CN104977406A - 检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、氟喹诺酮类药物标准品溶液、酶标二抗、氟喹诺酮类药物特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液、蜂蜜样本稀释液，所述包被原为氟喹诺酮类药物偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测氟喹诺酮类药物的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测蜂蜜、鸡肉、猪肉、鱼、虾、牛奶、奶粉和鸡蛋样本中氟喹诺酮类药物的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒，可定性、定量检测蜂蜜、鸡肉、猪肉、鱼、虾、牛奶、奶粉和鸡蛋样本中氟喹诺酮类药物药物的残留量。

背景技术

氟喹诺酮类药物因其抗菌谱广、抗菌活性强，已成为临床上常用的抗菌药物，但由于药物本身特性及不合理用药和滥用药物现象的存在，引起了一系列的不良反应。常见的有皮肤过敏及光敏反应、中枢神经系统反应、循环系统反应、消化系统反应、泌尿系统反应、呼吸系统反应、软骨毒性、肝脏毒性、生殖毒性、跟腱炎和局部刺激症状等，养殖业将其作为添加剂饲养动物，使该类药物在动物体内有一定残留量，因此对人类健康造成了一定的危害。美国、欧盟、中国等都对氟喹诺酮类药物的残留限量做出了规定。

目前，氟喹诺酮类药物残留的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法等仪器方法。这些方法具有灵敏度高、结果准确等优点，但是资金和人员等投入成本较高。本发明应用酶联免疫法，测定蜂蜜、鸡肉、猪肉、鱼、虾、牛奶、奶粉和鸡蛋中氟喹诺酮类药物药物的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够检测蜂蜜、鸡肉、猪肉、鱼、虾、牛奶、奶粉和鸡蛋样本中氟喹诺酮类药物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、氟喹诺酮类药物标准品溶液、酶标二抗、氟喹诺酮类药物特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为氟喹诺酮类药物偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体。

所述氟喹诺酮类药物偶联抗原是由氟喹诺酮类半抗原与载体蛋白偶联得到，所述氟喹诺酮类半抗原是由诺氟沙星和羧甲基羟胺反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述氟喹诺酮类药物特异性抗体是以氟喹诺酮类药物偶联抗原作为免疫原制备获得，所述氟喹诺酮类药物特异性抗体可为氟喹诺酮类药物单克隆抗体或氟喹诺酮类药物多克隆抗体，其中优选氟喹诺酮类药物单克隆抗体。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标二抗是采用改良后的过碘酸钠法进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括氟喹诺酮类药物标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述氟喹诺酮类药物标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L、25.6μg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5%～1.0%吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

所述复溶液优选为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

所述蜂蜜样本稀释液为pH值为7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1%～3%酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，25℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：

本试剂盒采用竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的氟喹诺酮类药物和微孔条上预包被的偶联抗原竞争氟喹诺酮类药物抗体，加入酶标二抗后，用底物显色，样本吸光度值与其所含残留物氟喹诺酮类药物的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中氟喹诺酮类药物的残留量。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测氟喹诺酮类药物的方法，它包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用试剂盒进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒主要采用ELISA方法定性或定量检测样品中氟喹诺酮类药物的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。

附图说明

图1：氟喹诺酮类半抗原合成路线图

图2：氟喹诺酮类半抗原核磁共振氢谱图

图3：试剂盒标准曲线图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1试剂盒组分的制备

1、氟喹诺酮类半抗原的制备

将1.0g诺氟沙星溶于20ml吡啶中，加入羧甲基羟胺0.29g，50℃反应12小时，减压蒸干溶剂，乙醇-水重结晶，得白色粉末状产物，得率58%。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，羧基信号峰增强，4.7ppm左右增加的亚甲基信号峰说明半抗原合成成功。

2、抗原的制备

免疫原制备——氟喹诺酮类半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原。

取10mg半抗原，溶解于1mL DMF中，取30mg EDC和NHS用0.2ml水充分溶解后于加入上述DMF中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取BSA50mg，使之充分溶解在3.8mL PBS（PH7.2）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/lPBS，4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。

包被原制备——氟喹诺酮类半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联得到免疫原。

取10mg半抗原，溶解于1mL DMF中，取30mg EDC和NHS用0.2ml水充分溶解后于加入DMF中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取OVA50mg，使之充分溶解在3.8mLPBS（PH7.2）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/lPBS，4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。

3、氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备

动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

4、酶标二体的制备

将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。

5、酶标板的制备

用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例2检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

（1）包被氟喹诺酮类药物偶联抗原的酶标板；

（2）氟喹诺酮类药物标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L、25.6μg/L；

（3）用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

（4）氟喹诺酮类药物特异性抗体；

（5）底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

（6）终止液为2mol/L硫酸；

（7）洗涤液为pH值为7.4，含有0.5%～1.0%吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

（8）复溶液为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

（9）蜂蜜样本稀释液为pH值为7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

实施例3蜂蜜、鸡肉、猪肉、鱼、虾、牛奶、奶粉和鸡蛋样本中氟喹诺酮类药物的检测

1、样品前处理

（1）动物组织样本

用均质器均质组织样本；称取2.0±0.05g均质后的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入8ml样本提取液，用振荡器振荡5min，混匀，3000g室温（20-25℃/68-77℉）离心10min；移取2ml上层有机相至10ml洁净干燥的玻璃试管中，于50-60℃（122-140℉）水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动2min，再加入1ml复溶工作液用涡旋仪涡动30s，混匀，3000g室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；除去上层有机相，取下层水相50ml用于分析。

（2）蜂蜜组织样本

称取1.0±0.05g蜂蜜样本至10ml聚苯乙烯离心管中；加入1ml去离子水，用涡旋仪涡动5min，混匀，使其充分溶解；移取50ml样本液与450ml蜂蜜样本稀释液混合，用涡旋仪涡动混匀1min，混匀；取50ml用于分析。

（3）牛奶样本

用移液器取25ml样本液与475ml复溶工作液混合，用涡旋仪涡动1min，混匀；取50ml用于分析。

（4）奶粉样本

称取0.5±0.02g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中；加入5ml去离子水，用振荡器振荡使其充分溶解；取100ml样本液与400ml复溶工作液混合，用涡旋仪涡动1min，混匀；取50ml用于分析。

（5）鸡蛋样本

称取1.0±0.02g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中；加入5ml去离子水，用振荡器振荡使其充分溶解；取100ml样本液与400ml复溶工作液混合，用涡旋仪涡动1min，混匀；取50ml用于分析。

2、用试剂盒检测

加标准品/样本50μl到对应的微孔中，将抗体工作液和酶标二抗浓缩液按10:1体积比混合并混匀。加抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干。加入底物液A液50μl/孔，再加入底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中显色15min。加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值（OD）。

3、检测结果分析

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准品（0标准）的吸光度值的平均值，再乘以100%，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以氟喹诺酮类药物标准品浓度（μg/L）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氟喹诺酮类药物的实际浓度。

实施例4氟喹诺酮类药物技术参数的确定试验

1、试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，标准曲线的范围为0.1～25.6μg/L，IC₅₀（50%抑制浓度）浮动范围为2～3.5μg/L；对20份样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果显示，该方法对鸡肉、猪肉、鱼、虾样本的检测限均为0.3μg/kg，对蜂蜜样本的检测限为2μg/kg，对牛奶、鸡蛋样本的检测限均为3μg/kg，对奶粉样本的检测限均为6μg/kg。

2、样本精密度和准确度试验

以回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差（RSD%）作为精密度评价指标。计算公式为：回收率（%）＝实际测定值/理论值×100%，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差RSD%＝SD/X×100%，其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。

按50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg三个浓度氟喹诺酮类药物分别对蜂蜜、鸡肉、猪肉、鱼、虾、牛奶、奶粉和鸡蛋样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂进行测定，计算样品的平均回收率及精密度结果见下表。

表1诺氟沙星ELISA法的准确度和精密度测定

表2双氟沙星ELISA法的准确度和精密度测定

表3恩诺沙星ELISA法的准确度和精密度测定

表4氟甲喹ELISA法的准确度和精密度测定

表5沙拉沙星ELISA法的准确度和精密度测定

表6达氟沙星ELISA法的准确度和精密度测定

表7培氟沙星ELISA法的准确度和精密度测定

表8环丙沙星ELISA法的准确度和精密度测定

表9依诺沙星ELISA法的准确度和精密度测定

表10氧氟沙星ELISA法的准确度和精密度测定

表11噁喹酸ELISA法的准确度和精密度测定

由以上结果可知，在以上样本中添加50μg/kg(L)、100μg/kg(L)、200μg/kg(L)氟喹诺酮类药物标准品（沙拉沙星添加5μg/kg(L)、10μg/kg(L)、20μg/kg(L)）时，回收率在73.5%～96.8%之间，变异系数均小于15%。

3、试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值（零标准）、50%抑制浓度、氟喹诺酮类药物添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。

4、交叉反应率

该抗体与多种氟喹诺酮类药物的交叉反应率结果，见下表。

表12交叉反应率试验

Claims (8)

1.一种检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括：包被有包被原的酶标板、氟喹诺酮类药物标准品溶液、酶标二抗、氟喹诺酮类药物特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液、蜂蜜样本稀释液，所述包被原为氟喹诺酮类药物偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述氟喹诺酮类药物偶联抗原是由氟喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述氟喹诺酮类药物半抗原是由诺氟沙星和羧甲基羟胺反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述氟喹诺酮类药物半抗原是由诺氟沙星和羧甲基羟胺反应得到，分子结构式为：

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述氟喹诺酮类药物特异性抗体是以氟喹诺酮类药物偶联抗原作为免疫原制备获得，所述氟喹诺酮类药物特异性抗体可为氟喹诺酮类药物单克隆抗体或氟喹诺酮类药物多克隆抗体。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述洗涤液为pH值为7.4，含有0.5%～1.0%吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；所述复溶液为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；所述蜂蜜样本稀释液为pH值为7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述氟喹诺酮类药物标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L、25.6μg/L。

8.一种检测样品中氟喹诺酮类药物含量的方法，包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用权利要求1～7任一项所述的试剂盒进行检测；

（3）分析检测结果。