CN102675455B - 一种喹乙醇残留标示物高偶联比的全抗原合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种高偶联比的喹乙醇残留标示物全抗原合成方法。该方法采用N,N'-二异丙基碳二亚胺为催化剂，3-甲基喹喔啉-2-羧酸与过量的N-羟基琥珀酰亚胺发生酯化反应，酯化物再与载体蛋白偶联反应即得到高偶联比的喹乙醇残留标示物全抗原。本发明使用的催化剂安全性更高，不易造成操作人员的过敏，且副产物少，所得全抗原偶联比可达到32～62；所得抗原免疫小鼠后，可得到抗体效价在128000以上的MQCA多克隆抗体，与喹乙醇、喹唏酮、痢菌净的交叉反应性均小于20%，与氯霉素、盐酸克伦特罗、抗生素类等无交叉反应性。

Description

一种喹乙醇残留标示物高偶联比的全抗原合成方法
技术领域
本发明属于免疫化学分析技术领域，具体涉及一种喹乙醇残留标示物高偶联比的全抗原合成方法。
背景技术
喹乙醇又称喹酰胺醇，商品名为倍育诺、快育灵，有中度至明显的蓄积毒性，对大多数动物有明显的致畸作用，对人也有潜在的三致性，即致畸形，致突变，致癌，由于其在饲料及饲料添加剂中滥用所引起的食品安全问题备受关注，对喹乙醇及其残留标示物3-甲基喹喔啉-2-羧酸（MQCA）残留快速检测试剂盒和胶体金试纸条的研究成为近年来国内热点。3-甲基喹喔啉-2-羧酸为小分子物质，不能刺激动物机体产生免疫应答获得抗体，需与大分子物质如牛血清白蛋白、卵清白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白等联接作为免疫全抗原。研究发现半抗原能否刺激机体产生高特异性的抗血清不仅决定于它与蛋白质的结合位点，而且取决于蛋白质上连接的半抗原数目。已有的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原合成方法都选用N,N'-二环已基碳二亚胺（DCC）作为催剂，但该催化剂的缺点是合成过程中容易产生的副产物N,N'-二环已基脲且不易除净，该副产物对皮肤、眼晴有刺激性，引起发炎，所得全抗原的偶联比一般只有10：1左右。目前国内尚未建立合理、可靠的喹乙醇残留标示物全抗原偶联比检测方法，其偶联比的测定方法主要为紫外分光光度法，该方法的专属性不强，准确度不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种安全性好、效率高、高偶联比的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原的合成方法。
本发明获得3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原的合成方法如下：
在N,N'-二异丙基碳二亚胺存在下，3-甲基喹喔啉-2-羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺发生酯化反应，反应产物再与载体蛋白偶联，得到全抗原。
所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔戚血蓝蛋白。
合成路线为：
具体的合成过程为：将3-甲基喹喔啉-2-羧酸溶于二甲基甲酰胺中，再加入催化剂N,N'-二异丙基碳二亚胺，催化剂与3-甲基喹喔啉-2-羧酸的摩尔用量相等，然后加入过量的N-羟基琥珀酰亚胺，与其发生酯化反应得到酯化物。反应后，离心除去沉淀物，再向反应液中滴加溶有载体蛋白的pH为7.4的PBS缓冲液，酯化物与载体蛋白分子上的胺基发生偶联反应得到全抗原。反应液置于超滤管中，离心、洗涤，除去未反应完全的小分子物质，采用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤。
进一步，所述3-甲基喹喔啉-2-羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔用量比为1：（1.5～2），优选1：1.6。
酯化反应时的反应温度为30～45℃，优选37℃。
偶联反应时的反应温度为30～45℃，优选37℃。
采用上述合成方法制得的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原的偶联比的检测方法：将上述含全抗原的反应液置于超滤管中，离心、洗涤，收集滤液，采用高效液相色谱法检测滤液中游离3-甲基喹喔啉-2-羧酸的浓度，色谱条件：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为体积比为60:40的甲醇水混合液，检测波长为320nm。
采用上述合成方法制得的3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原用于制备喹乙醇残留标示物ELISA检测试剂盒。
本发明有益效果：
（1）本发明在合成3-甲基喹喔啉-2-羧酸全抗原所用的催化剂为N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC），反应时较易形成均相反应，与催化剂N,N'-二环已基碳二亚胺（DCC）相比，其副产物少，安全性更高，不易造成操作人员的过敏，且最终所得的全抗原偶联比可由10左右提高到32～68；
（2）在以往实验中都采用透析法除去反应中的有害物质和杂质，通常需要在4℃，透析2～4天、PBS缓冲液4～8L。本发明应用分子截留量为30 000dal的超滤管离心纯化MQCA全抗原，所需时间短，且耗费PBS缓冲液仅需4～8mL，为准确测定全抗原偶联比提供了可行性。
（3）本发明选用高效液相色谱法检测全抗原的偶联比，该检测方法的精密度符合要求，RSD=0.23%；重现性良好, RSD=1.14%。
（4）本发明制得的全抗原可用于喹乙醇残留标示物—3-甲基喹喔啉-2-羧酸ELISA快速检测试剂盒中关键试剂—一包被抗原，能减少包被抗原的用量；该抗原免疫小鼠后，可得到抗体效价在128000以上的MQCA多克隆抗体，与喹乙醇、喹唏酮、痢菌净的交叉反应性均小于20%，与氯霉素、盐酸克伦特罗、抗生素类等无交叉反应性，可用于喹乙醇残留ELISA快速检测试剂盒中关键试剂—一抗工作液，该抗原还能用于制备高特异性的3-甲基喹喔啉-2-羧酸单克隆抗体。
附图说明    
图1为MQCA标准品的高效液相色谱图；
图2为全抗原MQCA-BSA合成中游离MQCA的高效液相色谱图；
图3为全抗原MQCA-OVA合成中游离MQCA的高效液相色谱图；
图4为全抗原MQCA-KLH合成中游离MQCA的高效液相色谱图
图5为峰面积与MQCA溶液的标准曲线；
图6为MQCA多克隆抗体的效价。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1
全抗原(MQCA-BSA)的合成：将25mmol的3-甲基喹喔啉-2-羧酸（MQCA）溶于0.5mL的二甲基甲酰胺中，再加入25mmol的N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC），搅拌30min，然后加入40mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，37℃避光搅拌反应16h，离心除去沉淀物，离心得到的清液为反应液A；将3.0×10-4mmol牛血清白蛋白（BSA，分子量为68000）溶于1.5mL0.02 mol/L 的磷酸缓冲溶液（pH=7.4）中，得溶液B；将溶液B逐滴加至反应液A中，37℃下搅拌过夜，反应液置于超滤管（分子截留量为30 KD）中，离心10min后，加入0.2mol/L pH=7.4的PBS缓冲溶液1mL，再离心，重复操作3～4次，充分洗去未反应完全的小分子物质，收集滤液，取1mL滤液过0.22μm的滤膜，采用高效液相色谱法检测滤液中游离MQCA的浓度；经超滤管截留下的全抗原经冷冻干燥后分装，保存。
实施例2
全抗原（MQCA-OVA）的合成：将25mmol的MQCA溶于0.5mL的二甲基甲酰胺中，再加入25mmol的DIC，搅拌30min，然后加入40mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，37℃避光搅拌反应16h，离心除去沉淀物，离心得到的清液为反应液A；将4.4×10-4mmol卵清白蛋白（OVA，分子量为45000）溶于1.5mL 0.02 mol/L 的磷酸缓冲溶液（pH=7.4）中，得溶液B；将溶液B逐滴加至反应液A中，37℃下搅拌过夜，反应液置于超滤管（分子截留量为30 KD）中，离心10min后，加入0.2mol/L pH=7.4的PBS缓冲溶液1mL，再离心，重复操作3～4次，充分洗去未反应完全的小分子物质，收集滤液，取1mL滤液过0.22μm的滤膜，采用高效液相色谱法检测滤液中游离MQCA的浓度；经超滤管截留下的全抗原经冷冻干燥后分装，保存。
实施例3
全抗原（MQCA-KLH）的合成：将25mmol的MQCA溶于0.5mL的二甲基甲酰胺中，再加入25mmol的DIC，搅拌30min，然后加入40mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，37℃避光搅拌反应16h，离心除去沉淀物，离心得到的清液为反应液A；将2.5×10-6mmol的钥孔戚血蓝蛋白（KLH，分子量为8000000）溶于1.5mL 0.02 mol/L 的磷酸缓冲溶液（pH=7.4）中，得溶液B；将溶液B逐滴加至反应液A中，37℃下搅拌过夜，反应液置于超滤管（分子截留量为30 KD）中，离心10min后，加入0.2mol/L pH=7.4的PBS缓冲溶液1mL，再离心，重复操作3～4次，充分洗去未反应完全的小分子物质，收集滤液，取1mL滤液过0.22μm的滤膜，采用高效液相色谱法检测滤液中游离MQCA的浓度；经超滤管截留下的全抗原经冷冻干燥后分装，保存。
实施例4
全抗原产物偶联比的检测：采用高效液相色谱法，所用填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为体积比为60:40的甲醇水混合液，流速1.0ml/min，柱温30℃，紫外检测器：检测波长为320nm，进样量10μL，同时以MQCA标准品绘制标准曲线。
Figure 572059DEST_PATH_IMAGE004
其中，m总为3-甲基喹喔啉-2-羧酸加入的总质量；
C1为游离3-甲基喹喔啉-2-羧酸的浓度；
M2为3-甲基喹喔啉-2-羧酸的摩尔质量；
n为载体蛋白的摩尔数，偶联比为每个载体蛋白分子上结合MQCA的分子个数。
所得全抗原MQCA-BSA、MQCA-OVA、MQCA-KLH的偶联比分别为38.73、32.44、62.56，采用上述高效液相色谱法检测的精密度符合要求（RSD=0.23%）,重现性良好（RSD=1.14%）。
实施例5
将制备好的免疫抗原MQCA-BSA用生理盐水稀释到适量浓度，加等量弗氏完全佐剂制成油包水的乳化剂；按100μg/只共免疫6周龄雌性Balb/C小鼠5次（首剂量加倍）；每隔2W免疫1次；在腹腔、背部、皮下、颈部多点免疫；第2、3、4次免疫时，抗原与等体积弗氏不完全佐剂制成油包水的乳化剂，以同样剂量加强免疫；第5次免疫时，抗原不加佐剂经腹腔注射进行冲刺免疫。末免一周后眼眶采血，分离得到血清。该抗原免疫6只小鼠后，均可得到抗体效价（OD阳性/OD阴性≥2.0时的最大稀释倍数）在128000以上的MQCA多克隆抗体。

Claims (4)

1.喹乙醇残留标示物高偶联比的全抗原合成方法，其特征在于：在N,N'-二异丙基碳二亚胺存在下，3-甲基喹喔啉-2-羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺发生酯化反应，反应产物再与载体蛋白偶联，得到偶联比为32-68的全抗原，
其中，所述N,N'-二异丙基碳二亚胺与3-甲基喹喔啉-2-羧酸的摩尔用量相等，所述3-甲基喹喔啉-2-羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔用量比为1：（1.5～2），所述酯化反应时的反应温度为37℃，所述偶联反应时的反应温度为37℃。
2.根据权利要求1所述喹乙醇残留标示物高偶联比的全抗原合成方法，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔戚血蓝蛋白。
3.根据利要求1所述喹乙醇残留标示物高偶联比的全抗原合成方法，其特征在于，所得全抗原偶联比的检测：将含全抗原的反应液置于超滤管中，离心、洗涤，收集滤液，采用高效液相色谱法检测滤液中游离3-甲基喹喔啉-2-羧酸的浓度，色谱条件：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为体积比为60:40的甲醇水混合液，检测波长为320nm，
Figure 2012101516808100001DEST_PATH_IMAGE001
 
其中，m总为3-甲基喹喔啉-2-羧酸加入的总质量；
C1为游离3-甲基喹喔啉-2-羧酸的浓度；
M2为3-甲基喹喔啉-2-羧酸的摩尔质量；
n为载体蛋白的摩尔数，偶联比为每个载体蛋白分子上结合3-甲基喹喔啉-2-羧酸的分子个数。
4.依权利要求1至2任一所述喹乙醇残留标示物高偶联比的全抗原合成方法制得的全抗原的应用，其特征在于：用于制备喹乙醇残留标示物ELISA检测试剂盒。
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