CN105319356A - 一种用于黄曲霉毒素b1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于黄曲霉毒素b1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用，它是以羧基磁珠为载体，黄曲霉毒素B1单克隆抗体为识别中间体，经过活化-偶联-洗涤-封闭的过程制备出偶联有黄曲霉毒素B1单克隆抗体的免疫磁珠，在合适的缓冲液中于一定条件下孵育可以高效捕捉、富集检测样本中的黄曲霉毒素B1。本发明用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠具有浓缩待测样品中黄曲霉毒素B1浓度、提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品处理时间达到快速检测的优点。

Description

一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及黄曲霉毒素B1样本的富集净化处理工艺，具体涉及一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用。
背景技术
黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1简写为AFB1)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。中国食品卫生标准中规定了几种主要易受污染的食物中黄曲霉毒素B1的允许量标准，玉米、花生、花生油中黄曲霉毒素B1允许量为≤20μg/kg；其他食用油为≤10μg/kg；其他粮食、豆类、发酵食品为≤5μg/kg。
目前食品中黄曲霉毒素B1的主要提取方法包括有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法等。有机溶剂萃取法是目前最普遍的提取方法，但有机溶剂的萃取存在过程复杂、毒性大、所需时间长等缺点，而且由于最终提取物中可能存在其他荧光物质、色素、结构类似物，从而对检测结果产生干扰；免疫亲和层析提高了试样的净化效果，同时可显著减少有毒有害试剂的使用，但样品前处理较复杂，所用设备价格昂贵，对操作人员的技术要求也比较高，不适合于大批量样本检测及大范围推广的应用。
免疫磁珠分离技术(Immunomagneticbead-basedseparation，IMS)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠(Immunomagneticbead，IMB)既可结合活性蛋白质抗体，又可被磁铁吸引，经过处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其它物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠(IMB)是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了显著成绩。近年来IMB以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等标本中真菌毒素的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。
在分离真菌毒素方面，IMB可有效地收集、浓缩大量样品中的少量真菌毒素，可避免有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法提取时存在的缺点。IMB对目的毒素的富集具有高分离率、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、操作简便、样品用量少且不会破坏毒素结构等优点，与常规方法相比，不需要多加纯化步骤去除杂质，可直接对真菌毒素产生富集分离纯化的效果，并可在2-5h内完成。并且磁珠上偶联的抗体可准确识别真菌毒素上的特征基团，从而减少漏检，减少安全隐患。
本发明利用磁珠与抗体的偶联原理对可富集黄曲霉毒素B1的免疫磁珠的制备工艺及应用条件进行了优化，大大提高了对黄曲霉毒素B1的富集能力和检测灵敏度，同时凭借免疫磁珠自身的快速方便、价格低廉的特点，将其应用于谷物及饲料中黄曲霉毒素B1的分离与富集，可以进一步提高快速检测黄曲霉毒素B1的效率。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术存在的不足，提供一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用，以解决黄曲霉毒素B1样品净化分离操作复杂、分离效率低、存在较大安全隐患的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：提供一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶联有黄曲霉毒素B1单克隆抗体；所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体是用黄曲霉毒素B1人工抗原免疫白鼠所得到的；所述黄曲霉毒素B1人工抗原是黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式Ⅰ所示：
所述黄曲霉毒素B1半抗原是按照如下方法制备得到的：
62mg黄曲霉毒素B1溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)，60℃下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0.1mL吡啶在1mLDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到黄曲霉毒素B1的对苯二胺单缩合物，得到黄曲霉毒素B1半抗原，得率90％。
所述黄曲霉毒素B1人工抗原是按照如下方法制备得到的：
取半抗原9.4mg，用2mL0.1mol/LHCl溶解，得到溶液A。取亚硝酸钠20mg用1mL水溶解，逐滴加入到溶液A中。用碘化钾试纸检测，室温搅拌反应30min。取50mgBSA，用4mL水溶解，得到溶液B。将溶液A缓慢加入到溶液B中，室温搅拌反应过夜。用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到黄曲霉毒素B1人工抗原。
所述黄曲霉毒素B1半抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
本发明还提供了一种上述免疫磁珠的制备方法，是以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠可与黄曲霉毒素B1单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化黄曲霉毒素B1的免疫磁珠；
上述免疫磁珠的制备方法具体描述如下：
(1)清洗：取100μL羧基磁珠于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；
(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/LMES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；
(3)偶联：将黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶解到60μLpH5.0、25mmol/LMES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μLpH7.4的TRIS溶液反应15min封闭磁珠；
(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％吐温-20的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％BSA、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN3的TRIS溶液中，2-8℃保存备用。
本发明同时提供了上述免疫磁珠在富集净化黄曲霉毒素B1中的应用。
实验证明，本发明用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠对黄曲霉毒素B1有很高的富集率和回收率，对黄曲霉毒素B1的富集率为25ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕获25ng黄曲霉毒素B1)，对黄曲霉毒素B1的回收率达到85％以上。本发明用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠可以高效、准确、可靠、快速、简便地把待检样品中的黄曲霉毒素B1富集起来，以便进一步应用于化学分析仪器检测(HPLC，高效液相色谱法)、酶联免疫吸附法检测和胶体金测试条的快速测试，具有浓缩待测样品中黄曲霉毒素B1浓度、提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品处理时间达到快速检测的优点。
附图说明
图1黄曲霉毒素B1半抗原合成路线图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，即为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠的制备
本实施例给出了由黄曲霉毒素B1单克隆抗体和含羧基的免疫磁珠偶联得到的偶联物作为富集净化黄曲霉毒素B1的免疫磁珠的制备方法。该方法包括：
一、黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备
1、黄曲霉毒素B1半抗原的合成(合成路线见附图1)及鉴定
62mg黄曲霉毒素B1溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)，60℃下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0.1mL吡啶在1mLDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到黄曲霉毒素B1的对苯二胺单缩合物，得到黄曲霉毒素B1半抗原，得率90％。
取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，7.0ppm左右增加的2组芳环信号峰，说明半抗原合成成功。
2、黄曲霉毒素B1人工抗原的合成及鉴定
取半抗原9.4mg，用2mL0.1mol/LHCl溶解，得到溶液A。取亚硝酸钠20mg用1mL水溶解，逐滴加入到溶液A中。用碘化钾试纸检测，室温搅拌反应30min。取50mgBSA，用4mL水溶解，得到溶液B。将溶液A缓慢加入到溶液B中，室温搅拌反应过夜。用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到黄曲霉毒素B1人工抗原，分装后-20℃保存。
按合成黄曲霉毒素B1人工抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。偶联物黄曲霉毒素B1半抗原-BSA的最大吸收峰与黄曲霉毒素B1半抗原、BSA的最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明黄曲霉毒素B1半抗原-BSA的合成是成功的。经计算，半抗原与BSA的结合比为15:1。
3、黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备
(1)杂交瘤细胞的获得
1)首次免疫：将黄曲霉毒素B1半抗原-BSA偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，每只0.2mL；
2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；
3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1mL，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；
4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌黄曲霉毒素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。
(2)单克隆抗体的制备
1)细胞复苏：取出黄曲霉毒素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液(-20℃保存)。
(3)单克隆抗体效价的测定
用竞争ELISA法测定抗体的效价为1:(60000～120000)。
竞争ELISA方法：用黄曲霉毒素B1人工抗原包被酶标板，加入黄曲霉毒素B1标准品溶液、辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体，25℃反应10min，倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应5min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。
(4)单克隆抗体特异性的测定
抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。
本实验将黄曲霉毒素M1、T-2毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、展青霉素做系列稀释，分别与单克隆抗体进行竞争ELISA，制作标准曲线，分析得到IC50，然后按下式计算交叉反应率：
结果显示各类似物的交叉反应率为：黄曲霉毒素B1为100％、黄曲霉毒素M1＜1％、T-2毒素＜1％、赭曲霉毒素A＜1％、玉米赤霉烯酮＜1％、展青霉素＜1％。本发明抗体对黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、展青霉素等其他真菌毒素无交叉反应，只针对黄曲霉毒素B1有特异性结合。
二、免疫磁珠的制备
该过程以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠可与黄曲霉毒素B1单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化黄曲霉毒素B1的免疫磁珠。具体步骤如下：
(1)清洗：取100μL羧基磁珠(购于DYNAL，粒径为2.8μm，含量是0.15eq/g)于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；
(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/LMES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；
(3)偶联：将黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶解到60μLpH5.0、25mmol/LMES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μLpH7.4的TRIS溶液反应15min封闭磁珠；
(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％BSA、0.1％吐温-20的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％BSA、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN3的TRIS溶液中(浓度为10mg/mL)，2-8℃保存备用。
实施例2免疫磁珠的特性检测
取按照实施例1制备的富集黄曲霉毒素B1的免疫磁珠0.1mL(浓度为10mg/mL)于10mL离心管中，用5mL去离子水润洗磁珠2次，磁分离后移除上清；然后加入1mL待测样品(将黄曲霉毒素B1标准品用PBS缓冲液分别配制成浓度为5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL的黄曲霉毒素B1溶液作为待测样品，并以PBS缓冲液作为空白待测样品)，混匀，25℃捕获20min，期间5min混匀一下磁珠；磁分离后移除上清，用5mL去离子水润洗磁珠2次，除去干扰杂质。最后加入1mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用HPLC法按照“GB/T30955-2014饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法”检测待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。结果见表1。
表1免疫磁珠的特性检测结果
结果表明：①空白待测样品用洗脱液洗脱，未检出黄曲霉毒素B1；②当标准品量在5ng～25ng之间时，用洗脱液洗脱出的黄曲霉毒素B1分别为4.52ng、9.23ng、12.97ng、17.76ng、22.84ng，回收率均达到了85％以上；③当标准品量大于25ng时，免疫磁珠偶联上的黄曲霉毒素B1趋向饱和，回收率反而下降。说明用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠对黄曲霉毒素B1的富集率为25ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕获25ng黄曲霉毒素B1)，对黄曲霉毒素B1的回收率达到85％以上。
实施例3免疫磁珠的使用方法
1、样品前处理
用均质器均质样品；称取5.0±0.05g样品至样品瓶中，分别加入1.0±0.05g氯化钠，25ml60％甲醇溶液，用涡旋仪涡旋5min，或者摇床震荡20min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；(如不具备离心条件，该步骤也可用如下操作替代：静置后取10ml上清液过滤)吸取5ml(相当于1g样品)离心上清液/滤液，加入5ml去离子水，混匀，待用。(用于磁珠捕获)。
2、免疫磁珠捕获
取黄曲霉毒素B1免疫磁珠0.2ml于10ml离心管中，用5ml去离子水润洗磁珠2次，每次用磁分离架分离洗液(每次在磁分离架上静置3min，确保磁珠全部吸附)；向润洗好的黄曲霉毒素B1免疫磁珠中加入处理好的样本5ml，混匀，25℃，20min，期间5min混匀一下磁珠；用磁分离架分离免疫磁珠，用去离子水液冲润洗免疫磁珠2次，每次5ml(方法同免疫磁珠润洗)。
3、免疫磁珠洗脱
用1ml甲醇洗免疫磁珠，混匀，静置1min，用磁分离架分离免疫磁珠，回收甲醇液，用于检测分析，即为富集净化后的黄曲霉毒素B1样品，可应用于化学分析仪器检测(HPLC，高效液相色谱法)、酶联免疫吸附法检测或胶体金测试条的快速测试。

Claims (6)

1.一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠，其特征在于：所述免疫磁珠上偶联有黄曲霉毒素B1单克隆抗体；所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体是用黄曲霉毒素B1人工抗原免疫白鼠所得到的；所述黄曲霉毒素B1人工抗原是黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式Ⅰ所示：
2.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于：所述黄曲霉毒素B1人工抗原是按照如下方法制备得到的：
取半抗原9.4mg，用2mL0.1mol/LHCl溶解，得到溶液A；取亚硝酸钠20mg用1mL水溶解，逐滴加入到溶液A中；用碘化钾试纸检测，室温搅拌反应30min；取50mgBSA，用4mL水溶解，得到溶液B；将溶液A缓慢加入到溶液B中，室温搅拌反应过夜；用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到黄曲霉毒素B1人工抗原。
所述黄曲霉毒素B1半抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
3.根据权利要求1或2所述的免疫磁珠，其特征在于：所述黄曲霉毒素B1半抗原是按照如下方法制备得到的：62mg黄曲霉毒素B1溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)，60℃下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0.1mL吡啶在1mLDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到黄曲霉毒素B1的对苯二胺单缩合物，得到黄曲霉毒素B1半抗原，得率90％。
4.一种权利要求1所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠可与黄曲霉毒素B1单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化黄曲霉毒素B1的免疫磁珠。
5.根据权利要求4所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
(1)清洗：取100μL羧基磁珠于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；
(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/LMES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；
(3)偶联：将黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶解到60μLpH5.0、25mmol/LMES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μLpH7.4的TRIS溶液反应15min封闭磁珠；
(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％牛血清白蛋白、0.1％吐温-20的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％牛血清白蛋白、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN3的TRIS溶液中，2-8℃保存备用。
6.权利要求1所述免疫磁珠在富集净化黄曲霉毒素B1中的应用。
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