此洗涤过程三次；
(5)装柱：采用湿法装柱，将步骤(4)所得的琼脂糖-单抗偶联复合物填充入固相萃取空柱管中，用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01％NaN3-PBS过柱，并使用0.01％NaN3-PBS保存，即制成3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱；
(6)柱子再生：先用内含0.5MNaCl的pH为4.0的0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤，接着再用pH为8.0，内含0.5MNaCl0.1MTris-HCl缓冲液进行洗涤，洗涤至少3个循环。
2.一种3-甲基喹噁啉-2羧酸的免疫亲和柱的制备方法，其特征在于下列步骤：
(1)基质制备：用适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B用1mM盐酸使其溶胀，然后抽滤，使用lmMHCl洗涤；
(2)偶联：预先将纯化好的由保藏编号为CCTCCNO：C201147的杂交瘤细胞MQCAGA/5B10分泌的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体置于0.1M NaHCO3pH8.3的偶联缓冲液中透析，使用0.1M NaHCO3pH8.3的偶联缓冲液洗涤溶胀后经CNBr活化的Sepharose4B，洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose4B转移到抗体溶液中，混匀，室温下震荡充分反应4h；用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体，得到琼脂糖-单抗偶联复合物；
(3)封闭活性基团：将琼脂糖-单抗偶联复合物转入0.1MTris-HCl缓冲液中，4℃静止16h；
(4)洗涤：将步骤(3)所得的琼脂糖-单抗偶联复合物用5倍载体体积的pH4.0的含0.5MNaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍载体体积的pH8.0的含0.5MNaCl的0.1MTris-HCl缓冲液中各淋洗一次，重复此洗涤过程三次；
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