CN103160471A - 赭曲霉毒素a杂交瘤细胞株和抗体与复合免疫吸附剂和免疫亲和柱与试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株CGMCC NO.5505和由该细胞株分泌得到的单克隆抗体及其应用。本发明还提供一种免疫吸附剂，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体为上述单克隆抗体和由杂交瘤细胞株CGMCC NO.5506分泌得到的单克隆抗体。以及装载该免疫吸附剂的免疫亲和柱。本发明还提供含有上述免疫吸附剂或免疫亲和柱的试剂盒。以及上述免疫吸附剂、免疫亲和柱、试剂盒在检测黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A中的应用。并具体提供了分离方法和检测方法。本发明通过开发出性能稳定、特异的单克隆抗体，实现了对6种黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的同时纯化和检测。

Description

赭曲霉毒素A杂交瘤细胞株和抗体与复合免疫吸附剂和免疫亲和柱与试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种杂交瘤细胞株、由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体及其应用，由该抗体制得的免疫吸附剂，以及装有该免疫吸附剂的免疫亲和柱和试剂盒，及其它们在纯化黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A中的应用。

背景技术

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等产生的一组结构类似的次生代谢产物，是一组以二吠喃香豆素为基本结构的化合物。目前已分离鉴定出12种，尤其是黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂、M₁和M₂为强污染物质，广泛存在于粮食谷物和饲料及其加工品中，在目前已知的两百多种真菌毒素中毒性最强、污染频率最高。黄曲霉毒素具有诱导突变、抑制免疫和致癌的作用。黄曲霉毒素作用的靶器官主要是肝脏，被公认为致肝癌物质，即使食用含有低水平的黄曲霉毒素食物，长期食用的人其肝脏也将受到损害。国际癌症中心将其定为一类致癌剂。

杂色曲霉素是由杂色曲霉、构巢曲霉等产生的一种具有致癌性的真菌毒素，在化学结构上属于黄曲霉毒素前体物质，可与DNA形成加合物。杂色曲霉素产生菌及杂色曲霉素在世界各地粮食及饲料中的污染很常见。国内学者研究发现，我国各地粮食中杂色曲霉素的污染非常普遍，其中以小麦最明显，污染率最高可达100％。杂色曲霉素可能与胃癌、肝痛的发生密切相关。

赭曲霉毒素是由赭曲霉和纯绿青霉产生的一种霉菌肾毒素，可分为A和B两种类型，赭曲霉毒素A的毒性较大。赭曲霉毒素在4℃的低温下赭曲霉即可产生具有毒害作用浓度的赭曲霉毒素。动物摄入1ppm体重剂量的赭曲霉毒素A可在5-6天致死。常见的病变是肾小管上皮损伤和肠道淋巴腺体坏死。饲喂含1ppm浓度赭曲霉毒素的日粮3个月可引起动物烦渴、尿频、生长迟缓和饲料利用率降低；饲喂含量低至200ppb的日粮数周可检测到肾损伤。其他的临床症状还有腹泻、厌食和脱水。有时临床症状不明显，而在赭曲霉毒素中毒呈地方流行病的地区，动物在屠宰时惟一可观察到的病变是肾苍白、坚硬。

目前，黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的检测方法主要有薄层层析法，酶联免疫法(ELISA)，免疫亲和层析-液相色谱法，免疫亲和层析-荧光光度法等。其中，薄层层析法要接触大量的标准品，不利于实验者的健康，而且灵敏度很低。酶联免疫法，只适用于定性检测，很容易出现假阳性和假阴性的现象。而免疫亲和层析-液相色谱法可以定量地检测许多商品中的黄曲霉毒素的含量。由于该方法灵敏特异，而且不使用有毒的溶剂如氯仿和二氯甲烷等，应用越来越广泛。

免疫亲和层析方法的关键在于选择一种高效特异的抗体，但是，利用现有技术中的液液提取、固相萃取、加热蒸发浓缩等方法的添加回收率均较低，对后续的检测步骤造成很强的基质效应，并且现有技术中没有能够同时纯化待处理基质中6种黄曲霉毒素(B₁、B₂、G₁、G₂、M₁和M₂)、杂色曲霉素和和赭曲霉毒素A的免疫吸附介质，而能够同时纯化分析多种病毒素显然能够提高检测的效率。

因此，当务之急，是要制备出性能稳定、特异的免疫吸附剂，并建立一种经济、快捷、精确、安全，并且能同时纯化6种黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞株、由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，由该抗体制得的免疫吸附剂及其在纯化和检测赭曲霉毒素A中的应用，以及装有该免疫吸附剂的免疫亲和柱(IAC)和试剂盒，及其它们在纯化以及检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A中的应用，以及具体提供一种纯化黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法和一种检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法。

本发明的第一方面是提供一种杂交瘤细胞株CGMCC NO.5505。该杂交瘤细胞株已于2011年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

本发明的第二方面是提供由上述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体，其中，该单克隆抗体为抗赭曲霉毒素A的抗体。

本发明的第三方面是提供上述单克隆抗体在纯化和检测赭曲霉毒素A中的应用。

本发明的第四方面是提供一种免疫吸附剂，其特征在于，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体为上述单克隆抗体和由杂交瘤细胞株CGMCC NO.5506分泌得到的单克隆抗体。

本发明的第五方面是提供一种装载有上述免疫吸附剂的免疫亲和柱。

本发明的第六方面是提供一种含有上述免疫吸附剂或上述免疫亲和柱的试剂盒；优选地，所述试剂盒中还包括洗脱液和/或保存液，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，所述保存液优选为含有0.001-0.1重量％的NaN₃的PBS缓冲液。

本发明的第七方面是提供上述免疫吸附剂、上述免疫亲和柱、或上述试剂盒在纯化以及检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A中至少一种中的应用。

本发明的第八方面是提供一种纯化黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，该方法包括，使含有黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的液体样品通过上述免疫亲和柱，使得所述液体样品中的至少部分黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A吸附至该免疫亲和柱上，然后用洗脱液将所述至少部分黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脱下来，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。

本发明的第九方面是提供一种检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，该方法包括，(1)根据上述纯化黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，得到待测液，所述待测液为用洗脱液将所述至少部分黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脱下来而得到的溶液；(2)使所述待测液进入检测系统，并通过与标准品比较进行定性或定量检测。

本发明通过开发出性能稳定、特异的单克隆抗体，实现了对6种黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的同时纯化和检测。由实施例的结果可以看出，对牛奶样品和饲料样品的检测中，添加回收率都在70-110％之间，RSD均小于6％。表明本发明的方法完全满足对黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A纯化和检测的分析要求。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁和M₂标准品的液相色谱图；

图2为杂色曲霉素标准品的液相色谱图；

图3为赭曲霉毒素A标准品的液相色谱图。

具体实施方式

本发明提供一种杂交瘤细胞株OTA-E11B8CGMCC NO.5505。该杂交瘤细胞株已于2011年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为抗赭曲霉毒素A单克隆抗体细胞株。

本发明还提供由上述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体，其中，该单克隆抗体为抗赭曲霉毒素A的抗体。

本发明的上述单克隆抗体可应用于纯化和检测赭曲霉毒素A。

本发明中上述杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备方法可以为本领域常规的制备方法。

即，首先将赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白偶联，制备作为免疫原，然后将该免疫原对小鼠进行免疫，通过将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合和杂交瘤细胞克隆化筛选得到所需的杂交瘤细胞株以及由其分泌的单克隆抗体。其中，所述载体蛋白可以为牛血清蛋白或卵清蛋白。

所述免疫原与载体蛋白的相对用量可以为本领域常规选择，例如，所述免疫原与载体蛋白的摩尔比为5-8∶1。

具体地，本发明中的杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备方法可以包括以下步骤：

(1)制备赭曲霉毒素A免疫原

将2mg赭曲霉毒素A(OTA)加入到500μL丙酮中，加入4mg CDI，得到第一溶液。将8mg BSA加入到3mL 0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液中，得到BSA溶液。把第一溶液慢慢滴加到BSA溶液中，室温反应2天，反应后溶液在4℃条件下，用PBS溶液透析3天。

(2)制备杂交瘤细胞和抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体

动物免疫：免疫动物为6-8周龄左右的雌性BALB/c小鼠。用赭曲霉毒素A免疫原免疫5只小鼠。取适量赭曲霉毒素A免疫原(100μg/只)加等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂进行免疫，之后佐剂改为不完全佐剂，共免疫6次，每次间隔2周。除第一次为颈背部皮下多点注射外，其余均为腹腔注射。免疫结束后处死小鼠，取脾细胞。

细胞融合：将脾细胞和杂交瘤细胞按照10∶1的比例进行细胞融合试验。

杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到对赭曲霉毒素A有很好的特异性反应的细胞。最后筛选出分泌赭曲霉毒素A抗体的杂交瘤细胞CGMCC NO.5505，制备出单克隆抗体。

本发明提供一种免疫吸附剂，其特征在于，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体为上述单克隆抗体(抗体A)和由杂交瘤细胞株Afla-D12A1CGMCC NO.5506(该杂交瘤细胞株已于2011年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为抗杂色曲霉素黄曲霉毒素单克隆抗体细胞株)分泌得到的单克隆抗体(抗体B)。其中，抗体B为抗黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂，和杂色曲霉素中至少一种的抗体。

本发明中的杂交瘤细胞株CGMCC NO.5506和抗体B的制备方法可以为本领域常规的制备方法。即，首先将黄曲霉毒素半抗原与载体蛋白偶联，制备作为免疫原，然后将该免疫原对小鼠进行免疫，通过将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合和杂交瘤细胞克隆化筛选得到所需的杂交瘤细胞株以及由其分泌的单克隆抗体。其中，所述载体蛋白可以为牛血清蛋白或卵清蛋白。

所述免疫原与载体蛋白的相对用量可以为本领域常规选择，例如，所述免疫原与载体蛋白的摩尔比为5-8∶1。

具体地，本发明中的杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备方法可以包括以下步骤：

(1)制备黄曲霉毒素免疫原

将4mg黄曲霉毒素B₁溶于2mL丙酮中，加入40μL 10％的H₂SO₄，在56℃搅拌反应4h，将反应所得产物蒸干后，加入5mL H₂O，用25mL氯仿提取两次，然后用20mL H₂O洗涤有机层，保留有机层，蒸去有机溶剂，得到黄色固体产物。

取1.0mg黄色固体产物，向其中加入2mL 0.5％的BSA溶液(4mL PBS中溶解20mg BSA)，在37℃下反应30min；加入100μL 6.5mM的NaHB₄，在4℃反应30min；加入50μL 0.1N的HCl，除去过量的NaHB₄。在4℃条件下，用PBS溶液透析3天，制得免疫原，即黄曲霉毒素B₁-BSA(AflatoxinB₁-BSA)。

本发明中，所述固相载体可以为本领域常规的各种适用于与抗体进行偶联的固相载体，包括但不限于纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶中的至少一种，优选为溴化氰(CNBr)活化的琼脂糖凝胶；所述琼脂糖凝胶的浓度可以为常规的各种选择，如4％。该CNBr活化的琼脂糖凝胶可以以干粉形式商购获得，如购自美国GE公司，使用时，加入酸溶液进行溶胀即可，该酸处理方法已为本领域技术人员公知，在此不再赘述。当使用冻干形式并含有添加剂的CNBr活化的琼脂糖凝胶时，优选在低pH值(如pH值为2-3)的条件下洗去添加剂，然后再与抗体进行偶联。

所述将抗体A和抗体B与固相载体偶联的方法可以为本领域常规的方法，具体地，该方法可包括：

(1)用偶联缓冲液溶解抗体，所述抗体为抗体A和抗体B，得到第一抗体溶液，

(2)使所述第一抗体溶液与活化的固相载体接触进行偶联，得到偶联液，

(3)将偶联液中偶联后的固相载体转移至浓度为0.05-1M的Tris-HCl缓冲液中静置，以封闭偶联液中偶联后的固相载体上的残留活性位点，

(4)用洗涤液洗涤静置后的固相载体，以去除未偶联的抗体，得到洗涤后的固相载体，

(5)用含有0.001-0.1重量％的NaN₃的PBS缓冲液清洗洗涤后的固相载体。

本发明对所述抗体和固相载体的用量比例以及抗体A和抗体B的相对用量没有特别的限定，一般地，使所述抗体与固相载体尽可能饱和偶联，因此，所述抗体一般过量于固相载体。但是，本领域技术人员也可以根据需要选择抗体与固相载体的用量比。本发明中，所述抗体A、抗体B与固相载体的重量比优选为1∶0.2-5∶5-10。

本发明中所述偶联缓冲液可以为本领域常规的各种选择，如0.1-0.3M的NaHCO₃溶液，pH值可以为8-8.5。

偶联条件和偶联方法可以为常规的选择，如，可以在4-25℃条件下，采用翻转式(end-over-end)的方法将抗体与固相载体充分均匀混合1-24小时。

所述封闭和除去未偶联的抗体的方法也可以为本领域的常规方法。其中，所述在0.05-1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中静置的条件可以为，在4-25℃下，静置2-4小时。所述用洗涤液洗涤静置后的固相载体中的洗涤液可以为低、高两种pH值的缓冲液(如pH4.0的醋酸盐缓冲液和pH8.0的Tris-HCl缓冲液)，所述洗涤的条件只要使得未偶联的抗体基本被除去即可，一般地，按照依次用低、高pH的缓冲液洗涤的顺序至少洗涤3个循环。

可以通过测量未偶联的抗体的量来计算两种抗体总的偶联率，偶联率计算公式为：

所述测量未偶联的抗体的量的方法可以为本领域常规的方法，如，通过紫外测定偶联后的上清液中的蛋白浓度。

本发明提供装载有上述免疫吸附剂的免疫亲和柱。将免疫吸附剂制备成免疫亲和柱的方法为本领域技术人员公知。例如，将上述清洗后的固相载体装柱。所述含有0.001-0.1重量％的NaN₃的PBS缓冲液(PBS缓冲液的组成为1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g、12水合磷酸氢二钠2.86g、氯化钾0.2g、氯化钠8.8g)可以作为该免疫亲和柱的保存液。

装柱的方法例如可以为：使用保存液制备浆液，以75％琼脂糖凝胶和25％保存液的比例进行混合。以连续性的操作向柱内倾入浆液。使用一个斜靠在柱内壁上的玻璃棒进行填柱操作，将有助于减少气泡的产生。填柱后，关闭亲和柱下端的开口，并取下亲和柱的顶端部件。仔细操作，加入保存液以充填亲和柱的余下部分，以在亲和柱的顶端形成一个向上的弯液面。将顶端筛板以一定的角度插入到亲和柱中，确保在筛板的下方没有空气。将筛板锁定在基质表面适当的位置上，打开亲和柱下方的开口，用5倍柱床体积的无菌过滤的保存液过柱，并使用保存液保存，至此，亲和柱已装填并平衡完毕，可供直接使用。

可以根据本领域的常规方法(如CN101059512A中公开的方法)计算免疫亲和柱的动态柱容量(每毫升免疫吸附剂或柱床体积对待测物的最大吸收值)和绝对柱容量(每毫升固定抗体对待测物的最大结合容量)。结果表明所述本发明的免疫亲和柱对黄曲霉毒素和杂色曲霉素的动态柱容量和绝对柱容量分别为300ng/mL和880ng/mg，该免疫亲和柱对赭曲霉毒素A的动态柱容量和绝对柱容量分别为120ng/mL和560ng/mg。使用了5-10次以后柱容量为总柱容量的60-90％左右，保存期为1.5年。

本发明提供含有上述免疫吸附剂或含有上述免疫亲和柱的试剂盒；优选地，所述试剂盒中还包括洗脱液和/或保存液，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，最优选为色谱级甲醇。所述保存液优选为含有0.001-0.1重量％的NaN₃的PBS缓冲液。

此外，该试剂盒中还可包括盒体、黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的标准品、洗涤液、海绵托架中的至少一种。其中，所述洗涤液可以为磷酸盐缓冲液(即1L水中含有0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、2.9g十二水合磷酸氢二钠和8.8g氯化钠的溶液)或水；所述海绵托架上设有孔和凹槽，所述凹槽中装有上述标准品溶液、装有上述各种溶液的试剂瓶，以及装有上述免疫吸附剂的IAC柱。

本发明提供上述免疫吸附剂、上述免疫亲和柱、或上述试剂盒在纯化以及检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A中至少一种中的应用。

具体地，本发明提供一种纯化黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，该方法包括，使含有黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的液体样品通过上述免疫亲和柱，使得所述液体样品中的至少部分黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A吸附至该免疫亲和柱上，然后用洗脱液将所述至少部分黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脱下来，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，最优选为色谱纯甲醇。

该方法还可以包括在洗脱液洗脱之前，用洗涤液对免疫亲和柱进行洗涤，以除去免疫亲和柱上非特异性吸附的残余的液体样品。所述洗涤液可以为水、磷酸盐缓冲液和10％甲醇中的至少一种。

根据本发明，所述含有黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的液体样品可以为任何含有上述物质的液体样品，优选为食品的液体提取物、饲料的液体提取物、生物样品的液体提取物和中药的液体提取物中的至少一种。

所述食品包括但不限于谷类、调料、奶制品等，所述谷类包括但不限于花生、玉米、大豆和大米等，所述生物样品包括但不限于血浆、肝、肾、肺和肌肉等。

将所述食品、饲料、生物制品和中药制成液体提取物的方法可以为本领域常规的方法，例如，可包括以下步骤：称取一定量的样品，用50-80％的甲醇水溶液提取后，用定性滤纸过滤，将滤液用纯水稀释，再用玻璃纤维滤纸过滤。

本发明还提供一种检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，该方法包括，

(1)根据上述纯化黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，得到待测液，所述待测液为用洗脱液将所述至少部分黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脱下来而得到的溶液；

(2)使所述待测液进入检测系统，并通过与标准品比较进行定性或定量检测。

本发明对于检测的具体方式没有特别的限定，可以是先收集得到待测液，然后再手动使待测液进行检测系统，也可以为连用系统，使待测液自动进入检测系统进行检测。

所述检测系统可以为本领域常规的各种用于分析检测的仪器，优选使用液相色谱。

所述分析检测的条件可以根据待检测的物质的不同进行调整，调整的方法为本领域技术人员公知。例如，对于黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A，色谱条件可以为：

①对于黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂，流动相：甲醇-水(甲醇/水的体积为45∶55)；检测器：荧光检测器，激发波长为360nm，发射波长为440nm；色谱柱：C-18柱(柱长为150mm，内径为4.6mm，填料直径为5μm)；流速：0.8mL/min。

②对于杂色曲霉素，流动相：甲醇-水(甲醇/水的体积为75∶25)；检测器：紫外检测器波长：325nm；色谱柱：C-18柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料直径为5μm)；流速：0.8mL/min。

③对于赭曲霉毒素A，流动相：乙腈∶水∶乙酸(三者体积比为49.5∶49.5∶1)；检测器：荧光检测器，激发波长为333nm，发射波长为477nm；色谱柱：C-18柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料直径为5μm)；流速：0.8mL/min。

所述“与标准品比较”的方法可以为本领域的常规方法，例如，首先通过液相色谱对准确配置成一定浓度的标准品进行检测，确定该标准品的特征峰位置以及峰面积(或峰高)与浓度之间的关系。然后，在同样条件下对待测液进行检测，通过与标准品出峰位置的比较，确认待测液中是否存在与标准品相同的物质，通过与标准品的峰面积(或峰高)的比较，确定待测液中与标准品相同的物质的含量。

通过以下实施例对本发明进行更详细的说明。

实施例1

本实施例用于制备赭曲霉毒素A免疫原和黄曲霉毒素免疫原

(1)2mg赭曲霉毒素A(OTA)加入到500μL丙酮中，加入4mg CDI，得到第一溶液。将8mg BSA加入到3mL 0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液中，得到BSA溶液。把第一溶液慢慢滴加到BSA溶液中，室温反应2天，反应后溶液在4℃条件下，用PBS溶液透析3天。得到赭曲霉毒素A免疫原，即OTA-BSA。

(2)将4mg黄曲霉毒素B₁溶于2mL丙酮中，加入40μL 10％的H₂SO₄，在56℃搅拌反应4h；将反应所得产物蒸干后，加入5mL H₂O，用25mL氯仿提取两次，然后用20mL H₂O洗涤有机层，保留有机层；蒸去有机溶剂，得黄色固体产物。

取1.0mg所述黄色固体产物，向其中加入2mL 0.5％的BSA溶液(4mLPBS中溶解有20mg BSA)，在37℃下反应30min；加入100μL 6.5mM的NaHB₄，4℃反应30min；加入50μL 0.1N的HCl，除去过量的NaHB₄。在4℃条件下，用PBS溶液透析3天。得到黄曲霉毒素免疫原，即黄曲霉毒素B₁-BSA。

实施例2

本实施例用于制备抗黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂和杂色曲霉毒素的单克隆抗体(抗体A)以及抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体(抗体B)

(1)动物免疫：免疫动物为6-8周龄左右的雌性BALB/c小鼠，用赭曲霉毒素A免疫原免疫5只小鼠。取赭曲霉毒素A免疫原(100μg/只)加等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂进行免疫，之后佐剂改为不完全佐剂，共免疫6次，每次间隔2周。除第一次为颈背部皮下多点注射外，其余均为腹腔注射。免疫结束后处死小鼠，取脾细胞。

细胞融合：将脾细胞和杂交瘤细胞按照10∶1的比例进行细胞融合试验。

杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到对赭曲霉毒素A有很好的特异性反应的细胞。最后筛选出分泌赭曲霉毒素A抗体的杂交瘤细胞CGMCC NO.5505，制备出单克隆抗体A。

(2)动物免疫：免疫动物为6-8周龄左右，雌性BALB/c小鼠。用黄曲霉毒素B₁-BSA免疫3只小鼠。取曲霉毒素B₁-BSA(100μg/只)加等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂进行免疫，之后佐剂改为不完全佐剂，共免疫6次，每次间隔2周。除第一次为颈背部皮下多点注射外，其余均为腹腔注射。免疫结束后处死小鼠，取脾细胞。

细胞融合：将脾细胞和杂交瘤细胞按照10∶1的比例进行细胞融合试验。

杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到对黄曲霉毒素和杂色曲霉毒素都有很好的特异性反应的细胞。最后筛选出分泌黄曲霉毒素和杂色曲霉毒素抗体的杂交瘤细胞CGMCC NO.5506，制备出单克隆抗体B。

实施例3

本实施例用于制备免疫亲和柱

1、琼脂糖凝胶的制备

称取所需的1g用CNBr活化的琼脂糖凝胶粉末(商购自美国GE公司，每克冻干粉末可形成3.5ml终体积的溶胀琼脂糖凝胶)，溶于1mM HCl中。将立即溶胀的琼脂糖凝胶置于烧结玻璃过滤器中，用1mM HCl洗涤15min。

2、抗体偶联

(a)使用偶联缓冲液(0.2M NaHCO₃，pH8.3)溶解抗体，抗体为抗体A和抗体B，其中，抗体A和抗体B的浓度均为5.1mg/ml，抗体溶液体积为30ml，将抗体溶液置于冰浴中暂存。在一个带盖的可完全密封的容器中加入上述含有抗体的偶联缓冲液，并迅速向其中加入步骤1洗涤好的琼脂糖凝胶。室温条件(20-25℃)下采用end-over-end的方式充分混匀上述的混和物2-4h，

(b)计算偶联率：在2,000rpm下离心步骤(a)得到的混合物，离心1min，将琼脂糖凝胶离心至管底，将上清液转移至新的离心管中，测定上清液的蛋白质含量。

通过公式I计算出抗体A和抗体B的总偶联率为99.8％，说明偶联很成功。取离心至管底的琼脂糖凝胶，使用偶联缓冲液进行洗涤，除去多余的抗体。

(c)封闭：转移固相载体至0.1M Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h，以封闭未偶联的活性位点。

(d)除去未偶联上的多余的抗体，依次用低、高两种pH的缓冲液对琼脂糖凝胶进行洗涤，至少洗涤3个循环，每种缓冲液的使用量至少为琼脂糖凝胶体积的5倍。

每个洗涤循环步骤：先用0.1M醋酸/醋酸钠缓冲液(pH值为4.0)洗涤，接着再用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH值为8.0)进行洗涤。

(e)用5倍琼脂糖凝胶体积的含有0.01重量％NaN₃的PBS洗涤，并使用含有0.01重量％NaN₃的PBS溶液(保存液)保存。

3、装柱

使用保存液制备浆液，以75％琼脂糖凝胶和25％保存液的比例进行混合。以连续性的操作向柱内倾入浆液。使用一个斜靠在柱内壁上的玻璃棒进行填柱操作，将有助于减少气泡的产生。填柱后，关闭亲和柱下端的开口，并取下亲和柱的顶端部件。仔细操作，加入保存液充填亲和柱的余下部分，以在亲和柱的顶端形成一个向上的弯液面。将顶端筛板以一定的角度插入到亲和柱中，确保在筛板的下方没有空气。将筛板锁定在基质表面适当的位置上，打开亲和柱下方的开口，用5倍柱床体积的无菌过滤的保存液过柱，并使用保存液保存，至此，亲和柱已装填并平衡完毕，可供直接使用。

实施例4

本实施例用于检测饲料样品中的黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂和杂色曲霉素以及赭曲霉毒素A；检测牛奶样品中的黄曲霉毒素M₁和M₂。

1、利用添加回收实验检测饲料样品中的黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂和杂色曲霉素以及赭曲霉毒素A。

(1)向饲料样品中分别添加终浓度为10μg/kg，20μg/kg，50μg/kg三个浓度梯度的黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂，添加终浓度为10μg/kg，20μg/kg，50μg/kg三个浓度梯度的赭曲霉毒素A和添加终浓度为10μg/kg，20μg/kg，50μg/kg三个浓度梯度的杂色曲霉素。每个实验做五组平行试验。

(2)饲料中黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的提取和检测：

准确称取经过磨细(粒度小于2mm)的饲料50.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及准确加入100.0mL甲醇-水(甲醇/水体积比为8∶2)，以均质器高速搅拌提取2min，或摇床震荡30min。定量滤纸过滤，准确移取10.0mL滤液并加入40.0mL pH7.0的PBS溶液稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清。

将实施例3制得的免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL样品提取液注入该玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使样品提取液以约6mL/min的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体。以10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2～3mL空气通过柱体。加入2.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1-2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

2、利用添加回收实验检测牛奶样品中的黄曲霉毒素M₁和M₂

(1)向牛奶中分别添加终浓度为0.1μg/L，0.5μg/L，1.0μg/L三个浓度梯度的黄曲霉毒素M₁和M₂。每个实验做五组平行试验。

(2)提取牛奶中的黄曲霉毒素M₁和M₂

准确量取50ml牛奶，在4000转/分以上的转速下离心15分钟。去掉奶皮，取得脱脂奶，备测。将实施例3制得的免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。移取50.0mL脱脂奶注入该玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使脱脂奶以约6mL/min的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体。以10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2～3mL空气通过柱体。加入2.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1-2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

3、高效液相色谱条件

黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂、M₁、M₂：

(a)流动相：甲醇-水(甲醇/水体积比为45∶55)；

(b)检测器：荧光检测器，激发波长为360nm，发射波长为440nm；

(c)色谱柱：C-18柱(柱长为150mm，内径为4.6mm，填料直径为5μm)；

(d)流速：0.8mL/min；

(e)光化学衍生化系统：光化学衍生池(连接于色谱柱后，然后通向荧光检测器)。

杂色曲霉素：

(a)流动相：甲醇-水(甲醇/水体积比为75∶25)；

(b)检测器：紫外检测器，波长为325nm；

(c)色谱柱：C-18柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料直径为5μm)；

(d)流速：0.8mL/min。

赭曲霉毒素A：

(a)流动相：乙腈∶水∶乙酸(三者体积比为49.5∶49.5∶1)；

(b)检测器：荧光检测器，激发波长为333nm，发射波长为477nm；

(c)色谱柱：C-18柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料直径为5μm)；

(d)流速：0.8mL/min。

4、定量

用进样器吸取50μL标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值(峰高或峰面积)，得到黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂，M₁，M₂和杂色曲霉素以及赭曲霉毒素A标准溶液的高效液相色谱图。其中，黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂，M₁，M₂的谱图见图1(其中，Afla表示黄曲霉毒素)，杂色曲霉素的谱图见图2，赭曲霉毒素A的谱图见图3。

根据与标准品的谱图进行比较，对牛奶样品和饲料样品中的黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂，M₁，M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A进行定量，测出经过免疫亲和柱吸附和洗脱下的黄曲霉毒素和杂色曲霉素的含量，并根据公式II计算添加回收率。

检测结果如表1、表2和表3所示。其中，表1中示出的是饲料中黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂的添加回收率；表2中示出的是饲料种杂色曲霉素的添加回收率；表3中示出的是饲料中赭曲霉毒素A的添加回收率；表4中示出的是牛奶中黄曲霉毒素M₁和M₂的添加回收率。

表1

表2

表3

表4

由检测结果可以看出，饲料样品的黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的添加回收率都在82-97％之间，RSD均小于6％。表明本发明的方法完全满足黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A检测的分析要求。

牛奶样品的添加回收率都在70-105％之间，RSD均小于6％。表明本发明的方法完全满足黄曲霉毒素M₁和M₂检测的分析要求。

由上述实施例也可以看出，通过上述方法，本发明的由杂交瘤细胞株CGMCC NO.5505分泌得到的单克隆抗体本身也可以单独用于赭曲霉毒素A的检测和纯化。具体地，可以将上述抗体与固相载体制备成免疫吸附剂，进一步制备成免疫亲和柱，并根据上述的方法对赭曲霉毒素A进行检测和纯化。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株CGMCC NO.5505。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体，其中，该单克隆抗体为抗赭曲霉毒素A的抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在纯化和检测赭曲霉毒素A中的应用。

4.一种免疫吸附剂，其特征在于，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体为权利要求2所述的单克隆抗体和由杂交瘤细胞株CGMCC NO.5506分泌得到的单克隆抗体。

5.装载有权利要求4所述的免疫吸附剂的免疫亲和柱。

6.含有权利要求4所述的免疫吸附剂或含有权利要求5所述的免疫亲和柱的试剂盒；优选地，所述试剂盒中还包括洗脱液和/或保存液，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，所述保存液优选为含有0.001-0.1重量％的NaN₃的PBS缓冲液。

7.权利要求4所述的免疫吸附剂、权利要求5所述的免疫亲和柱、或权利要求6所述的试剂盒在纯化以及检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A中至少一种中的应用。

8.一种纯化黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，该方法包括，使含有黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的液体样品通过权利要求5所述的免疫亲和柱，使得所述液体样品中的至少部分黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A吸附至该免疫亲和柱上，然后用洗脱液将所述至少部分黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脱下来，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述含有黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的液体样品优选为食品的液体提取物、饲料的液体提取物、生物样品的液体提取物和中药的液体提取物中的至少一种。

10.一种检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，该方法包括，

(1)根据权利要求8或9所述的方法，得到待测液，所述待测液为用洗脱液将所述至少部分黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脱下来而得到的溶液；

(2)使所述待测液进入检测系统，并通过与标准品比较进行定性或定量检测。

Images