CN109535251A - 一种赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体及其制备方法 - Google Patents

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CN109535251A CN201811525627.3A CN201811525627A CN109535251A CN 109535251 A CN109535251 A CN 109535251A CN 201811525627 A CN201811525627 A CN 201811525627A CN 109535251 A CN109535251 A CN 109535251A
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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体及其制备方法，所述赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明采用赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫羊驼，通过提取其白细胞总RNA构建噬菌体展示纳米抗体文库，且库容量高，多样性好；以赭曲霉毒素A单克隆抗体为靶标物，采用三轮亲和富集淘选，逐轮降低包被浓度和竞争洗脱浓度，淘选获得特异性良好的阳性噬菌体赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体；将阳性噬菌体赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体基因转化到表达菌株，经诱导表达、纯化、鉴定，获得性能优良的蛋白形式纳米抗体VHH2‑24。

Description

一种赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体及其制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体及其制备方法。
背景技术
赭曲霉毒素A(ocbratoxinA,OTA)是一种有毒的真菌次级代谢产物，主要由曲霉和青霉产生，主要污染粮食、蔬菜及咖啡、葡萄、可可等经济作物，由于可污染物种很多，且产毒真菌的全球性及其现在农作物产品世界贸易的不断发展，造成了赭曲霉毒素A在全球的广泛传播，而且已经严重危害到动物和人类的健康。它具有较强的肾毒性和肝毒性，并具有致畸形、致癌性、免疫毒性和胚胎毒性，很多国家都设立了限量标准，因此建立成本低且快速有效的现场检测方法极为重要。
目前，用于赭曲霉毒素A检测的方法有薄层层析法、高效液相色谱法、免疫分析法和电化学传感器等。其中，免疫分析法基于抗原抗体特异性结合，具有检测灵敏度高、特异性好、前处理简便、分析快速、成本低廉等优点，适用于食品安全检测中的批量样品的快速筛检。但建立该方法，需使用大量OTA标准物及有机溶剂合成检测抗原，同时还需OTA标准物建立标准曲线，对操作人员的身体健康存在着潜在的危害。另外，实验过程中的废液，还可能造成周边环境的二次污染。
1963年，Oudin等提出独特位的概念，独特位是指抗体V区的抗原表位，包括超变区和骨架区。1974年，Jerne提出“免疫网络学说”(Immune Network Theory)，即免疫系统的各个细胞，相互识别、刺激、制约，形成复杂的动态平衡网络结构。此网络的核心是抗体上的独特型(Idiotype,Id)，独特型具有抗原性，能诱导机体产生抗独特型抗体(anti-idiotypicantibody,Anti-Id或AId)，简称抗-Id。抗-Id可分为α、β、γ和ε四种类型，Ab2β识别Ab抗原结合位点，可与半抗原竞争结合Ab1，模拟原始抗原的三维构象，起到替代抗原分子的作用。
采用多克隆抗体技术制备抗独特型抗体生产技术相对简单，容易操作，费用较低，但血清的后期纯化较为繁琐，且单次产量有限。而采用单抗法，生产周期长，制备过程也比较复杂，所需成本偏高，细胞融合率和阳性率均远低于Ab1类单抗，但此方法一旦成功，所得的杂交瘤细胞株可长期稳定保存，实现一劳永逸地制备大量AId，而且方法简单，抗体质量高，性质均一稳定。噬菌体抗体库技术制备AId简便、快速、经济，所得抗体分子量小、免疫原性低、基因型和表型一致，为制备人源化抗体创造了新的方法，但此法要求抗体库库容量很高、多样性丰富，后期筛选方法也要合适，否则难以获得性能优良的AId。
发明内容
本发明针对现有技术不足，目的在于提供一种赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体，通过如下方法制备得到：以赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫羊驼，通过提取羊驼血清中的淋巴细胞RNA，克隆重链抗体可变区VHH基因，以pComb3X为载体构建噬菌体展示纳米抗体免疫文库，并对文库进行鉴定，测定其滴度和库容量，分析文库的多样性；再以赭曲霉毒素A单克隆抗体为靶标物，对纳米抗体免疫文库进行淘选，获得阳性噬菌体展示的赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种编码上述赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
含上述核苷酸序列的重组表达载体、噬菌体或重组工程菌。
上述赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体的制备方法，通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子；所述基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。
本发明的有益效果如下：1)本发明采用赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫羊驼，通过提取其白细胞总RNA构建噬菌体展示纳米抗体文库，且库容量高，多样性好；2)以赭曲霉毒素A单克隆抗体为靶标物，采用三轮亲和富集淘选，逐轮降低包被浓度和竞争洗脱浓度，淘选获得特异性良好的阳性噬菌体赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体；3)本发明将阳性噬菌体赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体基因转化到表达大肠杆菌，经诱导表达、纯化、鉴定，获得性能优良的蛋白形式纳米抗体，能有效降低抗体生产成本，且所述赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体作为赭曲霉毒素A的替代物在ELISA免疫分析方法中具有极大的应用价值。
附图说明
图1为用于判断噬菌体展示纳米抗体免疫文库多样性的测试结果。
图2为phage-ELISA鉴定阳性克隆。
图3为VHH2-24与抗赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1(简称AFB1)、玉米赤霉烯酮(简称ZEN)、呕吐毒素(简称DON)单克隆抗体的结合情况。
图4为棋盘法优化VHH 2-24包被浓度和赭曲霉毒素A单克隆抗体工作浓度。
图5为封闭试剂对VELISA的影响。
图6为磷酸盐缓冲液pH值对VELISA的影响。
图7为盐离子浓度对VELISA的影响。
图8为甲醇浓度对VELISA的影响。
图9为基于VHH 2-24的VELISA对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的交叉反应情况。
图10为VHH 2-24在不同样品基质中对OTA的竞争曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例中，所述赭曲霉毒素A单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，杂交瘤细胞株1H2已于2013年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且已在专利《杂交瘤细胞株1H2、其产生的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体及其应用》，申请号：201310115921.8中公开。
实施例1噬菌体展示纳米抗体免疫文库的构建
1.羊驼免疫
取抗赭曲霉毒素A单克隆抗体(溶于PBS7.4)200μg，与等体积弗氏不完全佐剂乳化后，对三周岁的雄性羊驼(Alpaca)进行皮下多点注射，此后每隔两周免疫一次，共免疫8次，四免后开始采血检测。在第四次免疫后7～10天，用EDTA真空采血管颈静脉采血10mL，同时轻柔颠倒采血管避免血液凝固，再用LeukoLOCK试剂盒中的滤器处理血液，然后依次用3mLPBS缓冲液和3mL RNAlater缓冲液冲洗滤器，则所需的白细胞就截留在滤器里，最后将滤器密封保存于-80℃，以备提RNA用。
2.总RNA提取
按照Life Technology公司LeukoLOCK totalRNA提取试剂盒的操作手册分离羊驼血液中总RNA，具体操作如下：
(1)向2.5mL裂解/结合液中加入70μLpH调节缓冲液，现配现用；(2)将密封的滤器放置恢复至室温，打开滤帽，用2mL注射器将滤器内残留的RNAlater缓冲液冲去；(3)用2.5mL注射器吸取2.5mL现配裂解/结合缓冲液冲洗滤器一次，流出液用15mLRNAse-free离心管收集；(4)加入不含核酸酶的ddH2O 2.5mL，涡旋混匀，加入25μL蛋白酶K，将离心管于室温250rpm震荡5min；(5)取出保存于4℃的RNA结合磁珠，涡旋混匀后吸取50μL至上述离心管中，涡旋离心管，再向离心管中加入异丙醇2.5mL，室温震荡5min；(6)将上述离心管于3200rpm离心3min，仔细吸出上清弃去，注意不要吸到沉淀的磁珠；(7)加入600μL洗液I，反复吹打沉淀的磁珠使其分散均匀，转移悬液至1.5mL离心管，再用600μL洗液I漂洗15mL离心管一次，并转移至同一1.5mL离心管中；(8)将1.5mL离心管于16000g离心30s，小心弃去上清；(9)加入750μL洗液2/3，剧烈涡旋震荡30s使聚集沉淀的磁珠分散开，于16000g离心30s收集磁珠，小心弃去上清；(10)将离心管敞开盖子在超净台中静置2min，挥发洗液2/3中残留的酒精，期间，现配TURBODNase master混液，取4μLTURBO DNase(20U/μL)加入到296μLLeukoLOCK DNase缓冲液中，混合均匀后转移至上述离心管中，用移液枪反复吹打沉淀的磁珠，使之分散均匀，室温下1000rpm震摇10min，中途轻轻颠倒混合几次；(11)向上述离心管中依次加入裂解/结合液(未加pH调节缓冲液)和异丙醇各300μL，混匀后点动离心2s，然后室温下孵育3min；(12)于16000g离心30s，弃上清，加750μL洗液2/3，剧烈涡旋30s，16000g离心30s，弃上清，再次加入750μL洗液2/3，剧烈涡旋30s，16000g离心1min，尽可能弃干上清，室温敞口静置3min，使残留的洗液挥发掉，注意不能放置过久以免磁珠过度干燥；(13)加入洗脱液60μL，涡旋震荡30s，16000g离心2min后，洗脱下来的RNA溶液转移至另一不含核酸酶的1.5mL离心管中，留取1μLRNA溶液用nanodrop测浓度，再取3μL左右RNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳分析，剩下的RNA溶液立即全部反转成cDNA，防止发生降解。
3.cDNA的合成
按照反转录试剂盒说明书合成cDNA第一链，步骤如下：
(1)取两支200μL不含核酸酶的PCR管，各加入3μL 10mM dNTPmix、3μL 50μM oligo(dT)20、24μLRNA，轻柔混匀；
(2)65℃加热5min，使模板变性，二级结构打开；
(3)立即置于冰上冷却至少1min；
(4)现配合成cDNA的预混液：
(5)向两支PCR管中各加30μL预混液，用微量移液器混匀；
(6)将反应混合液进行加热：50℃退火反应50min，然后85℃加热5min使反应终止；
(7)向反应混合液中各加入3μLRNAseH并混匀，在37℃加热处理20min，分解未完全反应的RNA；
(8)第一链cDNA的合成完成，分装后于-20℃保存备用。
4.重链抗体可变区VHH基因的扩增
取IgG2和IgG3可变区VHH基因各自的简并引物对，以cDNA为模板分别进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，引物对F、R2用于克隆IgG2亚型，引物对F、R1用于IgG3亚型的克隆，反应体系如下：
PCR程序为：
其中扩增IgG2、IgG3对应的上游引物分别为引物R2、R1，引物序列如表1所示。
表1 VHH抗体基因扩增与测序引物序列表
5.噬菌体展示纳米抗体文库的构建
采用SfiI分别对载体pComb3X和VHH进行酶,运用T4连接酶连接酶切后的VHH片段与载体pComb3X，取3μL连接产物到25μL E.coli ER2738感受态细胞中，轻混后全部吸出转移至预冷电转杯(内径为1mm)中，快速放置于电转仪中进行电转化；电击后，立即加入1mL37℃预热的SOC培养基到电转杯中，用移液枪轻轻吸打混匀，转移至摇菌管中，于37℃摇床中250rpm震荡复苏培养1h；重复电转了10次，每次3μL连接产物，汇集10次转化的菌液并取1μL用无菌水稀释10倍后涂布在LB-Amp平板上，于37℃培养箱培养过夜用于估算库容量。将全部转化菌转至200mLSB培养基中，加入羧苄青霉素至50μg/mL、四环素至20μg/mL；250rpm，37℃培养至OD600为0.6；加入1mL辅助噬菌体(1×1013pfu/mL)，37℃静置侵染30min；250rpm，37℃培养2h，加入卡那霉素至浓度为70μg/mL，继续培养过夜；次日，将菌液离心，4℃、10000rpm离心15min；取上清到无菌离心管中，加1/4体积PEG/NaCl溶液，冰浴2h，再离心，弃上清，用10mL重悬液(含1×蛋白酶抑制剂、0.02％NaN3、0.5％BSA的PBS缓冲液)重悬沉淀；用0.22μm滤器过滤噬菌体溶液，除去残留的细菌等；所得噬菌体溶液即为噬菌体展示纳米抗体文库，将其分装、做好记号，保存于-70℃。
6.噬菌体展示纳米抗体免疫文库的鉴定
从平板上挑20个单克隆各至1mLSB培养基中，37℃培养至菌液OD600约为0.8，取出菌液，以gback为引物，送公司测序，分析克隆序列，判定所建库的多样性程度。测序结果如图1所示，所选20个克隆的插入片段的氨基酸序列均不同，表明所构建的噬菌体展示纳米抗体库多样性良好，可用于后续的筛选工作。
实施例2赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体的淘选及鉴定
(一)赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体的淘选
以赭曲霉毒素A单克隆抗体为靶标物(所述赭曲霉毒素A单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，杂交瘤细胞株1H2已于2013年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且已在专利《杂交瘤细胞株1H2、其产生的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体及其应用》，申请号：201310115921.8中公开)，通过逐轮降低包被原浓度、竞争洗脱的赭曲霉毒素A标准品浓度，交替使用封闭试剂，进行亲和富集淘选，获得针对赭曲霉毒素A单克隆抗体的抗体，即抗抗体，又称作抗独特型抗体，淘选步骤如下：
(1)包被：包被赭曲霉毒素A单克隆抗体，20μg/mL，100μL/孔，包6孔，用包被buffer稀释均可；去吸附孔，包被3％BSA/PBS，100μL/孔，包6孔；4度过夜包被的效果优于37℃孵育2h；
(2)封闭：3％PBSTM，300μL/孔，37℃孵育1h后，手洗板3次；
(3)加库至包被抗原孔：100μL/孔，37℃反应1h，再室温摇床反应1h，然后用带滤芯枪头手洗这6个孔，洗板10次；
(4)洗脱：配制100ng/mL赭曲霉毒素A标准品，室温摇床反应1h；
(5)去吸附：将洗脱液转移到去吸附孔，100μL/孔，室温反应30min；
(6)汇集600μL洗脱物，称为“1st output”，第一轮淘选完成；1st output需经过扩增才能用于第二轮的淘选；
(7)测定“1st output”滴度，取10μL“1st output”，梯度稀释至103、104、105，这3个稀释液各取10μL侵染90μL ER2738(OD为0.8)，37℃静置30min，涂布LB-Amp(氨苄)平板，37℃过夜培养，次日数平板上的单克隆数，估算滴度。
在随后的淘选中，包被抗体浓度逐步减少，洗脱液中赭曲霉毒素A浓度逐渐降低，进行三轮淘选，淘选过程见表2，淘选富集结果见表3。
表2噬菌体纳米抗体库的淘选
表3每轮淘选噬菌体富集结果
(二)阳性噬菌体克隆的鉴定
(1)从最后一轮淘选的output滴度平板上随机挑取30个单克隆,于LB-Amp平板上保菌,同时接入3mL SB培养基；
(2)37℃摇床培养4-5h，至OD值为0.8，加入30μL M13KO7辅助噬菌体，37℃静置30min；
(3)37℃摇床培养1h，加终浓度为70μg/mL Kana，37℃培养；
(4)次日，各取500vL菌液离心，8000rpm、3min，上清稀释10倍用于Phage-ELISA；
(5)ELISA板封闭，3％PBSTM，300μL/孔，37℃孵育1h，机洗板3次；
(6)每个克隆的噬菌体上清(稀释10倍)加到对应的3个孔中，每孔50μL，1,4,7,10列加50μL标准品，2,3,5,6,8,9,11,12列加50μL 10％甲醇/PBS缓冲液，加好后酶标仪震荡混匀；
(7)37℃静置1h，手洗板10次；
(8)二抗，anti-M13/辣根过氧化物酶，1:5000稀释，37℃孵育1h；
(9)显色，37℃温育15min，检测450nm处的吸光值。
对30个克隆做phage-ELISA，发现它们与赭曲霉毒素A单克隆抗体结合反应差别较大。Phage-ELISA测定中，与抗体反应OD450值较高，同时加入OTA后OD450值明显降低现象的噬菌体克隆判定为阳性，结果如图2所示，通过四轮淘选共获得9个阳性克隆(依次为7、10、15、7、21、23、26、27、30号克隆)。根据上述ELISA结果，将阳性克隆从保菌平板上挑出，活化培养后送至武汉金开瑞生物公司进行序列分析，测序引物为gback，对9个阳性克隆进行基因测序，选择OD值最高的噬菌体展示的赭曲霉毒素A纳米抗体VHH2-24，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例3赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体的表达与纯化
(一)Top10F’感受态细胞的制备：
(1)用挑取适量Top10F’划线于LB-四环素平板，37℃培养过夜；
(2)挑取Top10F’单克隆到5mL LB培养基中，37℃、250rpm培养至OD600为0.6～0.8；
(3)将菌液转至预冷离心管中(约1.3mL/管)，4℃离心，8000rpm、8min；
(4)离心完后迅速置于冰上，弃上清，加入1mL预冷的0.1M CaCl2溶液重悬菌体，吸打混匀后冰浴30min；
(5)4℃下，8000rpm离心8min后迅速置回冰上，彻底吸尽液体，沉淀用100μL预冷的0.1MCaCl2溶液重悬，即为Top10F’感受态细胞。
(二)阳性噬菌体克隆质粒的提取与转化：
(1)从VHH2-24/ER2738的甘油菌中，挑适量划线于LB-羧苄平板，37℃培养过夜；
(2)挑VHH2-24/ER2738单菌落到2mL SB培养基中，37℃培养到OD600为0.8，提取VHH2-24的质粒；
(3)冰上，加1.5μLVHH 2-24质粒到上述制备的100μL Top10F’感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；
(4)42℃热击90s，迅速放回冰上，放置5min；
(5)超净工作台内，向每个离心管中加入700μL LB培养基，37℃、200rpm复苏培养45min；
(6)4℃下，12000rpm离心4min，吸弃部分上清，留取约150μL液体，混匀后涂布LB-羧苄平板，37℃过夜培养。
(三)纳米抗体的诱导表达与纯化
在VHH 2-24/Top10F’的平板上，挑单菌落到3mLSB培养基，37℃，250rpm摇床培养过夜后，转接1mL菌到200mLSB培养基中，继续培养至OD600为0.6，加入200μL 1M IPTG，37℃诱导过夜。4℃，8000rpm、15min离心收菌，根据菌体沉淀质量，按20mL/g加入裂解液B-PER，充分分散沉淀后室温缓慢摇动10min，再12000rpm离心20min，上清即为纳米抗体的粗取液。用0.01M PBS7.4透析粗提液，再过0.22μm水相滤膜，以备镍柱纯化。
使用Ni-NTA His·Bind Resin试剂盒纯化纳米抗体粗提液，步骤如下：
(1)依次用10倍层析柱体积的无菌ddH2O、0.01mol/L PBS7.4平衡柱子；
(2)将过滤除菌后的粗提液加到层析柱中，与填料混合后，室温下摇动1h，使纳米抗体与填料充分结合；
(3)将混合液装入柱中，用10倍柱体积的0.01mol/L PBS7.4平衡柱子；
(4)由1M咪唑分别配制20mM、40mM、300mM的咪唑-PBS7.4各10mL，过0.22μm水相滤膜，用作洗脱液进行梯度洗脱，用2mL离心管收集流出液；
(5)用10mL的20mM的咪唑-PBS7.4过柱子，不收集流出液；
(6)用10mL的40mM的咪唑-PBS7.4过柱子，收集前3mL流出液
(7)用10mL的300mM的咪唑-PBS7.4过柱子，收集全部流出液；
(8)用10倍柱体积的1M的咪唑-PBS7.4洗柱子，不收集流出液，使非特异性结合的杂蛋白全部被洗脱下来；
(9)依次用10倍柱体积的PBS、10倍柱体积的ddH2O、10倍柱体积的20％乙醇洗柱，最后用等体积20％乙醇水封柱保存。
对各管流出液作SDS-PAGE电泳分析，将有明显纳米抗体条带的流出液混合，于PBS缓冲液中4℃透析过夜，然后用PEG8000对抗体溶液进行浓缩或者使用浓缩管浓缩，即得VHH2-24纳米抗体溶液，并分装于-20℃保存。
实施例4抗独特型纳米抗体VHH2-24的特异性分析
(1)抗独特型纳米抗体VHH2-24的特异性分析：用包被缓冲液分别配制浓度为0.2μg/mL的赭曲霉毒素A抗原即OTA-BSA、黄曲霉毒素B1抗原即AFB1-BSA、玉米赤霉烯酮抗原即ZEN-BSA和呕吐毒素抗原即DON-BSA，4℃过夜包被酶标板；次日，用3％脱脂奶粉/常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液溶液封闭，300μL/孔，37℃孵育1h，将抗赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的四种单克隆抗体从10μg/mL开始，用常规磷酸盐缓冲液进行倍比稀释，37℃孵育1h；加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠单克隆抗体，37℃温育1h；加入显色液，37℃显色15min，加入终止液，测定OD450。
按上述方法包被、封闭后，将VHH2-24用常规磷酸盐缓冲液依次两倍稀释，按以上优化的浓度配制抗赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的四种单克隆抗体，分别加入50μLVHH2-24稀释液和50μL对应的单克隆抗体到各孔中，酶标仪振荡混匀，37℃孵育1h；再按1:5000稀释加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体，37℃反应1h；同以上方法显色，测定OD450值。
测试结果如图3所示，图3表明VHH2-24可以抑制赭曲霉毒素A单克隆抗体与抗原OTA-BSA的结合，随着VHH2-24浓度的不断增大，抑制作用越来越明显，而对抗黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素单克隆抗体与相应抗原的结合没有抑制作用，表明VHH2-24具有良好的选择性，只与赭曲霉毒素A单克隆抗体可变区进行特异性结合。
实施例5纳米抗体VHH2-24作为赭曲霉毒素A替代抗原的ELISA(VELISA)方法建立
纳米抗体VHH2-24作为赭曲霉毒素A替代抗原的竞争抑制ELISA反应的操作过程为：(1)将赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体稀释后替代赭曲霉毒素A抗原包被于酶标板，4℃包被过夜；次日，用封闭液进行封闭，37℃下孵育1h；(2)向酶标孔中加入甲醇/PBS 7.4缓冲液，将赭曲霉毒素A单克隆抗体和竞争物用PBS 7.4缓冲液稀释后加入到酶标孔中，37℃孵育1h；(3)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃温育1h；(4)加入显色液，37℃反应15min后，测定OD450。
(一)VELISA条件优化
(1)最佳VHH包被浓度与赭曲霉毒素A单克隆抗体工作浓度：对VHH2-24依次稀释100×、200×、400×、800×、1600×、3000×倍，对应的浓度分别为0.5、0.25、0.13、0.06、0.03、0.015μg/mL，包被酶标板，采用棋盘法分别对纳米抗体VHH2-24包被浓度及赭曲霉毒素A单克隆抗体工作浓度进行优化，取OD450值在1.0左右的纳米抗体浓度和赭曲霉毒素A单克隆抗体浓度为最优工作浓度，赭曲霉毒素A单克隆抗体稀释倍数分别为100、200、400、800倍，对应的浓度分别为10、5、2.5、1.25μg/mL，按此浓度进行间接ELISA分析，建立标准曲线(图4)。根据各个组合显色值不同，最终选定VHH2-24工作浓度为0.13μg/mL，对应赭曲霉毒素A单克隆抗体浓度为2.5μg/mL。
(2)最佳封闭试剂：在最优VHH2-24包被浓度和赭曲霉毒素A单克隆抗体工作浓度下，探讨不同封闭试剂对VELISA反应的影响。分别用3％BSA、1.5％OVA与3％脱脂奶粉，建立标准曲线(图5)，确定3％脱脂奶粉为最佳封闭液。
(3)最适pH：分别用pH为5、6、7、8的磷酸盐缓冲液稀释赭曲霉毒素A单克隆抗体，用含10％甲醇的各缓冲液倍比稀释赭曲霉毒素A标准品，建立的VELISA标准曲线如图6，当pH＝7时，反应灵敏度最高，升高或降低pH对反应灵敏度均有影响。
(4)最佳盐离子浓度：分别配用ddH2O，PBS，2×PBS，4×PBS四种溶液稀释赭曲霉毒素A单克隆抗体，用含10％甲醇的各缓冲液倍比稀释赭曲霉毒素A标准品，建立VELISA检测赭曲霉毒素A的标准曲线。如图7所示，在纯水反应体系和4×PBS反应体系下检测灵敏度最低，而PBS和2×PBS反应缓冲液对反应体系无明显影响，因此，选择PBS作为反应缓冲液。
(5)最适甲醇浓度：在以上优化出来的最佳纳米抗体包被浓度、赭曲霉毒素A单克隆抗体工作浓度、封闭试剂及最优磷酸盐缓冲液条件下，继续探讨不同甲醇浓度对VELISA反应的影响。用甲醇浓度分别为5％、10％、20％、40％的常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液溶液稀释赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素A单克隆抗体，建立抑制曲线(图8)，其中甲醇浓度为5％和10％时，由曲线得出的IC50很接近，但甲醇浓度10％时的IC50更小，且竞争拟合曲线的趋势相对更好。
(6)VELISA的交叉反应率：以VHH2-24为替代抗原，根据优化条件，选取AFB1、ZEN、DON三种真菌毒素作竞争物，测定VELISA的交叉反应率。由图9可看出，该ELISA对OTA灵敏度较高，VHH2-24的IC50值达到0.015g/mL，而与AFB1、ZEN、DON均不存在交叉反应，则VELISA特异性好，可针对性地检测农产品中的赭曲霉毒素A。
实施例6VHH-ELISA样品分析方法的建立
(1)纳米抗体VHH2-24在不同样品基质中对OTA的竞争曲线
对玉米、大米、小麦三种空白样品进行前处理，将三种样品提取液分别用PBS稀释4倍、8倍及20倍后，用提取液倍比稀释赭曲霉毒素A标准品，建立各基质提取液的VELISA竞争抑制曲线，并与不含基质的反应体系下建立的标准曲线进行比较，结果显示三种样品均对VELISA存在一定的基质效应，导致假阳性结果。同时发现，用4％BSA/PBS稀释提取液4倍时，能减小基质效应，使基质曲线与无基质时接近，结果如图10所示。
(2)VHH-ELISA在实际样品检测中的应用
为了评价VELISA检测体系的准确性，采用新建立的VELISA方法进行了玉米、大米、小麦样品的添加回收试验。分别对空白的玉米、大米、小麦样品添加10、20、50μg/kg的赭曲霉毒素A标准溶液，用新建立的方法VELISA法检测样品提取液中的OTA含量，结果见表4。OTA的添加回收试验显示，样品添加回收率在80～114.8％之间，表明本研究建立的基于纳米抗体VELISA方法能够应用于赭曲霉毒素A的污染监测中。
表4基于纳米抗体VHH-EILSA的样品添加回收试验
注：a每个结果为同一天内重复三次的平均值
b组间试验为五天内试验结果的平均值
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
序列表
＜110＞中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞一种赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体及其制备方法
＜160＞ 2
<210> 1
<211> 153
<212> PRT
<213>羊驼
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
1 5 10 15 20
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ile Phe Ser Leu Glu Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala
25 30 35 40
Pro Gly Lys Gln Arg Glu Met Val Ala Ile Ile Ala Arg Asp Ser Lys Thr Asn Tyr Val
45 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Ala Asp Ser Trp
85 90 95 100
Val Gly Ala Trp Arg Asp Glu Tyr Leu Glu Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
105 110 115 120
Ser Ser Ala His His Ser Glu Asp Pro His Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His
125 130 135 140
His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
145 150 153
<210> 2
<211> 367 bp
<212> DNA
<213>羊驼
<400> 2
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagt catcttcagt ctcgaaacca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagat ggtcgcaatt attgctcgtg atagtaagac aaactatgta 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagactacg ccaaggatac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgagacc tgaggacacg gccgtctatt actgtcatgc agatagttgg 300
gttggtgcct ggcgcgatga gtatctcgaa gtttggggcc agggcaccct ggtcactgtc 360
tcctcag 367

Claims (4)

1.一种赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.含权利要求2所述赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体核苷酸序列的重组表达载体、噬菌体或重组工程菌。
4.权利要求1所述赭曲霉毒素A抗独特型纳米抗体的制备方法，通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子；所述基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。
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