CN1963507A - 3－甲基喹噁啉－2－羧酸残留的酶联免疫检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫化学分析技术领域。公开了一种用于3－甲基喹∴啉－2－羧酸残留的酶联免疫检测方法及试剂盒。本发明的方法主要包括免疫原、包被原和特异抗体的制备、样品前处理和ELISA方法的建立。与之相配套的试剂盒由3－甲基喹∴啉－2－羧酸(MQCA)特异性抗体、包被有MQCA与卵清蛋白偶联物的酶标板以及MQCA标准品等组成。样品经偏磷酸水解处理，释放MQCA，MAX柱净化，苯胺衍生处理及间接竞争ELISA方法测定。本发明的方法及试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等优点，能同时快速检测大批样品，组织最低检测限为0.6μg/kg。
Description
技术领域
本发明属于免疫化学分析技术领域，具体涉及一种用于3-甲基喹噁啉-2-羧酸(简称MQCA，下同)残留的酶联免疫检测方法及试剂盒，适用于测定动物性食品中喹乙醇残留标示物MQCA的残留量。
背景技术
喹乙醇又名喹酰胺醇、喹奥多斯、倍育诺，属于喹噁啉-1，4-二氧化物类药物，为人工合成的广谱抗菌药，曾作为促生长剂广泛应用于畜、禽、水产养殖中。毒理学研究发现，喹乙醇具有致癌和致突变性。喹乙醇在动物体内很快被代谢，MQCA最后离开机体，被视为喹乙醇的残留标示物。所以分析喹乙醇残留通常分析其残留标示物MQCA。MQCA的最大残留限量在猪肝脏为50μg/kg，肌肉为4μg/kg，在无公害食品、畜禽水产品中喹乙醇规定为不得检出。目前检测MQCA残留的方法有高效液相色谱法(HPLC)和液质串联质谱法(LC-MS/MS)。
HPLC和LC-MS/MS法虽然灵敏，但所需仪器价格昂贵，对操作人员的要求较高，难于推广，不适合高通量的样品筛选。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术(ELISA)具有快速、灵敏度高、操作简单、专一性好等优点，适合高通量的样品筛选。目前国内外均未见MQCA残留酶联免疫吸附分析技术的专利和文献报道。
发明内容
本发明的第1个目的是提供一种3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)残留的酶联免疫检测方法。
本发明的第2个目的是提供一种3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的酶联免疫检测试剂盒。
本发明的方法和试剂盒专用于动物可食性组织中MQCA残留的酶联免疫检测，与现有方法相比，本发明的方法和试剂盒具有灵敏度高，检测快速，使用方便和检测成本较低等突出优点。
本发明的技术方案是：
一种3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的酶联免疫检测方法，包括免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的前处理，其步骤如下：
(1)将3-甲基喹噁啉-2-羧酸与卵清蛋白相偶联得到包被原；
(2)将3-甲基喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白相偶联得到免疫原；
(3)用步骤(2)的免疫原免疫兔得到特异性兔多克隆抗体；
(4)用步骤(1)的包被原包被固相载体；
(5)将所述的样品先经酸解提取后再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；
(6)将步骤(5)的待测产物进行酶联免疫检测。
其中，所述的固相载体是酶标板。例如可以采用48或96孔酶标板作固相载体。
所述的衍生试剂是苯胺。
所述的催化剂为腈基磷酸二乙酯。
一种基于上述方法的酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，包被有所述的包被原；所述的试剂包括抗3-甲基喹噁啉-2-羧酸特异性兔多克隆抗体，辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体，浓缩洗涤液，浓缩样品稀释液，3-甲基喹噁啉-2-羧酸标准溶液，底物显色A液，底物显色B液，终止液，衍生试剂和催化剂。
其中：
所述的底物显色A液为四甲基联苯胺或邻苯二胺。
所述底物显色B液为过氧化氢或过氧化脲。
所述终止液为硫酸溶液或盐酸溶液。
所述的浓缩洗涤液为含有0.05～0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBS)。
所述浓缩样品稀释溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
本发明所提供的酶联免疫方法及试剂盒采用间接竞争ELISA法，定性或定量检测动物可食性组织如肝、肌肉中MQCA残留。其采用高特异性的MQCA多克隆抗体，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，检测范围较宽，假阳性率低，检测结果可靠、准确，组织最低检测限为0.6μg/kg，适用于食品动物的可食性组织如肌肉、肝脏中MQCA残留检测；可以在较短时间内检测大量样品，排除大量阴性样品。由于样品处理既简单、省时、省力，检测又无需昂贵的仪器设备，所以比较适合在基层检验检疫单位推广使用。
附图说明
图1是本发明的抗原合成路线。
图2是本发明免疫原紫外图谱。
图3是本发明MQCA抗体与MQCA标准品的间接竞争反应曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1、抗原的制备
本发明的抗原制备包括免疫原和包被原的制备，其具体合成路线如图1所示。
1.1免疫原的制备
取3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)0.0376g，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.0116g，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)0.0434g加入到1.5mL 1，4-二氧六环中室温搅拌反应过夜；离心除去沉淀，上清再与5mL牛血清白蛋白(BSA)0.34g溶液4℃搅拌反应过夜；离心，上清液用PBS0.1mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液，透析3天后，冻干，置4℃保存备用。所得免疫原的紫外图谱如图2所示。
1.2包被原的制备
取3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)0.0376g，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.0116g，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)0.0434g加入到1.5mL 1，4-二氧六环中室温搅拌反应过夜；离心除去沉淀，上清再与5mL卵清蛋白(OVA)(0.18g)溶液4℃搅拌反应过夜；离心，上清液用0.1mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液透析3天后，冻干，置4℃保存备用。
实施例2、抗体的制备
2.1免疫动物
采用新西兰大白兔作为免疫动物，以MQCA与BSA偶联物为免疫原，免疫剂量为0.5～1mg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，在新西兰大白兔颈背部皮下多点注射，间隔2～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，免疫期间要监测血清抗体效价及特异性，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7～10d后采血，颈动脉放血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的MQCA多克隆抗体。
2.2抗体纯化
采用辛酸-硫酸铵盐析法纯化抗体。取兔血清5mL，加入0.06mol/L乙酸缓冲液(pH 5.0)15mL，用0.1mol/LHCL调pH至4.5；室温下加入辛酸165μL，搅拌30min；10000r/min 4℃离心30min，弃沉淀。用0.1mol/LNaOH调上清液pH至7.4；缓慢滴加等体积饱和硫酸铵溶液，搅拌20min，10000r/min4℃离心30min，弃上清液。将沉淀用少量0.01mol/L pH 7.2 PBS溶解；对0.01mol/L PBS(pH 7.2)透析过夜。将纯化的抗体分装小瓶，置-20℃冰箱保存。
2.3抗体效价
采用间接ELISA方法对免疫后不同时期的抗体的效价进行监测，以OD值达到1.0左右时判定为阳性。结果抗体的效价为1∶1.6×105。
2.4抗体特异性
抗体的特异性用交叉反应率来表示，将一系列与MQCA结构相似或与BSA交联相关的化合物，通过间接竞争ELISA步骤，计算交叉反应率(表1)。
表1本发明抗体的特异性
| 化合物 | CR50(％) |
| MQCAQCA脱二氧喹乙醇脱二氧喹烯酮喹乙醇喹烯酮卡巴氧对氨基苯甲酸γ-氨基丁酸 | 1006.84417.3367.07.787.64＜0.01＜0.01＜0.01 |
由表1中可以看出，该抗体对QCA、喹乙醇和喹烯酮也有一定的交叉反应，但对卡巴氧、氨基苯甲酸、γ-氨基丁酸无交叉反应。
2.5抗体的稳定性
按照间接ELISA方法，在不同时间测定抗体的效价，以研究抗体的稳定性，结果见表2，可以看出该抗体在-20℃至少可以保存3个月其效价不变。
表2本发明抗体的稳定性
| 抗体稀释倍数(×104) | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 |
| 15d30d45d60d75d90d | 2.9042.9742.5262.2972.3822.440 | 2.8572.8392.4862.1672.4952.424 | 2.6892.6471.9001.5401.8361.845 | 2.3152.2751.8231.6971.9681.741 | 1.7951.6821.2621.1021.2321.072 | 1.2451.0871.2421.0901.1751.066 | 0.7270.6760.8570.7870.8000.829 |
实施例3、样品前处理方法的建立
提取：准确称取猪肌肉组织5g置于具塞离心管中，加5％偏磷酸20％甲醇溶液8mL，旋涡混合2min，在25℃下6000r/min离心15min，取出上清液，然后再向组织样品中加5％偏磷酸20％甲醇溶液8mL重复提取一次，合并2次上清液。于上清液中加乙酸乙酯8mL，旋涡混合1min，4000r/min离心10min，取有机相层，再加乙酸乙酯8mL重复提取，合并2次有机相。有机相中，加磷酸盐缓冲液6mL，旋涡混和1min，放置10min，使下层清晰，收集水相。另用磷酸盐缓冲液6mL提取乙酸乙酯相一次。使水相清晰，合并2次水提取液。
准确称取猪肝脏样品2g置于具塞离心管中，加5％偏磷酸20％甲醇溶液6mL，旋涡混合2min，在25℃下6000r/min离心15min，取出上清液，然后再向组织样品中加5％偏磷酸20％甲醇溶液8mL重复提取一次，合并2次上清液。于上清液中加乙酸乙酯8mL，旋涡混合1min，4000r/min离心10min，取有机相层，再加乙酸乙酯6mL重复提取，合并2次有机相。其余步骤同肌肉样品处理方法。
净化：MAX柱依次用甲醇3mL、水3mL活化。加样品提取液至MAX柱中，控制流速小于3mL/min，先后用0.05mol/L氢氧化钠溶液3mL、甲醇3mL淋洗，抽干，2％甲酸甲醇溶液3mL洗脱，洗脱液置45～50℃水浴氮气吹干，三氯甲烷定容至1mL，充分混合。
衍生：加入催化剂腈基磷酸二乙酯工作液10μL(配制方法参见6.1)，加入衍生试剂苯胺工作液20μL(配制方法参见6.1)，塞紧，旋涡混匀，于37℃水浴避光反应5h，然后将各离心管于40℃氮气吹干，用样品稀释液定容至2mL，旋涡混匀后待测。
实施例4、酶联免疫检测(ELISA)方法的建立
4.1标准曲线
将MQCA用三氯甲烷稀释成640ng/mL，另取三氯甲烷1mL作为本底，按照实施例3确定的衍生条件进行衍生，反应完毕后用PBS定容至1mL；然后用本底将衍生好的MQCA-PAN结合物稀释配成64ng/mL、16ng/mL、4ng/mL、1ng/mL、0.25ng/mL、0ng/mL系列浓度，按间接竞争ELISA方法测定。以MQCA-PAN结合物浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线(如图3所示)，曲线在0.25～64ng/mL范围内线性关系良好，相关系数在0.99以上。
4.2灵敏度
采用IC50评价方法的灵敏度。分别测定20次标准曲线的IC50(见表3)。结果表明IC50的变动范围在1.06μg/L～4.8μg/L之间，均值为2.82ng/mL。测定20份空白组织(猪肌肉、肝脏)样品，将其平均值加3倍标准差，即为组织最低检测限。结果(见表4)显示猪肝脏和肌肉组织最低检测限分别为0.64μg/kg和0.60μg/kg。
表3本发明方法的灵敏度
| IC50测定值(μg/L) | IC50均值(ng/L) | |||||||||
| 1.062.06 | 3.252.1 | 3.242.32 | 2.853.27 | 3.472.4 | 3.21.64 | 4.82.19 | 3.472.78 | 2.732.25 | 4.233.0 | 2.82±0.87 |
表4空白组织测定结果及最低检测限(n＝20，LOD＝X+3SD)
| 组织 | 测定值(ng/g) | 均值 | 标准差 | 检测限(ng/g) | |||||||||
| 猪肝猪肉 | 0.640.250.250.23 | 0.330.340.270.28 | 0.320.260.310.46 | 0.240.310.290.36 | 0.330.260.260.21 | 0.310.280.290.34 | 0.230.250.210.25 | 0.260.430.580.27 | 0.510.370.470.31 | 0.460.290.340.22 | 0.330.31 | 0.1040.096 | 0.640.60 |
4.3准确度
将1mg/mL MQCA液添加到猪肌肉或猪肝脏组织中，使其终浓度为0μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、20μg/kg，每个浓度5个重复，重复7天，按照实施例3所述方法提取、净化、衍生，采用间接竞争ELISA测定样品中MQCA浓度，并计算回收率和变异系数(表5)。结果显示，猪肉、猪肝组织中添加1μg/kg、5μg/kg、20μg/kg的MQCA时，回收率均在60％～120％之间，批间变异系数均＜20％。
表5本发明方法的准确度
| 组织 | 平均回收率(％) | 批间变异系数(％) | ||||
| 1μg/kg | 5μg/kg | 20μg/kg | 1μg/kg | 5μg/kg | 20μg/kg | |
| 猪肝脏猪肌肉 | 86.7±13.189.1±12.4 | 80.5±11.483.7±16.3 | 76.8±15.372.6±13.3 | 16.214.4 | 15.117.2 | 11.912.6 |
实施例5、酶联免疫检测试剂盒的制备
5.1酶联免疫检测试剂盒的组成
试剂盒主要由盒体、酶标板、MQCA标准品液(1mg/mL)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体、MQCA抗体液、底物显色A液、底物显色B液、终止液、浓缩洗涤液、样品稀释液、苯胺衍生试剂、腈基磷酸二乙酯(DEPC)催化剂和泡沫托架所组成
5.2所用试剂的配制
(1)包被稀释液：Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，Na2N3 0.2g，加双蒸水至1000mL，调至pH9.6；(2)封闭液：卵清蛋白0.1g溶于100mLpH7.4 PBS；(3)浓缩洗涤液：NaCl80g，KH2PO42g，Na2HPO412H2O29g，KCl2g，吐温(Tween)-205mL，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000mL，调至pH7.4；(4)浓缩样品稀释液：NaCl80g，KH2PO42g，Na2HPO412H2O29g，KCl2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000mL，调至pH 7.4；(5)底物显色A液：再本实施例中，采用的是四甲基联苯胺溶液，即取四甲基联苯胺200mg，无水乙醇(在另外的实施例中，可将所述的四甲基联苯胺改为邻苯二胺，无水乙醇可改为二甲亚砜)100mL，加双蒸水至1000mL；(6)底物显色B液：取Na2HPO414.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调至pH 5.0～5.4；(7)底物显色混合液(在本实施例中是四甲基联苯胺-过氧化氢尿素溶液)：将底物显色A液和底物显色液B按体积比1∶1混合即为底物显色液混合液；(8)终止液：在本实施例中采用的是2mol/L的硫酸溶液，即取18mol/L浓硫酸100mL，缓慢滴加到双蒸水至900mL，即为终止液(在另外的实施例中可将2mol/L的硫酸溶液改为4mol/L的盐酸溶液)。
5.3酶标板的制备
用上述制备的包被缓冲液将MQCA与卵清蛋白偶联物稀释成1μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用铝膜真空密封保存、备用。
5.4本发明试剂盒的稳定性
2～8℃稳定性试验：将试剂盒置于4℃下保存，于0、1、2、3、4、5、6、7月分别取试剂盒，测定IC50值、0标准溶液的吸光值和猪肝脏中添加量为4μg/kg时的回收率。以IC50值大于10μg/L、0标准溶液的吸光值小于0.6和回收率不在50％～120％范围内为判定试剂盒失效的标准，结果见表6。
表6本发明的试剂盒4℃稳定性试验
| 时间(月) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 0标准吸光值IC50值(μg/L)回收率(％) | 1.862.8978 | 1.623.2185 | 1.544.2890 | 1.415.5688 | 1.296.2481 | 1.157.6693 | 待检待检待检 |
37℃加速稳定性试验：将试剂盒置于37℃下保存，于0、1、2、3、4、5d分别取试剂盒，测定IC50值、0标准溶液的吸光值和猪肝脏中添加量为4μg/kg时的回收率。以IC50值大于10μg/L、0标准溶液的吸光值小于0.6和回收率不在50％～120％范围内为判定试剂盒失效的标准，结果见表7。
表7本发明的试剂盒37℃加速稳定性试验
| 时间(d) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 0标准吸光值IC50值(μg/L)回收率(％) | 1.783.3681 | 1.525.0586 | 1.285.9679 | 1.057.1283 | 0.899.2894 | 0.6411.26102 |
表6和表7结果显示，试剂盒在4℃保存到第3个月时，所有指标均在正常波动范围内。37℃保存到第5d，0标准溶液的吸光值下降到0.64，IC50值为11.26μg/L，回收率为102％，说明试剂盒中的部分试剂已开始失效。根据唐伟国主编，尹行等编，《医学检验诊断试剂的制备与应用》，上海科学技术文献出版社，1996年版文献中的规定，试剂盒在37℃放置一天，相当于2～8℃保存一个半月。稳定性试验结果表明本试剂盒在4℃条件下的保存期至少为6个月。
实施例6、酶联免疫检测试剂盒的测定程序
6.1工作液配制：
(1)样品稀释液配制：将试剂盒中提供的浓缩样品稀释液(pH7.4的磷酸盐缓冲液)用三蒸水10倍稀释后使用，置4℃冰箱保存；
(2)洗涤液配制：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液(0.05～0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液)用三蒸水10倍稀释后使用，置4℃冰箱保存；
(3)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体工作液配制：根据每次所需用量(根据检测样品的多少决定用量)，将试剂盒中提供的HRP标记的羊抗兔抗体液用样品稀释液5000倍稀释后使用；
(4)MQCA抗体工作液配制：根据每次所需用量(根据检测样品的多少决定用量)，将MQCA抗体液用样品稀释液25000倍稀释后使用；
(5)催化剂工作液配制：取100uL乙腈于1.5mL具塞塑料离心管中，弃去10μL，加入催化剂腈基磷酸二乙酯原液10μL，旋涡混匀；
(6)衍生试剂工作液配制：取0.5mL乙腈于1.5mL具塞塑料离心管中，弃去30μL，加入衍生试剂苯胺30μL，旋涡混匀(衍生试剂对光敏感，操作注意避光)；
(7)底物显色A液配制：向底物显色A液瓶中加入10mL无水乙醇，混匀即为底物显色A液浓缩液，根据每次所测样品的数量决定其用量，用三蒸水10倍稀释后使用，现配现用；
(8)底物显色B液配制：将底物显色B液浓缩液用三蒸水10倍稀释，得到底物显色B液稀释液，再按每10ml底物显色B液稀释液加入过氧化氢脲64uL的比例加入过氧化氢脲彻底混匀后使用，现配现用；
(9)底物混合液配制：根据每次所需用量，将配制的底物显色A液和底物显色B液按体积比1∶1混匀，现配现用。
6.2测定步骤：
(1)将48或96孔酶标板置于室温下回温备用；
(2)将衍生好的标准品液(640ng/mL)用样品稀释液(0ng/mL)稀释成64ng/mL、16ng/mL、4ng/mL、1ng/mL、0.25ng/mL、0ng/mL，用于建立标准曲线，各取40μL加入到微孔中；将样品液取40μL加入到微孔中。标准品和样品做两个平行试验，记下标准品和样品的位置；
(3)在每一微孔中加入MQCA抗体工作液60μL，充分混合后于培养箱37℃孵育1h，覆盖上薄膜或置湿盒中防止蒸发；
(4)倒出孔中的液体，洗涤3次并拍干；
(5)在每一微孔中加入HRP标记的羊抗兔抗体工作液100μL，充分混合后于培养箱37℃孵育1h，覆盖上薄膜或置湿盒中防止蒸发；
(6)倒出孔中的液体，洗涤4次并拍干；
(7)在每一微孔中加入底物混合液100μL，充分混合后于培养箱37℃孵育15到20min；
(8)在每一微孔中加入反应终止液50μL终止反应；
(9)加入终止液后60min内在450nm处测量吸光度值。
6.3结果判断
所获得的标准品和样品吸光值的平均值除以第一个标准(0标准)的吸光值再乘以100，即为抑制率。以抑制率为纵坐标，MQCA浓度的对数为横坐标作标准曲线，曲线在0.25μg/L～64μg/L范围内趋近直线，每一个样品的浓度(μg/kg)可以从标准曲线上读出。
实施例7、本发明试剂盒的考核与应用
7.1本发明试剂盒的考核
将本发明试剂盒用HPLC方法进行考核，结果(见表8)显示ELISA具有良好的灵敏度和特异性，与HPLC方法相关性良好。
表8 HPLC法与本发明方法的比较
| 方法 | 指标 | 添加浓度(μg/kg) | ||
| 1 | 5 | 20 | ||
| ELISAHPLC | 平均回收率(％)变异系数(％)平均回收率(％)变异系数(％) | 86.417.4105.615.2 | 81.216.989.916.2 | 76.318.277.313.9 |
7.2本发明试剂盒的应用
取21头45日龄，体重15.0±2.0kg品种为“长大”的二元杂交去势健康仔猪，随机分为2组，一组为不添加药物的空白对照组，另一组为加药试验组。试验组饲喂含50mg/kg的喹乙醇7天，停药0天、4天、10天、14天分别屠宰3头，空白对照组分别在停药0天、4天、10天各屠宰3头，按照试剂盒测定程序测定猪肝脏、肌肉中MQCA的含量。测定结果如表9所示：停药0天，ELISA方法测定肝脏、肌肉中MQCA含量分别为83.7ng/g和7.7ng/g，而HPLC方法检测结果分别为82.3ng/g和7.0ng/g，停药14天，用ELISA方法和HPLC方法检测肝脏中MQCA含量分别为4.77ng/g和4.6ng/g，肌肉中均未检出。两种方法测定结果都能反映MQCA在肝脏和肌肉中的残留量随时间的延长逐渐降低，阴性对照组测定结果均为阴性(＜1μg/kg)，加药组均为阳性(＞1μg/kg)，说明本发明的试剂盒具有实际检出能力，可以筛选出阳性样品(＞1μg/kg)。
表9猪肝脏和肌肉组织中MQCA含量的测定
| 组织 | 停药时间(d) | 检测方法 | 测定值(ng/g) | 均值(ng/g) | 标准差 | ||
| 猪1 | 猪2 | 猪3 | |||||
| 肌肉肝脏 | 041014041014 | ELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLC | 8.97.65.84.91.8---788222289114.14.3 | 6.86.64.94.52.3---8279383615185.34.8 | 7.46.94.34.12.1---9186293313164.94.7 | 7.77.05.04.52.1---83.782.329.732.312.3154.774.6 | 1.080.510.750.40.25---6.663.518.024.043.063.610.610.26 |
注：“-”表示不予计算
Claims (10)
1、一种3-甲基喹啉-2-羧酸残留的酶联免疫检测方法，包括免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的前处理，其步骤如下：
(1)将3-甲基喹啉-2-羧酸与卵清蛋白相偶联得到包被原；
(2)将3-甲基喹啉-2-羧酸与牛血清白蛋白相偶联得到免疫原；
(3)用步骤(2)的免疫原免疫兔得到特异性兔多克隆抗体；
(4)用步骤(1)的包被原包被固相载体；
(5)将所述的样品先经酸解提取后再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；
(6)将步骤(5)的待测产物进行酶联免疫检测。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固相载体是酶标板。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的衍生试剂是苯胺。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的催化剂为腈基磷酸二乙酯。
5、适用于权利要求1、2、3或4所述方法的酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，包被有所述的包被原；所述的试剂包括抗3-甲基喹啉-2-羧酸特异性兔多克隆抗体，辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体，浓缩洗涤液，浓缩样品稀释液，3-甲基喹啉-2-羧酸标准溶液，底物显色A液，底物显色B液，终止液，衍生试剂和催化剂。
6、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的底物显色A液为四甲基联苯胺或邻苯二胺。
7、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色B液为过氧化氢或过氧化脲。
8、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸溶液或盐酸溶液。
9、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为含有0.05～0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
10、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩样品稀释溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
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