CN105315241A - 一种沙丁胺醇半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种沙丁胺醇半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒。本发明提供的半抗原，为式（Ⅰ）所示的化合物。本发明保护式（Ⅰ）所示的化合物与载体蛋白的偶联物（该偶联物为免疫原或包被原）。本发明的试剂盒由包被有所述偶联物的化学发光微孔板（偶联物作为包被原）、沙丁胺醇标准品、多克隆抗体、酶标二抗、发光底物液、浓缩稀释液组成。本发明提供的试剂盒操作简便、特异性好、灵敏度高，各项性能优良，可用于动物尿液、和组织样品中沙丁胺醇的残留量检测。式（Ⅰ）。

Description

一种沙丁胺醇半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及一种沙丁胺醇半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒，用于检测动物组织和尿液中的沙丁胺醇残留量，属于免疫学检测领域。

背景技术

沙丁胺醇(SAL)为选择性β2受体激动剂，临床医学上主要用于治疗喘息型支气管炎、支气管哮喘、肺气肿所致的支气管痉挛。同时，沙丁胺醇还有促进动物骨骼肌生长，减少脂肪蓄积、提高饲料转化率等作用，常被不法商家用作饲料添加剂。人食用了含沙丁胺醇残留的动物性食品，会出现肌肉震颤、心悸、过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、呼吸困难等症状。现在欧美各国均禁止其在畜牧生产上的应用，美国规定只能把它用于科研，我国农业部235公告也明确规定沙丁胺醇及其盐、酯为禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出。

目前检测沙丁胺醇的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)等，但这些方法都不同程度地存在着样品前处理繁琐，对仪器设备以及操作过程的要求较高等缺点，不适于生产、基层单位及现场检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙丁胺醇半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒。

本发明提供的半抗原，为式(Ⅰ)所示的化合物；

式(Ⅰ)所示的化合物具体可为按如下方法制备得到的化合物：(1)取478mg沙丁胺醇溶于15mL乙醇，加入434mg碳酸钾，200mg环氧氯丙烷，混合均匀，室温搅拌反应2h；(2)制备薄层色谱纯化混合物，展开剂为二氯甲烷:甲醇，体积比5:1，Rf值0.6处为产物点；(3)将产物点处硅胶刮下，用甲醇提取2次(每次可采用25mL甲醇)，过滤并收集滤液，将滤液进行真空干燥，得到的干物质即为式(Ⅰ)所示的化合物。

本发明还保护式(Ⅰ)所示的化合物与载体蛋白的偶联物(该偶联物为免疫原或包被原)。所述载体蛋白具体可为BSA或OVA。

本发明提供一种用于检测沙丁胺醇的化学发光免疫试剂盒，包括包被有所述偶联物的化学发光微孔板(偶联物作为包被原)，沙丁胺醇标准品工作液，浓缩酶结合物，浓缩样品稀释液，浓缩洗涤液和化学发光液。

所述试剂盒还可包括以所述偶联物为免疫原得到的抗体。所述抗体具体可为兔源多克隆抗体。

所述“包被有所述偶联物的化学发光微孔板”的制备方法具体如下：(1)取所述偶联物，用包被缓冲液稀释(包被缓冲液具体可为pH9.6、0.03M的碳酸盐缓冲液)，得到包被原稀释液(蛋白浓度具体可为20ng/mL)；(2)将包被原稀释液加入化学发光微孔板(具体可100μL/孔)，孵育(具体可40℃孵育16小时)，洗涤，拍干；(3)完成步骤(2)后，进行封闭(每孔可加入100μL封闭液，室温封闭2h；封闭液的具体配方：将10gBSA、0.1mLproclin300和1000mLpH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液)，倾去孔内的液体，干燥。

本发明提供的试剂盒操作简便、特异性好、灵敏度高，各项性能优良，非常适于推广应用。

附图说明

图1为标准曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

以下实施例中试剂盒的检测原理如下：

实施例1中的搅拌都是采用磁力搅拌器进行的。二甲基甲酰胺(DMF)：sigma，型号：D4551。沙丁胺醇：sigma，型号：S0100000。其他试剂均购自国药集团，为分析纯。

沙丁胺醇的结构式如下：

实施例1、免疫原和包被原的制备

一、半抗原的制备

1、取478mg沙丁胺醇，溶于15mL乙醇中，分别加入434mg碳酸钾和200mg环氧氯丙烷，混合均匀，室温下搅拌，反应2h。

2、制备薄层色谱，展开剂为二氯甲烷:甲醇，体积比5:1，取步骤1得到的溶液，低于色谱板上。Rf值0.6处为产物点，将此处硅胶刮下，用甲醇提取2次(每次采用25mL甲醇)，合并有机相，过滤并收集滤液，将滤液进行真空干燥，得到的干物质即为半抗原。

半抗原的结构式见式(Ⅰ)。

二、免疫原的制备

1、取6.6mg步骤一制备的半抗原，溶于2mLDMF。

2、取50mgBSA，溶于5mL0.1M碳酸钠缓冲液。

3、将步骤1得到的溶液逐滴加至步骤2得到的溶液中，室温搅拌反应24小时，然后装入透析袋，在4℃条件下，在PBS缓冲液(pH7.4、0.01M)中进行透析(3天，每天换液2次)，得到的溶液即为免疫原溶液，简称SAL-BSA。

免疫原的结构式见式(Ⅱ)。

三、包被原的制备

用OVA代替BSA，其它同步骤二，得到包被原溶液，简称SAL-OVA。

实施例2、多克隆抗体的制备

取实施例1制备的SAL-BSA溶液，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液稀释，得到免疫原稀释液，用于多克隆抗体的制备。采用雌性新西兰大白兔作为免疫动物。

免疫过程如下(免疫剂量以蛋白量计)：

首次免疫：将免疫原稀释液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为1mg/kg·b.w.；

加强免疫：首次免疫后每隔2周进行一次加强免疫，将免疫原稀释液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，单次免疫剂量为1mg/kg·b.w.；

末次免疫：首次免疫10周后进行末次免疫，直接颈背部皮下多点注射免疫原稀释液，免疫剂量为1mg/kg·b.w.。

末次免疫1周后，将血清效价为3.0×10⁴以上的兔子处死，分离血清，用饱和硫酸铵法纯化，分装冻存，即为免疫原对应的多克隆抗体(简称多克隆抗体甲)。

实施例3、化学发光免疫检测试剂盒的组装

化学发光免疫检测试剂盒包括如下组件：

1、包被了包被原的化学发光微孔板

取实施例1制备的包被原溶液，用包被缓冲液稀释(包被缓冲液即pH9.6、0.03M的碳酸盐缓冲液)，得到蛋白浓度为2ng/mL的包被原稀释液。将10g牛血清白蛋白、0.1mLproclin300和1000mLpH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液。

(1)将包被原稀释液加入化学发光微孔板(100μL/孔)，37℃孵育16小时。

(2)完成步骤(1)后，倾去孔内的液体，洗涤，拍干。

(3)完成步骤(2)后，每孔加入200μL封闭液，37℃温育2h。

(4)完成步骤(3)后，倾去孔内的液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

2、多克隆抗体工作液

取10mg牛血清白蛋白，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液溶解并定容至1000mL，得到抗体稀释液。

将实施例2制备的多克隆抗体甲用抗体稀释液稀释至150000倍体积，得到一抗工作液甲。

3、二抗工作液

辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.产品目录号为115-035-003。

将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗用步骤2中的抗体稀释液稀释至1000倍体积，得到二抗工作液。

4、标准品溶液

将沙丁胺醇溶于pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液，分别得到浓度为0.02ng/mL、0.06ng/mL、0.18ng/mL、0.54ng/mL和1.62ng/mL的标准品溶液。将pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液作为标准品溶液的阴性对照溶液，称为0溶液。

5、发光底物液

发光液由A液和B液组成，A液和B液各一瓶，4mL/瓶。

A液的制备方法：取0.2g鲁米诺单钠盐、0.1g对碘苯酚、0.16g氯化钠和0.18gEDTA-Na₂，用pH8.4、0.1M的Tris-HCl缓冲液溶解并定容至1000mL。

B液：含0.3mMH₂O₂、5mMEDTA-Na₂的pH8.4、0.1M的Tris-HCl缓冲液。

6、20×浓缩洗涤液

将1000mLpH7.4、0.2M的磷酸盐缓冲液与1mLproclin300混合，得到20×浓缩洗涤液。

实施例4、实施例3制备的化学发光免疫检测试剂盒的使用方法

向包被了包被原的化学发光微孔板中加入标准品溶液或待测样本溶液(50μL/孔)，再加入一抗工作液甲(50μL/孔)和二抗工作液(50μL/孔)，室温反应20min，弃上清，洗涤四次(每次洗涤过程均如下：每孔中加入250μL洗涤液，30秒后弃上清；将20×浓缩洗涤液用水稀释至20倍体积，即为洗涤液)，用吸水纸拍干，每孔加入100μL新鲜配制发光底物液(A液和B液等体积混合)，用化学发光仪(深圳天众达)检测每孔的光子数。设置五个复孔。每个浓度的标准品溶液的发光强度的平均值(B)除以0溶液的发光强度的平均值(B₀)，再乘以100％，即结合率。计算公式：结合率(％)＝B/B₀×100％。以标准品溶液中的沙丁胺醇浓度(ng/mL)为X轴，B/B₀为Y轴，绘制标准曲线图(见图1)。根据标准曲线的回归方程可以求出待测样本溶液中沙丁胺醇或沙丁胺醇衍生物的浓度。本发明中检测结果的分析可以利用专业软件，可以实现大量样本的快速分析，整个检测过程只需30分钟就可以完成。结合率(B/B₀)为50％时对应的标准品溶液中的沙丁胺醇浓度即为IC₅₀值。根据标准曲线图，IC₅₀＝0.14ng/mL。

试剂盒的检测原理：当在化学发光微孔板上预包被半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入待测样本溶液，随后加入一抗和酶标二抗，待测样本溶液中残留的沙丁胺醇或沙丁胺醇衍生物与化学发光板上包被的包被原竞争一抗，然后与酶标二抗的进一步结合，加入化学发光底物液，发光强度与待测样本溶液中沙丁胺醇或沙丁胺醇衍生物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出待测样本溶液中沙丁胺醇或沙丁胺醇衍生物的残留量。

对比例、免疫原对照物和包被原对照物的制备

一、制备免疫原对照物

1、取10mg硫酸沙丁胺醇，溶于1mL0.2mol/LHCl水溶液，置于冰浴中并加入10mg亚硝酸钠，然后室温搅拌30min。

2、取50mgBSA，溶于5mL1mol/L碳酸钠水溶液。

3、将步骤1得到的溶液逐滴加入步骤2得到的溶液中，室温搅拌5h，然后装入透析袋，在生理盐水中进行透析(3天，每天换液2次)，然后用0.22μm孔径的滤膜进行过滤并收集滤液，即为免疫原对照物溶液。

二、制备包被原对照物

1、取6mg硫酸沙丁胺醇，溶于1mL0.2mol/LHCl水溶液，置于冰浴中并加入6mg亚硝酸钠，室温搅拌30min。

2、取30mgOVA，溶于5mL1mol/L碳酸钠水溶液。

3、将步骤1得到的溶液逐滴加入步骤2得到的溶液中，室温搅拌5h，然后装入透析袋，在生理盐水中进行透析(3天，每天换液2次)，然后用0.22μm孔径的滤膜进行过滤并收集滤液，即为包被原对照物溶液。

三、多克隆抗体乙的制备

用免疫原对照物溶液代替免疫原溶液进行实施例2，得到免疫原对照物对应的多克隆抗体(简称多克隆抗体乙)。

四、应用包被原对照物和多克隆抗体乙检测沙丁胺醇

用包被原对照物溶液代替包被原溶液进行实施例3的步骤1，得到对照微孔板。

用多克隆抗体乙代替多克隆抗体甲进行实施例3的步骤2，得到一抗工作液乙。

用对照微孔板代替“包被了包被原的化学发光微孔板”，用一抗工作液乙代替“一抗工作液甲”，其它同实施例4，IC₅₀值＝1.24ng/mL。

实施例5、实施例3制备的化学发光免疫检测试剂盒的特异性

分别检测11种待测药物(与沙丁胺醇结构或功能类似物的11种药物)与沙丁胺醇的交叉反应率。

1、将待测药物溶于pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液，得到不同浓度的溶液。

2、向包被了包被原的化学发光微孔板中加入步骤1制备的溶液(50μL/孔)，再加入一抗工作液甲(50μL/孔)和二抗工作液(50μL/孔)，室温反应20min，弃上清，洗涤四次(每次洗涤过程均如下：每孔中加入250μL洗涤液，30秒后弃上清；将20×浓缩洗涤液用水稀释至20倍体积，即为洗涤液)，用吸水纸拍干，每孔加入100μL新鲜配制发光底物液(A液和B液等体积混合)，用化学发光仪检测每孔的光子数。

交叉反应率(％)＝(沙丁胺醇的IC₅₀值/待测药物的IC₅₀值)×100％。结果见表1。试剂盒的特异性良好。

表1交叉反应率结果

实施例6、实施例3制备的试剂盒的性能

一、样本前处理的方法(制备空白样本)

猪尿：取不含沙丁胺醇的尿样，4000g离心5min，取30μL上清液用于分析。

猪肉：取1g不含沙丁胺醇的猪肉，匀浆后，加入4mL提取液，高速涡动1min，4000g离心10min，取1ml上清于4ml离心管中，加入25μL1mol/L氢氧化钠，混匀后4000g离心5min，取上清30μL用于点样。

二、试剂盒保存期实验

试剂盒保存条件为2-8℃，保存6个月后，测定沙丁胺醇的IC₅₀值，零孔光子数。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置6天，进行热加速实验。结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。

表2低温保存实验结果

表3热加速实验

三、试剂盒的灵敏度、精密度、准确度

1、灵敏度

以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。取20份空白样本，按实施例3的使用方法进行检测，检测信号值，计算空白样本光子数(RLU)的平均值，并将此平均值带入标准曲线得到对应的待测物浓度，计算各对应浓度值的标准差(SD)，由平均值加三倍标准差即为该样本的最低检测限(LOD)，结果见表4。

表4沙丁胺醇在猪尿和猪肉中的最低检测限

2、精密度

从三批试剂盒(01批、02批、03批)中每批抽取五个试剂盒，测定0.3ng/mL、0.5ng/mL两个浓度(即在猪尿空白样本中加入沙丁胺醇)，每个浓度设置5个平行，重复5次，根据标准曲线，算出各个RLU对应的浓度值，并计算板内板间变异系数，结果见表5，批内批间变异都＜15％，说明试剂盒的精密性良好。

表5试剂盒的精密度

3、准确度

试剂盒的添加实验反映其准确度。在猪尿空白样本中加入沙丁胺醇，使其浓度为0.3ng/mL或0.5ng/mL。猪肉空白样本中加入沙丁胺醇，使其浓度为0.4ng/mL或0.6ng/mL。每个浓度5个平行。样本处理后，测定沙丁胺醇的浓度，同时考虑稀释倍数，代入标准曲线计算回收率，同时计算变异系数(三个批次的试剂盒)。结果见表6和表7。

表6猪尿中沙丁胺醇添加回收率与变异系数

表7猪肉中沙丁胺醇添加回收率与变异系数

Claims (7)

1.式（Ⅰ）所示的化合物；

式（Ⅰ）。

2.式（Ⅰ）所示的化合物与载体蛋白的偶联物。

3.如权利要求2所述的偶联物，其特征在于：所述载体蛋白为BSA或OVA。

4.一种用于检测沙丁胺醇的化学发光试剂盒，包括权利要求2或3所述偶联物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括以权利要求2或3所述偶联物为免疫原得到的抗体。

6.一种用于检测沙丁胺醇的化学发光免疫试剂盒，包括包被有权利要求2或3所述偶联物的化学发光微孔板。

7.权利要求6或7所述试剂盒在检测待测样本中是否含有沙丁胺醇中的应用。