CN102585005A - 用于检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)的特异性单克隆抗体，本发明的单克隆抗体是由杂交瘤细胞MQCAG GA/5B10所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201147。本发明还公开了特异性单克隆抗体、包被原、免疫原的制备方法和酶联免疫检测方法及试剂盒。与现有技术相比，本发明首次制备得到可识别MQCA的单克隆抗体，检测过程中的样品处理方法更加简便，易操作，具有检测灵敏度高、精密度强、准确性好等优点。

Description

用于检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明涉及一种能识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)的单克隆抗体和一种用于检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫方法(ELISA)及试剂盒。

背景技术

喹乙醇是喹噁啉-N-1，4-二氧化物衍生物，化学名称是N-羟乙基-3-甲基-2-喹啉酰胺-1，4-二氧化物，具有抗菌促生长作用，广泛应用于畜牧业。毒理学研究表明，喹乙醇具有致突变、致畸和致癌性，对人和动物均能引起光敏反应。食品添加剂联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA)第36届会议对喹乙醇的代谢途径进行了全面评价，结果表明，给药48小时后，约95％的药物随尿液和粪便排出体外，在8～20天，肌肉中MQCA的含量约占总残留的25％。在此次会议上，JECFA规定MQCA为喹乙醇在动物体内代谢的残留标示物，在肌肉中的最高残留限量(MRLs)为4μg/kg。我国规定喹乙醇残留标示物MQCA的最大残留限量在猪肝脏为50μg/kg，肌肉为4μg/kg。

目前，国内外关于动物组织中MQCA的检测方法很多，主要是高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等仪器分析方法，关于免疫学检测方法报道很少。Chen W等(Chen W，Jiang Y，Zhu C Q，et al.Automated and ultrasensitivedetection of methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid by using gold nanoparticlesprobes SIA-rt-PCR.Biosensors and Bioelectronics，2009，24：2858-2863)报道了一种用间接竞争ELISA联合RT-PCR序列分析技术检测MQCA的方法，该方法灵敏度很高，在2.5aM-250fM范围内有很好的线性关系，最低定量限1.4aM，回收率89-108％，但是，该方法操作复杂，所需仪器设备成本较高。中国专利ZL 200610164836.0公开了一种用于3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的酶联免疫检测方法及试剂盒，该方法及试剂盒用3-甲基喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联得到的免疫原免疫家兔得到特异性兔多克隆抗体，此抗体能特异性识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸与苯胺的反应产物，对3-甲基喹噁啉-2-羧酸原型并不能识别，因此，应用该试剂盒进行实际样品检测时，必须有一个样品衍生的过程，大大增加了检测时间和操作的复杂性，此外，该试剂盒使用的是兔多克隆抗体，不同批次的多克隆抗体的变异较大，不利于试剂盒的规模化生产与应用。相对于多克隆抗体，单克隆抗体具有特异性好，灵敏度高，批间差异小，便于规模化生产等优点。

因此，制备出针对MQCA原型的特异性单克隆抗体，建立基于MQCA单克隆抗体的ELISA检测方法及试剂盒具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能特异性识别MQCA的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，建立一种能检测MQCA的酶联免疫方法。

本发明的第三个目的是研制适用于MQCA检测的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供所述的单克隆抗体在制备检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供含有所述单克隆抗体的试剂盒在动物组织3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留检测中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种能识别MQCA的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10所分泌的。

上述杂交瘤细胞MQCA GA/5B10，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C201147。

所用的免疫原是由半抗原MQCA与牛血清白蛋白偶联制备得到的。

进一步，本发明提出了一种适用于MQCA残留检测的酶联免疫方法，该方法包括免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤，具体如下：

(1)将半抗原MQCA与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原；

(2)将半抗原MQCA与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原；

(3)用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO：C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10；

(4)用保藏号为CCTCC NO：C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10制备单克隆抗体；

(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体(如酶标板)；

(6)将待测样品先用含10％偏磷酸的5％甲醇溶液提取，再用乙酸乙酯萃取，然后用饱和食盐水洗涤乙酸乙酯，取乙酸乙酯用氮气吹干，残渣用样品稀释液溶解，得到待测物；

(7)对步骤(6)的待测物进行酶联免疫检测；

步骤(6)中所述样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.0g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g，加双蒸水定容至1000mL。

本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测MQCA的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对MQCA的酶联免疫检测。

本发明的有益效果是：

(1)本发明制备的单克隆抗体能够特异性识别MQCA原型，而专利ZL200610164836.0只能识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸与苯胺的反应产物，与专利ZL200610164836.0公开的抗体相比，本发明的抗体特异性更强，批间差异更小，更适于批量生产。

(2)检测过程中的样品处理方法简便，易操作，与专利ZL200610164836.0报道的样品处理过程相比，减少了衍生处理的过程，操作更简便。

(3)本发明的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度高、精密度好、准确性好。

附图说明

图1为本发明的技术路线图。

图2为本发明MQCA残留ELISA检测方法标准曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1免疫原和包被原的制备

免疫原的制备：准确称取MQCA 20.00mg，完全溶解在N，N-二甲基甲酰胺1mL中，为A液。准确称取BSA 70.00mg，使其充分溶解在磷酸盐缓冲液(pH7.4)10mL中，为B液。磁力搅拌条件下，将A液逐滴加入到B液中，待两者混合均匀后，缓慢滴加25％戊二醛溶液(GA)0.1mL，反应4小时。之后将反应液转入透析袋中，4℃生理盐水中透析3天，每天更换透析液3次。6000r/分钟离心5分钟，取上清液冷冻干燥，即得偶联物MQCA-GA-BSA，置-20℃保存，作为免疫原用。

包被原的制备：依据免疫原制备程序，将BSA换成OVA，即得偶联物MQCA-GA-OVA，作为包被原用。

实施例2 单克隆抗体的制备

杂交瘤细胞的制备：参照薛庆善《体外培养的原理与技术》(科学出版社2001年版)中的方法：以实施例1制备的偶联物MQCA-GA-BSA为免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠。免疫程序采用一次基础免疫及数次加强免疫。首次免疫时用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下进行基础免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠(效价高、灵敏度好)停止免疫以备融合。

在融合前3天(最好与上次免疫相隔3周以上)给免疫合格的小鼠腹腔注射含100μg免疫原的蛋白溶液(不加佐剂)，强化免疫。根据骨髓瘤细胞的计数结果，取3～5×10⁷个骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合(比例为1∶10～5∶10)。1500r/分钟离心5分钟，将离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上，控干水滴。轻轻地敲击管底，使管底细胞成糊状，将其放置于37℃水浴中，将吸有0.8mL预温至37℃的50％PEG(购自Amersco)的1mL刻度吸管插入到管底，60秒内缓缓加PEG到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置90秒，将离心管插到离心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取10mL预温至37℃的RPMI 1640基础培养液(购自Hyclone)沿管壁缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻晃动离心管，第1分钟逐滴加入1mL(3sec/滴)，第2分钟再加2mL，最后加完剩下的7mL(5分钟内加完)。加完第一个10mL后，接着沿管壁补加RPMI 1640培养基至50mL，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀。1500r/分钟离心5分钟，弃去上清，用含有饲养细胞的72mL HAT完全培养基(购自Amersco)轻轻将融合细胞搅拌重悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，2滴/孔。一次融合可接种5块96孔细胞培养板，置于37℃ 5％CO₂培养箱中培养。

从融合当天算起为0天，前面3天尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3天每孔补加1滴HAT完全培养基并观察集落生长情况；第5天每孔吸出1/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基(购自Amersco)；以后每隔3天同上法吸去1/2培养上清，换入HT完全培养基。根据细胞的生长情况，当细胞生长至占孔底面积1/4左右即可取细胞培养上清，以发明人制备的偶联物MQCA-GA-OVA为包被原，利用ELISA方法筛选出分泌MQCA抗体的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀释法连续3次克隆化，最终建立一株稳定分泌MQCA抗体的杂交瘤细胞。对该杂交瘤细胞进行染色体计数，平均值为101.3条，高于亲本细胞的染色体数目(SP2/0骨髓瘤细胞的染色体平均数为58条，脾细胞染色体为40条)，说明融合细胞的确是SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交产物。申请人将该杂交瘤细胞命名为MQCA GA/5B10，并于2011年6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：C201147。

腹水单抗制备与鉴定：在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI 1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC NO：C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10扩大培养的细胞，并将细胞数调至1×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。按照文献方法(朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京：人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG1亚型。

实施例3 间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1 试剂配制

碳酸盐缓冲液(pH9.6)：准确称取Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

洗涤液(pH 7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，加入吐温200.50mL，定容至1000mL。

磷酸盐缓冲液(pH 7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

封闭液：准确称取卵清蛋白10.00g，加入磷酸盐缓冲液1000mL，搅拌混匀直至蛋白完全溶解。

底物混合液：准确吸取底物B液(购自武汉市飞远科技有限公司)10mL，加入100μL底物A液(购自武汉市飞远科技有限公司)，混匀，现配现用。

终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中。

3.2 方阵滴定法

采用方阵滴定法初步选择包被原浓度和抗体稀释度。使用碳酸盐缓冲液将包被原MQCA-GA-OVA倍比稀释成8、4、2、1、0.5μg/mL，从第一至第五行依次横向加入96孔酶标板，包被。使用磷酸盐缓冲液将单克隆抗体倍比稀释成1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000、1∶256000，从第一至第六列依次纵向加入96孔酶标板，做间接ELISA。方阵滴定结果见表1，初步选择几个OD值接近2.0，且相邻两孔OD值有较大变化的包被浓度及对应的抗体稀释度组合。从表1中选择以下包被原浓度和抗体稀释度组合：(2，64000)，(1，32000)和(0.5，8000)。

表1 MQCA GA/5B10单克隆抗体方阵滴定

3.3 最佳包被浓度的选择

以MQCA为竞争物，将浓度调整为0、4、8、16、32、64μg/L，分别以3.2方阵滴定法选择的包被浓度及对应的抗体稀释度组合，做间接竞争ELISA。以竞争物浓度的对数值作为横坐标、B/B0(以“0”药物孔的OD值为B0，相应浓度药物的OD值为B值)作为纵坐标，绘制抑制曲线。以IC₅₀值作为判定指标，确定最佳包被原浓度，结果见表2，最佳包被浓度为1μg/mL，抗体稀释度初步确定为1∶32000。

表2 最佳包被浓度优化

包被浓度(μg/mL)	抗体稀释度	IC50(μg/L)
			0.5	8000	30.06
1	32000	15.94
			2	64000	17.3

3.4 最佳抗体稀释度的选择

以最佳包被浓度包被酶标板，将抗体以1∶32000为中心浓度等差设计4个稀释梯度，其“0”孔与IC₅₀值见表3。抗体稀释度为32000时，IC₅₀值较低，并且其“0”孔OD值较好，因此选择1∶32000为最佳抗体稀释度。

表3 最佳抗体稀释度优化

抗体稀释度	“0”孔OD值	IC50(μg/L)
			28000	2.17	19.00
32000	1.92	15.09
			36000	1.72	14.14
40000	1.62	15.92

3.5 标准曲线的建立

将MQCA标准品配制成0、4、8、16、32、64μg/L等6个浓度梯度，每个浓度5个平行孔，做间接竞争ELISA，绘制标准曲线，重复测定5次。如附图2所示，本发明间接竞争ELISA检测方法的回归方程和相关指数为：y＝-0.4683x+1.0685，R²＝0.9977，其中IC₅₀是17.69±0.10μg/L，线性范围为4～64μg/L。

3.6 交叉反应率测定

分别将喹乙醇，脱二氧喹乙醇，乙酰甲喹，脱二氧乙酰甲喹，喹烯酮，脱二氧喹烯酮，喹赛多，脱二氧喹赛多等倍比稀释成梯度浓度，按所建立的间接竞争ELISA方法，测定其IC₅₀值，与MQCA标准品IC₅₀值对比得到交叉反应率，结果见表4，本研究建立的间接竞争ELISA方法对其他喹噁啉药物均无交叉反应，特异性较好。

表4 MQCA残留ELISA检测方法的特异性

竞争物	IC50(μg/L)	交叉反应率(％)
			MQCA	17.69	100
QCA	2380.58	0.74
			喹乙醇	＞10000	＜0.2
脱二氧喹乙醇	＞10000	＜0.2
			喹烯酮	＞10000	＜0.2
脱二氧喹烯酮	＞10000	＜0.2

乙酰甲喹	＞10000	＜0.2
			脱二氧乙酰甲喹	＞10000	＜0.2
喹赛多	＞10000	＜0.2
			脱二氧喹赛多	＞10000	＜0.2

实施例4 本发明ELISA检测试剂盒的组装

4.1 试剂盒组成成分

(1)包被有包被原MQCA-GA-OVA的酶标板；

(2)MQCA标准品溶液6瓶，浓度分别为0、4、8、16、32、64μg/L；

(3)MQCA GA/5B10细胞株单克隆抗体工作液；

(4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

(5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.00g，KH₂PO₄ 2.00g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.00g，KCl 2.00g，加双蒸水至1000mL；

(6)浓缩洗涤液：NaCl 80.00g，KH₂PO₄ 2.00g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.00g，KCl2.00g，吐温20 5mL，加双蒸水至1000mL

(7)底物混合液：准确吸取底物B液(购自武汉市飞远科技有限公司)10mL，加入100μL底物A液(购自武汉市飞远科技有限公司)，混匀，现配现用。

(9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2 酶标板制备

(1)包被：用碳酸盐缓冲液将MQCA-GA-OVA稀释成1μg/mL，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12小时。

(2)洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30秒后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤3次，拍干。

(3)封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2小时。

(4)洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30秒后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次，拍干。

(5)烘干：将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5小时。

(6)封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。

实施例5本发明的酶联免疫试剂盒的测定程序

5.1 试剂配制

洗涤液配制：NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，吐温20 0.5mL，加双蒸水至1000mL

样品稀释液配制：准确称取NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g加少量超纯水溶解，双蒸水定容至1000mL。

含10％偏磷酸的5％甲醇溶液配制：称取偏磷酸100g，用热水搅拌使其溶解，冷却至室温，加入50mL甲醇，用超纯水定容至1000mL。

底物混合液配制：根据每次所需用量，取适量的底物A液与B液按1∶100的比例混匀，现配现用。

5.2 猪肌肉和肝脏组织样品处理

称取匀质样品2.00±0.02g于50mL离心管中，加入含10％偏磷酸的5％甲醇溶液10mL，漩涡混合2分钟，4000r/分钟离心10分钟，将上清转入到另一50mL离心管中，重复提取一次，合并上清；之后在上清中加入乙酸乙酯10mL，漩涡混合2分钟，4000r/分钟离心5分钟，取上层乙酸乙酯于另一50mL离心管中，重复萃取一次，合并乙酸乙酯层；并加入饱和食盐水10mL，漩涡混合2分钟，4000r/分钟离心5分钟，取乙酸乙酯10mL，氮气吹干，肌肉样品加入样品稀释液0.5mL，肝脏样品加入样品稀释液1mL，漩涡2分钟溶解，取样检测。

注：本方法对猪肌肉的稀释倍数是0.5，猪肝的稀释倍数是1。

5.3 ELISA测定程序

(1)取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架。

(2)加MQCA标准品溶液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行，记录下标准品和样品的位置。加MQCA GA/5B10细胞株单克隆抗体工作液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育30分钟。

(3)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干，准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤3次。

(4)加辣根过氧化物酶(HR)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育30分钟。

(5)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干，准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤3次。

(6)加底物混合液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育15分钟。

(7)加终止液50μL至各孔；30分钟内在450nm处测量吸光值。

5.4 结果判定

将标准品溶液或样品液吸光值的平均值除以“0”标准孔的吸光值再乘以100％，即为抑制率。在4-64μg/L范围内，以抑制率为纵坐标，标准品溶液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。按照公式1计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以相应的稀释倍数，即为样品中MQCA的残留浓度。

实施例6 本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度

6.1 本发明试剂盒的灵敏度

以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。取20份空白组织样品，经样品处理后，测定OD值，计算空白样品OD值的平均值

将

代入标准曲线上查出对应的浓度(C)，并计算标准差(SD)。根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，此即为组织方法的最低检测限(LOD)，结果见表5。

表5 MQCA在猪肌肉和肝脏组织样品中的最低检测限

6.2 本发明试剂盒的精密度实验

将MQCA标准品稀释成0、4、8、16、32、64μg/L 6个浓度，各浓度5个平行孔，重复测定5次，将各标准品浓度对应的OD值代入其标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，并且计算板内板间变异系数，结果见表6，可知批内和批间变异系数都＜15％，说明此试剂盒的精密度较好。

表6 标准曲线的板内与板间变异系数

6.3 本发明试剂盒的准确度

用添加回收率反映试剂盒的准确度。在匀质好的猪肌肉中加入MQCA标准溶液，使其终浓度分别为4或8μg/kg；猪肝脏组织中分别添加为10或50μg/kg。每个浓度5个平行样，经过样品处理，测定MQCA的浓度，重复3批，按公式2计算回收率，同时进行计算批内和批间变异系数，结果见表7～8，回收率较好，说明此试剂盒的准确度较好。

表7 猪肌肉中MQCA添加回收率与变异系数

表8 猪肝脏中MQCA添加回收率与变异系数

Claims (7)

1.一种能识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO：C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10所分泌的。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201147。

3.包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒是检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫试剂盒。

5.一种检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫方法，包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测，其步骤如下：

(1)将半抗原3-甲基喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；

(2)将半抗原3-甲基喹噁啉-2-羧酸与卵清蛋白偶联得到包被原；

(3)用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO：C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10；

(4)用保藏号为CCTCC NO：C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10制备单克隆抗体；

(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；

(6)将待测样品先用含10％偏磷酸的5％甲醇溶液提取，再用乙酸乙酯萃取，然后用饱和食盐水洗涤乙酸乙酯，取乙酸乙酯用氮气吹干，残渣用样品稀释液溶解，得到待测物；

(7)对步骤(6)的待测物进行酶联免疫检测，

其中：

样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.0g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O2.9g、KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL。

6.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫试剂盒中的应用。

7.权利要求3或4所述的试剂盒在动物组织3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留检测中的应用。

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