CN104447383B

CN104447383B - 一种二氢辣椒素人工半抗原、人工抗原及其制备方法

Info

Publication number: CN104447383B
Application number: CN201410673353.8A
Authority: CN
Inventors: 李培武; 马飞; 张奇; 杨青青; 丁小霞; 张良晓
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: CN104447383A

Abstract

本发明请求保护一种二氢辣椒素人工半抗原、人工抗原及其制备方法。二氢辣椒素人工半抗原分子结构式见式Ⅰ，人工抗原的分子结构式见式2。本发明通过将N-(4-羟基-3-甲氧基苄基)壬酰胺的酚羟基进行修饰，提供的二氢辣椒素人工半抗原既最大程度保留了二氢辣椒素类物质的特征结构，可作为抗原决定簇，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。由此得到的特异性二氢辣椒素人工抗原可免疫获得亲和力高，灵敏度高，特异性强的二氢辣椒素抗体。可用于食用植物油中二氢辣椒素的免疫检测。

Description

一种二氢辣椒素人工半抗原、人工抗原及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种二氢辣椒素人工半抗原、人工抗原及其制备方法，属于免疫化学技术领域。

背景技术

近年来，把非正常食用油(俗称地沟油)掺入合格食用油中以获取利益的行为屡禁不止，严重威胁着消费者的健康，成为当前我国食品安全领域亟须解决的问题。

国家科技部、工商总局、质检总局、食品药品监管局、粮食局以及中国疾控中心等7部位联合攻关地沟油鉴定方法，主要包括：重金属含量、多环芳烃、胆固醇、3-氯丙二醇及其酯、粘度、电导率、介电常数等，但由于地沟油来源多、成分复杂，现有检测方法不能实现对通过白土吸附脱色、水洗、真空高温脱臭等精炼处理，掺入正常食用油进行销售的新型地沟油进行识别，迄今仍缺乏能够有效鉴别方法。

我国传统饮食习惯及口味爱好中辣椒是使用量较大、应用范围广泛的调味品，二氢辣椒素是引起辣味的主要化学成分，主要存在于辣椒属植物的果实及种子中。二氢辣椒素具有脂溶性、强稳定性好、沸点高等性质，而餐饮行业的泔水油是地沟油的主要来源之一，目前地沟油加工方法很难完全去除具有以上性质的化合物。正常食用油基本不含二氢辣椒素，而接触过辣椒的餐厨废弃油脂难以避免地含有这类成分，因此二氢辣椒素能够作为鉴别餐厨废弃油脂的特征指标。现有二氢辣椒素的检测方法主要是高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS)，需要对样品进行稀释、过滤、提取、净化，操作复杂、繁琐、检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛查，尤其是现场快速检测的要求。免疫分析是基于抗原、抗体的特异性反应的一种分析方法，在医学上已广泛应用于微量物质的检测。免疫分析具有特异性强、灵敏度高、分析容量大、方便快捷、成本低廉等优点，近年来得到迅速发展。

建立免疫分析方法，首先必须制备出对二氢辣椒素特异性强、亲和力高的抗体。由于二氢辣椒素分子量较小，不具备刺激机体产生针对二氢辣椒素抗原决定簇的特异性抗体，作为小分子抗原其必须与大分子载体偶联后才具有免疫原性。要实现与大分子物质的偶联，半抗原分子上必须具备能共价结合到载体上的活性集团(如氨基、羧基、羟基和巯基等)。影响免疫分析方法的关键因素在于特异的抗原和抗体，因此获得一种可免疫获得特异性好，亲和力高的辣椒素抗体的抗原具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种新型的二氢辣椒素人工半抗原、人工抗原及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案。

本发明提供的二氢辣椒素人工半抗原化合物，具有式Ⅰ所示的分子结构：

其化学名称为(E)-4-[2-甲氧基-4-(壬酰胺甲基)苯氧基]-4-氧-2-丁烯酸。

所提供的二氢辣椒素人工抗原化合物，其分子结构式如式Ⅱ所示：

按上述方案，所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH。

上述二氢辣椒素人工半抗原的合成方法，以N-(4-羟基-3-甲氧基苄基)壬酰胺与顺丁烯二酸酐为原料经酯缩合反应合成二氢辣椒素人工半抗原即化合物I，合成路线如下：

按上述方案，所述二氢辣椒素人工半抗原的制备方法，包括以下步骤：将摩尔比为1:(1.2～1.5):(0.12～0.15)的N-(4-羟基-3-甲氧基苄基)壬酰胺、顺丁烯二酸酐和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)于二氯甲烷中室温搅拌反应，然后置于冰浴中，在0-5℃条件下，将4-二甲氨基吡啶的二氯甲烷溶液缓慢滴加到上述溶液中，所述的N-(4-羟基-3-甲氧基苄基)壬酰胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(0.12～0.15)，撤去水浴，室温反应5-7h，后处理得到二氢辣椒素人工半抗原II。

按上述方案，所述后处理为：将反应液过滤，减压蒸馏除去溶剂得淡黄色的油状物粗产品，然后将该粗产品通过硅胶柱层析，柱层析试剂：体积比为1：1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，脱色即得二氢辣椒素人工半抗原。

上述二氢辣椒素人工抗原的制备，它是将二氢辣椒素人工半抗原通过N,N’-二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后，再与载体蛋白进行偶联得到。

上述二氢辣椒素人工抗原的制备方法，包括以下具体步骤：

(1)将二氢辣椒素人工半抗原在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中室温反应1-2小时，然后加入N,N’-二环己基碳二亚胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应4-6小时，静置过夜，取上清液即活化的二氢辣椒素人工半抗原溶液；

(2)将上清液滴加到载体蛋白浓度大于等于2mg/mL的载体蛋白的磷酸盐缓冲液中，室温反应12-14h，其中：所述步骤(1)中的二氢辣椒素人工半抗原与载体蛋白的摩尔比大于5:1，然后透析得到二氢辣椒素人工抗原，即化合物II。

按上述方案，所述步骤(1)中N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1-1.1。

按上述方案，所述的载体蛋白的磷酸盐缓冲液是将载体蛋白用0.2MpH8的磷酸盐缓冲液溶解得到的。

按上述方案，所述的透析为用0.01MPBS缓冲液透析72h，期间，4-8h更换一次透析液。

按上述方案，所述N-(4-羟基-3-甲氧基苄基)壬酰胺和顺丁烯二酸酐的纯度均大于95wt％。

上述二氢辣椒素人工抗原化合物在制备二氢辣椒素特异性抗体中的应用。

上述二氢辣椒素人工抗原化合物在食用植物油中二氢辣椒素免疫检测中的应用。

二氢辣椒素特异性抗体，它是由上述二氢辣椒素人工抗原经动物免疫得到的可与二氢辣椒素发生特异性免疫反应的球蛋白。

本发明的有益效果：

本发明通过将N-(4-羟基-3-甲氧基苄基)壬酰胺的酚羟基进行修饰，提供的二氢辣椒素人工半抗原既最大程度保留了二氢辣椒素类物质的特征结构(二氢辣椒素主要分子结构中的香草基胺和部分脂肪链基团)，可作为抗原决定簇，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。进而由此得到的特异性二氢辣椒素人工抗原可免疫获得亲和力高，灵敏度高，特异性强的二氢辣椒素抗体。实验结果表明，用本发明提供的特异性二氢辣椒素人工抗原免疫动物得到的抗血清效价可达4000，对二氢辣椒素的半抑制浓度IC₅₀值为3.06μg/mL，经常规交叉反应测定，该抗体与氰戊菊酯、溴氰菊酯等化学残留污染物及黄曲霉毒素等生物毒素污染物均无交叉反应，表明抗体可以特异性与二氢辣椒素反应。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法、胶体金试纸快速检测法和免疫亲和柱液相色谱检测法，为食用植物油掺伪保真提供关键技术支撑。

附图说明

图1本发明合成的二氢辣椒素人工抗原紫外光谱图。图中：1：二氢辣椒素人工半抗原，2：载体蛋白，3：二氢辣椒素人工抗原。

具体实施方式

下述实例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

二氢辣椒素人工半抗原的制备

称取N-(4-羟基-3-甲氧基苄基)壬酰胺5.86g、顺丁烯二酸酐2.36g和N,N’-二环己基碳二亚胺0.49g，25mL二氯甲烷于反应瓶中室温反应0.5h，然后将上述反应液置于冰浴中使其温度控制在0～5℃范围内，取4-二甲氨基吡啶0.30g和4mL二氯甲烷置于恒压滴液漏斗中充分混匀，缓慢向反应瓶中滴加，0.5h滴加完毕，待滴加完毕，保持室温25℃条件继续搅拌6小时，将反应液过滤，减压蒸馏除去溶剂得淡黄色的油状物粗产品，然后将该粗产品通过硅胶柱层析，柱层析试剂：石油醚和乙酸乙酯体积比为1：1的混合溶液，脱色得到二氢辣椒素半抗原(E)-4-[2-甲氧基-4-(壬酰胺甲基)苯氧基]-4-氧-2-丁烯酸，分子式为C₂₁NO₆H₂₉。

该化合物与二氢辣椒素化合物的同源性大于90％。经质谱鉴定，其分子离子峰为ESI-MS390(M-H)^-，与其结果的理论值一致，表明该半抗原化合物成功合成。

实施例2

二氢辣椒素人工抗原的制备

称取二氢辣椒素半抗原(E)-4-[2-甲氧基-4-(壬酰胺甲基)苯氧基]-4-氧-2-丁烯酸6mg，再称取10mgNHS，用0.2mLDMF溶解于反应装置中，反应在磁力搅拌下室温(25-27℃)进行1h；称取DCC20mg溶于200uLDMF中，逐滴加入上述反应装置中，室温反应4h，白色沉淀生成，静置过夜，8000r/min，5min离心，取上清；

将上清液缓慢分别滴加到10ml2mg/mL的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中室温搅拌反应12h；所述牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液是将牛血清白蛋白用0.2MpH8的磷酸盐缓冲液溶解得到的。然后用0.01MPBS缓冲液透析72h，4-8h更换一次透析液，即得到二氢辣椒素人工抗原。紫外-可见光谱连续扫描图谱见图1，鉴定结果表明人工抗原偶联成功。

实施例3

二氢辣椒素抗血清的制备

以实施例2取制得的二氢辣椒素人工抗原400uL为免疫原，与等体积弗氏完全佐剂混合乳化完全后，免疫Balb/c小鼠4只，背部皮下多点注射。初次免疫采用弗氏完全佐剂乳化，以后采用不完全佐剂乳化，每只100ug/次，初次免疫和第二次免疫间隔4周，以后每次免疫间隔3周，共免疫4次。从二免开始，每次免疫后7～10d对小鼠进行尾部采血，每只小鼠约25μL，血样于37℃放置半小时后，5000r/min离心1min，取上清与等体积甘油混合，-20℃保存备用，进行效价检测。

实施例4

二氢辣椒素抗血清的测定

一、采用间接ELISA方法检测血清效价，具体操作步骤如下：

包被：将二氢辣椒素包被原用0.1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释到0.6μg/mL，100μL/孔，37℃反应2h。倾去包被液，PBST满孔洗涤3次，扣干。所述二氢辣椒素包被原的制备方法同实施例2，不同在于将载体蛋白由牛血清白蛋白换为卵清白蛋白。

封闭：1％OVAPBST溶液，200μL/孔，37℃温育1h，PBST满孔洗涤3次，扣干。

抗体抗原特异性反应：将实施例3所得二氢辣椒素抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，加入量为100μL/孔，设置阴性和空白对照孔，阴性对照血清稀释1000倍，空白只加PBST，37℃温育1h，PBST满孔洗涤3次，扣干；

加二抗：用PBST溶液将羊抗鼠酶标二抗5000倍稀释，混匀，加入量为100μL/孔，37℃温育1h，PBST满孔洗涤6次，扣干。

显色：显色液(含1mg/mL四甲基联苯胺0.5mL、柠檬酸缓冲液9.5mL、1％的过氧化氢脲32μL)现配现用，100μL/孔，避光37℃温育15min。

终止：2mol/L的H₂SO₄，50μL/孔，立即用酶标仪测定450nm处吸光值即OD₄₅₀值。

结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于1时所对应的血清最高稀释倍数为血清的ELISA效价。

二、最低检测限、半抑制以及特异性的检测

具体操作步骤如下：

(1)用上述的间接ELISA方法确定抗体的工作浓度，以OD₄₅₀为1左右时所对应的抗体浓度为最适工作浓度。

(2)包被、洗涤和封闭：方法操作同上书间接ELISA法。

(3)配制二氢辣椒素标准溶液：将二氢辣椒素用甲醇溶液配制成1mg/mL的母液。加样前，按照稀释倍数为5，采用10％的甲醇/PBS(0.01mol/LpH7.4)溶液从100μg/mL开始稀释成需要的各浓度辣椒素标准溶液。每孔加入50μL倍比稀释的二氢辣椒素标准溶液，然后每孔再加入50μL稀释倍数为4000的实施例3中四免后的抗血清，37℃反应1h。

(4)加二抗、显色、终止和读数：方法操作同上述间接ELISA法。

(5)数据处理：以二氢辣椒素各浓度的对数为横坐标，以二氢辣椒素各浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算50％抑制浓度(IC₅₀，即OD₄₅₀值从零标准溶液对应的AO下降到50％时所对应的标准品浓度)，从而判定抗血清是否与二氢辣椒素反应。

结果显示，四免后，Balb/c小鼠抗血清效价可达4000，对二氢辣椒素的50％抑制浓度为3.06μg/mL，表明成功制备出二氢辣椒素抗体。经常规交叉反应测定，该抗体与氰戊菊酯、溴氰菊酯等化学残留污染物及黄曲霉毒素等生物毒素污染物均无交叉反应，表明抗体可以特异性与二氢辣椒素反应。

综上，上述二氢辣椒素半抗原、人工抗原是可以制备出亲和力高，灵敏度高的二氢辣椒素特异性抗体。

Claims

1.二氢辣椒素人工半抗原化合物，其特征在于：它具有式Ⅰ所示的分子结构：

其化学名称为(E)-4-[2-甲氧基-4-(壬酰胺甲基)苯氧基]-4-氧代-2-丁烯酸。

2.二氢辣椒素人工抗原化合物，其分子结构式如式Ⅱ所示：

所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH。

3.权利要求1所述的二氢辣椒素人工半抗原化合物的合成方法，其特征在于：以N-(4-羟基-3-甲氧基苄基)壬酰胺与顺丁烯二酸酐为原料经酯缩合反应合成二氢辣椒素人工半抗原化合物I，合成路线如下：

4.根据权利要求3所述的二氢辣椒素人工半抗原化合物的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：将摩尔比为1:(1.2～1.5):(0.12～0.15)的N-(4-羟基-3-甲氧基苄基)壬酰胺、顺丁烯二酸酐和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)于二氯甲烷中室温搅拌反应，然后置于冰浴中，在0-5℃条件下，将4-二甲氨基吡啶的二氯甲烷溶液缓慢滴加到上述溶液中，所述的N-(4-羟基-3-甲氧基苄基)壬酰胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(0.12～0.15)，撤去水浴，室温反应5-7h，后处理得到二氢辣椒素人工半抗原化合物Ⅰ。

5.权利要求2所述的二氢辣椒素人工抗原化合物的制备方法，其特征在于：它是将二氢辣椒素人工半抗原通过N,N’-二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后，再与载体蛋白进行偶联得到。

6.根据权利要求5所述的二氢辣椒素人工抗原化合物的制备方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

7.权利要求2所述的二氢辣椒素人工抗原化合物在制备二氢辣椒素特异性抗体中的应用。

8.权利要求2所述的二氢辣椒素人工抗原化合物在食用植物油中二氢辣椒素免疫检测中的应用。

9.二氢辣椒素特异性抗体，它是由权利要求2所述的二氢辣椒素人工抗原经动物免疫得到的可与二氢辣椒素发生特异性免疫反应的球蛋白。