CN116165047A - 一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒、使用方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物材料技术领域，具体公开了一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒、使用方法及其应用。本申请提供的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒包括：溴化氰活化的免疫磁珠、黄曲霉毒素单克隆抗体、偶联缓冲溶液和封闭试剂；其中，溴化氰活化的免疫磁珠是溴化氰活化的磁性微球，磁性微球表面包覆有琼脂糖高分子层；黄曲霉毒素单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌获得；本申请还提供了上述净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒的使用方法及其在谷物、坚果、中药材、饲料检测中的应用。本申请提供的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒能够用于富集和提取中药材中的黄曲霉毒素，具有提取效率高、操作简单等优点。

Description

一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒、使用方法及其应用

技术领域

本申请涉及生物材料技术领域，具体涉及一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒、使用方法及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等产生的一组结构类似的次生代谢产物，是一组以二吠喃香豆素为基本结构的化合物，目前已分离鉴定出12种，主要存在于谷物、坚果、中药材、饲料相关的产品中。在农作物被收获后，极容易被B1、B2、G1、G2这几种黄曲霉毒素污染，当人类或动物食用被黄曲霉毒素污染的上述产品后，黄曲霉毒素会在体内富集，进而对人体和动物的肝脏、肾脏等组织和器官造成危害。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。

目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层层析法、酶联免疫吸附法、金标试纸法及高效液相色谱法。其中，薄层层析法是将样品在薄层板上分离，然后在一定紫外波长下，根据薄层板上显示的荧光最低检出量来测定黄曲霉毒素的含量，但是其样品前处理过程复杂、检测操作步骤多、且重现性较差。酶联免疫吸附法是基于抗原与抗体的特异性结合以及后续的酶对底物显色反应的高效催化作用，利用仪器检测被酶催化生成产物的量，从而获得黄曲霉毒素的含量，目前该方法主要用于黄曲霉毒素B1、M1的检测，对其他黄曲霉毒素以及有机溶液中的黄曲霉毒素校测效果不佳。金标试纸法是利用胶体金标记单克隆抗体而设计的定性或定量检测方法，该方法对于低含量的黄曲霉毒素的检测准确度不高。而高效液相色谱法不受限于有机溶剂，并且样品适用性广、结果准确度与重现性高，故非常适用于检测样品中的黄曲霉毒素。

无论利用上述何种检测方法，均需要对待测样品进行前处理，使样品中的黄曲霉毒素被富集并提取出来。目前，黄曲霉毒素的提取主要是采用固相萃取柱净化提取，然而利用上述方法提取过程中，一方面会消耗大量的有机溶剂，对人员与环境造成损伤；另一方面其提取效率并不理想，导致后续分析检测的灵敏度和特异性较差。因此，目前急需提供一种提取效率高、溶剂使用量较少的黄曲霉毒素提取方法来实现样品中黄曲霉毒素的富集、净化与提取，从而实现待测样品中黄曲霉毒素的准确检测。

发明内容

为了高效提取样品中的黄曲霉毒素，实现样品中黄曲霉毒素的准确检测，本申请提供一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒、使用方法及其应用。

第一方面，本申请提供一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒，采用如下的技术方案：

一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒，所述免疫磁珠试剂盒包括：溴化氰活化的免疫磁珠、黄曲霉毒素单克隆抗体、偶联缓冲溶液和封闭试剂。

本申请提供一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒，该免疫磁珠试剂盒是以溴化氰活化的免疫磁为固相载体，通过与黄曲霉毒素单克隆抗体进行偶联、封闭，从而制备出一种免疫磁珠，将该免疫磁珠与待测样品混合，能够实现对待测样品中黄曲霉毒素的富集、净化与提取，具有操作简单、提取效率高等优点，最终能够实现待测样品中黄曲霉毒素的准确检测。本申请提供的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2均能够实现富集、净化与提取，因此具有广泛的使用前景。

免疫磁珠分离技术是一种新的免疫学技术，本申请提供的免疫磁珠试剂盒提取样品中的黄曲霉毒素的过程中，有效结合了免疫磁珠分离技术中免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性，因此具有特异性强、敏度高、简单便捷的优点。

优选地，所述溴化氰活化的免疫磁珠是溴化氰活化的磁性微球，所述磁性微球表面包覆有琼脂糖高分子层。

进一步地，所述磁性微球为磁性四氧化三铁。

优选地，所述磁性微球的粒径为20-60μm。

优选地，所述偶联缓冲溶液选自柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液、碳酸盐缓冲液和硼砂缓冲液；所述封闭试剂选自为Tris-HCl、牛血清蛋白、酪蛋白、乙胺和乙醇胺。

优选地，所述黄曲霉毒素单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌获得。

第二方面，本申请提供一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：偶联、封闭；

偶联：将盐酸溶液加入到所述溴化氰活化的免疫磁珠中，离心去上清，并加入pH为6.8-8.2的偶联缓冲溶液进行复溶，获得溶胀的磁珠微球；然后将所述黄曲霉毒素单克隆抗体加入到所述溶胀的磁珠微球中，充分混匀，离心，弃上清液，获得磁珠微球基质。

优选地，所述偶联缓冲溶液的pH为6.8-7.5。

本申请中，通过试验探究了不同pH的偶联缓冲溶液条件下，免疫磁珠对黄曲霉毒素的最大载量以及免疫磁珠与黄曲霉毒素的偶联率，试验结果表明，当偶联缓冲溶液的pH在6.8-8.2范围内时，每100uL免疫磁珠对黄曲霉毒素的最大载量为460-560ng，免疫磁珠与抗体的偶联率＞80%，说明偶联缓冲溶液的pH对免疫磁珠偶联抗体的偶联率会产生影响。且进一步对比发现，将偶联剂缓冲溶液的pH控制在6.8-7.5之间时，免疫磁珠对黄曲霉毒素的最大载量更高、免疫磁珠与抗体的偶联率更高。

在一些实施方案中，所述偶联缓冲溶液的pH可以为7-7.5或7.5-8。

在一个具体的实施方案中，所述偶联缓冲溶液的pH还可以为7、7.5或8。

优选地，所述封闭步骤为：将磁珠微球基质转移至封闭试剂中，静置然后离心，弃上清液，最后用pH为6.5-7.5的PBS溶液复溶，获得免疫磁珠。

在一些实施方案中，所述PBS溶液的pH可以为6.5-7或7-7.5。

在一个具体的实施方案中，所述PBS溶液的pH还可以为6.5、7或7.5。

第三方面，本申请提供一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒在谷物、坚果、中药材、饲料检测中的应用。

第四方面，本申请提供一种利用净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法，采用如下的技术方案：

一种利用净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：中药材前处理、提取磁吸；

中药材前处理：向中药材试样中加入提取试剂，并采用高速涡旋的方法进行提取，过滤，获得样品滤液；所述提取试剂为甲醇水溶液或乙腈水溶液；

在一些实施方案中，所述提取试剂可以为50-90%甲醇水溶液、50-70%甲醇水溶液、70-90%甲醇水溶液、50-90%乙腈水溶液、50-70%乙腈水溶液或70-90%乙腈水溶液。

在一个具体的实施方案中，所述提取试剂还可以为50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液、90%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液或90%乙腈水溶液。

优选地，所述提取试剂为50-90%乙腈水溶液。

本申请提供一种利用净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法，该方法首先采用提取试剂对中药材进行前处理，然后再利用免疫磁珠试剂盒对中药材中的黄曲霉毒素进行聚集、净化与提取，从而获得黄曲霉毒素。上述中药材前处理步骤中采用甲醇水溶液或乙腈水溶液的提取试剂均能实现黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2的提取；进一步根据试验结果发现，采用乙腈水溶液进行前处理，获得的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2的回收率更高。

优选地，所述提取磁吸步骤为：首先配制免疫磁珠溶液；然后向其中加入样品滤液，磁吸、弃上清液；再加入含有吐温-20的PBS溶液，磁吸、弃上清液；最后加入甲醇，涡旋混匀、磁吸、收集洗脱液，即获得黄曲霉毒素。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1. 本申请提供一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒，该免疫试剂盒能够富集、净化与提取样品中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，具有提取效率高、操作方法简单等优点，能够实现样品中黄曲霉毒素含量的准确检测。

2. 本申请将净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒的使用方法中，偶联缓冲溶液的pH控制为6.8-8.2，所得每100uL免疫磁珠对黄曲霉毒素的最大载量为460-560ng，免疫磁珠的偶联率＞80%；且进一步将偶联剂缓冲溶液的pH控制在6.8-7.5之间时，免疫磁珠对黄曲霉毒素的最大载量更大，免疫磁珠与黄曲霉毒素抗体的偶联率更高。

3. 本申请提供的利用净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法中，进一步选用50-90%乙腈水溶液作为提取试剂对中药材进行前处理，获得的黄曲霉毒素B1回收率高达80.2-91.2%、黄曲霉毒素B2的回收率高达82.4-93.5%、黄曲霉毒素G1的回收率高达81.5-90.4%、黄曲霉毒素G2的回收率高达79.6-89.6%。

附图说明

图1是本申请提供的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法流程图。

图2是利用本申请实施例10提供的方法获得的黄曲霉毒素的HPLC分析谱图。

具体实施方式

本申请提供一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒，包括：溴化氰活化的免疫磁珠、黄曲霉毒素单克隆抗体、偶联缓冲溶液和封闭试剂。其中，溴化氰活化的免疫磁珠是表面包裹有琼脂糖高分子层的磁性四氧化三铁，磁性四氧化三铁的粒径为20-60μm；偶联缓冲溶液选自柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液、碳酸盐缓冲液和硼砂缓冲液；封闭试剂选自为Tris-HCl、牛血清蛋白、酪蛋白、乙胺和乙醇胺；黄曲霉毒素单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌获得。

本申请还提供上述净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

（1）偶联：将盐酸溶液加入到所述溴化氰活化的免疫磁珠中，离心去上清，并加入pH为6.8-8.2的偶联缓冲溶液进行复溶，获得溶胀的磁珠微球；然后将所述黄曲霉毒素单克隆抗体加入到所述溶胀的磁珠微球中，充分混匀，离心，弃上清液，获得磁珠微球基质。进一步地，偶联缓冲溶液的pH为6.8-7.5。

（2）封闭：将磁珠微球基质转移至封闭试剂中，静置然后离心，弃上清液，最后用pH为6.5-7.5的PBS溶液复溶，获得免疫磁珠。

本申请提供利用上述净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法，如图1所示，包括以下步骤：

（1）中药材前处理：称取中药材试样于离心管中，然后向中药材试样中加入甲醇水溶液或乙腈水溶液，并采用高速涡旋提取仪提取10-20min，定性滤纸过滤，获得样品滤液；进一步地，乙腈水溶液的浓度为50-90%。

（2）提取磁吸：

（2.1）量取0.1%吐温-20的PBS于离心管中，然后吸取免疫磁珠，并加入至离心管中，获得免疫磁珠溶液。

（2.2）量取步骤（1）获得的样品滤液加入至上述离心管中，在20-25℃下采用end-over-end的方式充分混匀，时间为5-10min；然后将离心管置于磁力架上，磁吸1-2min，使得离心管中的免疫磁珠吸到离心管侧壁，吸出并丢弃离心管中的液体；

（2.3）量取含有0.1%吐温-20的PBS溶液加入至上述离心管中，在20-25℃下采用end-over-end的方式充分混匀，时间为1-3min；然后将离心管置于磁力架上，磁吸1-2min，使得离心管中的免疫磁珠吸到离心管侧壁，吸出并丢弃离心管中的液体；

（2.4）量取色谱级甲醇注入至上述离心管中，涡旋混匀3-5min；然后将离心管置于磁力架上，磁吸1-2min，使得离心管中的免疫磁珠吸到离心管侧壁；吸出离心管中的液体，即为黄曲霉毒素。

本申请中，采用的杂交瘤细胞的保藏编号为CGMCC NO.5506；溴化氰活化的免疫磁珠为冻干粉状，由北京中检维康生物技术有限公司自制；中药材试样为决明子，购自中药材市场，实验前经过研磨处理；其余原料、试剂、溶剂等均可通过商购获得。

以下结合制备例、实施例、附图说明及性能检测试验对本申请作进一步详细说明。

制备例1

制备例1提供一种抗黄曲霉毒素单克隆抗体。

上述黄曲霉毒素单克隆抗体的制备方法为：将冻存的5506杂交瘤细胞于T75培养瓶中扩大培养，当细胞生长密度达到5~10×10⁶/mL时，将细胞转入到1L的培养瓶中培养，连续培养10天左右，待细胞活率＜50%时，收取培养液，8000rpm离心10min收集上清，使用蛋白A柱子纯化抗体，最后得到黄曲霉毒素单克隆抗体。

制备例2

制备例2提供一种利用净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒配制得到的免疫磁珠，具体包括以下步骤：

（1）偶联：将0.1M盐酸溶液加入到1.0g溴化氰活化的免疫磁珠中，2000rpm离心去上清，并加入pH为7的磷酸盐缓冲液进行复溶，获得溶胀的磁珠微球；然后将5.0g黄曲霉毒素单克隆抗体加入到溶胀的磁珠微球中，在25℃下采用end-over-end的方式充分混匀，时间为12h，2000rpm离心去上清，获得磁珠微球基质。

（2）封闭：将磁珠微球基质转移至0.1M封闭试剂中，在25℃下静置2-4h，然后2000rpm下离心5min，弃上清液，最后用pH为7.0的PBS溶液复溶，获得免疫磁珠。

制备例3

按照制备例2的方法进行制备例3，不同之处在于：（1）偶联步骤中磷酸盐缓冲液的pH为7.5。

制备例4

按照制备例2的方法进行制备例4，不同之处在于：（1）偶联步骤中磷酸盐缓冲液的pH为8。

制备例5

按照制备例2的方法进行制备例5，不同之处在于：（1）偶联步骤中偶联缓冲溶液为硼砂缓冲液，pH为8。

制备例6

按照制备例2的方法进行制备例6，不同之处在于：（2）封闭步骤中PBS溶液的pH为7.5。

对比制备例1

按照制备例2的方法进行对比制备例1，不同之处在于：（1）偶联步骤中磷酸盐缓冲液的pH为6.5。

对比制备例2

对比制备例2提供一种免疫磁珠，其制备方法的具体步骤为：取表面具有氨基的磁性微球，用0.1M、pH为8.4的硼砂缓冲液洗涤5次，按照每毫克磁性微球加入10％抗体的比例，加入黄曲霉毒素抗体，在25℃的条件下充分混匀，反应1小时，反应结束后，采用硼砂缓冲液清洗磁性微球，以洗去未反应的黄曲霉毒素抗体；加入10％牛血清蛋白，在25℃的条件下充分混匀，反应1-5小时，反应结束后，获得免疫磁株。

性能检测试验

检测制备例2-6、对比制备例1-2提供的免疫磁珠对黄曲霉毒素的最大载量以及免疫磁珠与抗体的偶联率，检测结果如表1所示：

1. 每100μL免疫磁珠的对黄曲霉毒素的最大载量的检测方法为：将净体积为100uL的免疫磁珠配成磁珠结合液，然后将5000ng黄曲霉毒素B1加入到磁珠结合中；然后参考实施例10中步骤（2）的方法对待测样品进行提取磁吸，并检测提取出的黄曲霉毒素B1的含量，即为免疫磁珠的最大载量。

2. 免疫磁珠偶联率的检测方法为：利用HPLC检测各制备例偶联步骤结束后上清液中的黄曲霉毒素抗体含量，从而计算免疫磁珠与抗体的偶联率，计算方法如下：

偶联率=（5-偶联缓冲液中黄曲霉毒素抗体的含量）/5×100%

表1 免疫磁珠的性能检测结果

根据表1的检测结果可知，制备例1-6提供的免疫磁珠对黄曲霉毒素的最大载量与免疫磁珠偶联率明显高于对比制备例1-2。即本申请在免疫磁珠的制备过程中，将偶联步骤中偶联缓冲溶液的pH控制在6.8-8.2之间，所得的免疫磁珠每100uL对黄曲霉毒素的最大载量高达460-560ng，免疫磁珠与抗体的偶联率＞80%。且进一步地，制备例2-3获得的免疫磁珠每100uL对黄曲霉毒素的最大载量为＞500ng，免疫磁珠与抗体的偶联率＞90.0%，说明本申请将偶联缓冲溶液的pH控制在6.8-7.5之间，获得的免疫磁珠对黄曲霉毒素的最大载量更高、免疫磁珠与黄曲霉毒素抗体的偶联率更高。

实施例1

实施例1提供一种利用净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法，具体包括以下步骤：

（1）中药材前处理：称取中药材试样5.0g于50mL离心管中，然后向中药材试样中加入20.0mL的70%甲醇水溶液，并采用高速涡旋提取仪提取15min，定性滤纸过滤，获得样品滤液。

（2）提取磁吸：

（2.1）量取10mL 0.1%吐温-20的PBS于15mL离心管中，然后吸取500μL制备例2提供的免疫磁珠，并加入至离心管中，获得免疫磁珠溶液。

（2.2）量取2.0mL步骤（1）获得的样品滤液加入至上述离心管中，在25℃下采用end-over-end的方式充分混匀，时间为5min；然后将离心管置于磁力架上，磁吸1min，使得离心管中的免疫磁珠吸到离心管侧壁，吸出并丢弃离心管中的液体；

（2.3）量取2.0mL、pH7.0的含有0.1%吐温-20的PBS溶液加入至上述离心管中，在25℃下采用end-over-end的方式充分混匀，时间为1min；然后将离心管置于磁力架上，磁吸1min，使得离心管中的免疫磁珠吸到离心管侧壁，吸出并丢弃离心管中的液体；

（2.4）量取1.0mL的色谱级甲醇注入至上述离心管中，涡旋混匀3min；然后将离心管置于磁力架上，磁吸1min，使得离心管中的免疫磁珠吸到离心管侧壁；吸出离心管中的液体，即为黄曲霉毒素。

实施例2-5

按照实施例1的方法进行实施例2-5，不同之处在于：步骤（2.1）中采用的免疫磁珠来源于制备例3-6。

实施例6-10

按照实施例1的方法进行实施例6-10，不同之处在于：步骤（1）中药材前处理中采用的提取试剂，具体如表2所示。

表2 实施例1、实施例6-10的药材前处理中采用的提取试剂

对比例1-2

按照实施例1的方法进行对比例1-2，不同之处在于：步骤（2.1）中采用的免疫磁珠分别来源于对比制备例1-2。

对比例3

按照实施例1的方法进行对比例3，不同之处在于：步骤（1）中药材前处理中，将70%甲醇水溶液替换为PBS缓冲液。

对比例4

按照实施例1的方法进行对比例4，不同之处在于：步骤（1）中药材前处理中，将70%甲醇水溶液替换为乙腈。

性能检测试验

对实施例1-10、对比例1-4方法的提取效率进行检测，具体如下：

1. 配制中药材试样：取决明子并研磨成分，然后向其中加入黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2，获得决明子试样；决明子试样中黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素G1的浓度10ug/kg，黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素G2的浓度为3ug/kg。

2. 按照实施例1-10、对比例1-4提供的方法提取决明子试样中的黄曲霉毒素，然后利用HPLC检测黄曲霉毒素浓度，从而计算黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2的回收率；回收率越高，表明该方法的提取效率越高。回收率的检测结果如表3所示。

回收率的计算公式为：

回收率=检测的黄曲霉毒素浓度/黄曲霉毒素的添加浓度×100%

表3 利用各方法提取决明子中的黄曲霉毒素的回收率检测结果

根据表3的检测结果可知，利用实施例1-10提供的方法获得的黄曲霉毒素B1的回收率为63.8-91.2%、黄曲霉毒素B2的回收率为62.1-93.5%、黄曲霉毒素G1的回收率为66.3-90.4%、黄曲霉毒素G2的回收率为60.2-89.6%；而利用对比例2提供的方法获得的黄曲霉毒素B1的回收率为62.1%、黄曲霉毒素B2的回收率为56.6%、黄曲霉毒素G1的回收率为61.1%、黄曲霉毒素G2的回收率为48.9%。说明本申请提供的利用净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法能够有效提取中药材中的黄曲霉毒素，提取效率高。

根据实施例1-5、对比例1的检测结果可知，实施例1-2、实施例4-5获得的各黄曲霉毒素的回收率均高于实施例3与对比例1，说明本申请采用pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液或pH为8的硼砂缓冲液进行偶联，采用pH为7-7.5的PBS溶液进行封闭，获得的免疫磁珠对黄曲霉毒素的富集效果更好，说明上述方法对中药材中的黄曲霉毒素提取效率更高。

根据实施例1、实施例6-10、对比例3-4的检测出结果可知，利用实施例1、实施例6-10提取获得的黄曲霉毒素B1的回收率为63.8-91.2%、黄曲霉毒素B2的回收率为62.1-93.5%、黄曲霉毒素G1的回收率为66.3-90.4%、黄曲霉毒素G2的回收率为60.2-89.6%，而对比例3获得的黄曲霉毒素B1的回收率为10.3%、黄曲霉毒素B2的回收率为9.85%、黄曲霉毒素G1的回收率为12.6%、黄曲霉毒素G2的回收率为10.7%；对比例4获得的黄曲霉毒素B1的回收率为50.2%、黄曲霉毒素B2的回收率为51.6%、黄曲霉毒素G1的回收率为48.4%、黄曲霉毒素G2的回收率为49.4%；进一步对比发现，实施例8-10采用乙腈水溶液获得的黄曲霉毒素的回收率更高，所得黄曲霉毒素B1的回收率高达80.2-91.2%、黄曲霉毒素B2的回收率高达82.4-93.5%、黄曲霉毒素G1的回收率高达81.5-90.4%、黄曲霉毒素G2的回收率高达79.6-89.6%。

综上所述，本申请提供的利用净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法能够最大程度地将中药材中的黄曲霉毒素提取出来，并且提取效率高达85%以上。

液相色谱检测

对实施例10提取的黄曲霉毒素进行HPLC检测，HPLC检测条件为： Cloversil-C18色谱柱，规格为4.6×250mm，5um；进样体积：10μL；流动相为甲醇-水（体积比45：55）；流动相流速流速0.8mL/min；采用荧光检测器，激发波长为360nm、发射波长440nm；

HPLC检测谱图如图2所示，检测谱图中由左至右峰依次为：溶剂峰、黄曲霉毒素G2（保留时间为9.481min）、黄曲霉毒素G1（保留时间为10.842min）、黄曲霉毒素B2（保留时间为12.496min）、黄曲霉毒素B1（保留时间为14.720min）。由检测谱图可知，谱图中除了目标物质峰，并未出现杂峰，说明本申请提供的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒仅能够净化、提取出中药材中的黄曲霉毒素，不会携带提取其他物质，因此就有特异性强、提取效率高、操作简单便捷等优点，具有很好的使用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠试剂盒包括：溴化氰活化的免疫磁珠、黄曲霉毒素单克隆抗体、偶联缓冲溶液和封闭试剂。

2.根据权利要求1所述的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，所述溴化氰活化的免疫磁珠是溴化氰活化的磁性微球，所述磁性微球表面包覆有琼脂糖高分子层。

3.根据权利要求2所述的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，所述磁性微球的粒径为20-60μm。

4.根据权利要求2所述的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，所述偶联缓冲溶液选自柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液、碳酸盐缓冲液和硼砂缓冲液；所述封闭试剂选自为Tris-HCl、牛血清蛋白、酪蛋白、乙胺和乙醇胺。

5.根据权利要求2所述的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，所述黄曲霉毒素单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌获得。

6.如权利要求1-5中任一项所述的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：偶联、封闭；

偶联：将盐酸溶液加入到所述溴化氰活化的免疫磁珠中，离心去上清，并加入pH为6.8-8.2的偶联缓冲溶液进行复溶，获得溶胀的磁珠微球；然后将所述黄曲霉毒素单克隆抗体加入到所述溶胀的磁珠微球中，充分混匀，离心，弃上清液，获得磁珠微球基质。

7.根据权利要求6所述的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒的使用方法，其特征在于，所述封闭步骤为：将磁珠微球基质转移至封闭试剂中，静置然后离心，弃上清液，最后用pH为6.5-7.5的PBS溶液复溶，获得免疫磁珠。

8.一种权利要求1-5中任一项所述的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒在谷物、坚果、中药材、饲料检测中的应用。

9.一种利用权利要求1-5中任一项所述的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：中药材前处理、提取磁吸；

中药材前处理：向中药材试样中加入提取试剂，并采用高速涡旋的方法进行提取，过滤，获得样品滤液；所述提取试剂为甲醇水溶液或乙腈水溶液。

10.根据权利要求9所述的净化黄曲霉毒素的免疫磁珠试剂盒提取中药材中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述提取磁吸步骤为：首先配制免疫磁珠溶液；然后向其中加入样品滤液，磁吸、弃上清液；再加入含有吐温-20的PBS溶液，磁吸、弃上清液；最后加入甲醇，涡旋混匀、磁吸、收集洗脱液，即获得黄曲霉毒素。

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