CN104311643B - 基于纳米抗体的脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原及其应用 - Google Patents

基于纳米抗体的脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及基于纳米抗体的脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原及其应用，氨基酸序列SEQ ID NO.:1，还涉及编码该氨基酸的核苷酸。本发明脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原可以替代价格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测，该模拟抗原具有与天然DON分子相似的免疫反应特性，效果良好。VHH相比于传统的基于多肽的抗原模拟表位及基于IgG的传统抗独特型抗体，具有结构更加稳定、耐酸碱和高温、检测灵敏度高等特性，因此其免疫检测稳定性得到了极大的提升，同时对环境的耐受能力也得到了提升。

Description

基于纳米抗体的脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于纳米抗体（单域重链抗体，Variabledomain of heavy chain of heavychain antibody, VHH）的脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原及其应用。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalneol，DON)是一种单端孢霉烯族毒素，主要由镰刀菌产生，广泛存在于大麦、小麦、玉米、燕麦和大米等农作物及其制品中。DON具有细胞毒性、胚胎毒性和免疫毒性等，可引起厌食、呕吐、腹泻、发烧和生长缓慢等症状，严重威胁人类及动物的健康。由于DON的高污染率和高毒性，对食品中DON的检测具有重要意义。
目前，检测食品中DON的方法主要有薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱、表面等离子共振及免疫学检测等方法，免疫学检测方法由于其检测方便、成本低廉、灵敏度高等优势在DON的检测应用广泛。然而，在建立免疫学检测方法的过程中，必不可免的需要以DON标准品为原料来制备竞争抗原或者固相包被抗原，DON标准品不仅价格昂贵而且具有较强的毒性，对检测人员的健康和环境造成极大的威胁，从而在一定程度上制约了免疫学检测方法的应用和推广。因此，人们开始利用抗独特型抗体和抗原模拟表位来实现有害小分子物质标准品的替代，并取得了一定的进展。噬菌体展示技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶分子特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛。
本发明通过用噬菌体展示技术，从驼源天然单域重链抗体库中筛选能与靶分子（抗DON单克隆抗体）特异性结合的单域重链抗体（VHH），以VHH作为DON模拟抗原应用于免疫学分析检测领域。该方法避免了传统抗独特型抗体制备所需的动物免疫过程，且具有普遍适用性，筛选得到的VHH具有与天然DON分子相似的免疫反应特性，可替代价格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测。VHH相比于传统的基于多肽的抗原模拟表位及基于IgG的的传统抗独特型抗体，具有结构更加稳定、耐酸碱和高温、检测灵敏度高等特性，因此其免疫检测稳定性得到了极大的提升，同时对环境的耐受能力也得到了提升。
发明内容
本发明以抗DON单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入驼源天然单域重链抗体库进行亲和淘选，获得了一种DON的模拟抗原，具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列。
其氨基酸序列的IMGT编号和结构域划分如图1所示。
本发明所提及的DON模拟抗原（VHH）包括四个框架区（Framework region, FR）和三个互补决定区（Complementarity-determining region, CDR）。其中，框架区（FR1-FR4）分别选自SEQ ID NO. :2，SEQ ID NO. :4，SEQ ID NO. :6和SEQ ID NO. :8，互补决定区（CDR1-CDR3）分别选自SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7。框架区结构相对保守，主要起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。
本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO. :2，SEQ ID NO. :4，SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO. :8中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有90%同源性。
本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :5和SEQ IDNO. :7中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有80%同源性。
本发明还涉及编码脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO. :9。
本发明提及的基于纳米抗体的DON模拟抗原(VHH)可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有DON模拟抗原（VHH）的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有DON模拟抗原（VHH）的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码模拟抗原的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行DON模拟抗原的大量制备。
本发明还涉及所述DON模拟抗原在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。
本发明DON模拟抗原在应用时，可以通过噬菌体扩增获得的展示有DON模拟抗原的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将DON模拟抗原经过原核生物或真核生物表达后以蛋白的形式进行免疫学检测分析。
本发明还涉及DON模拟抗原在免疫学检测分析中的应用，优选为DON模拟抗原在制备DON的模拟物试剂、材料中的应用。
本发明所述的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质（亲和力、特异性和稳定性等）更好的突变体。
本发明中所叙述的一些术语具有如下含义 ：
同源性：描述两个或多个氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列之间的同源性百分比可以通过【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】再乘以【100%】来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、 插入、 替换或添加 （与第一氨基酸相比）被认为是有差别。另外，同源性百分比也可以利用已知的用于序列比对的计算机运算程序（如：NCBI Blast） 获得。
结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。
IMGT 编号：IMGT 数据库 （The International ImMunoGeneTics Database）中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献 （Ehrenmann,F., Q. Kaas, et al.(2010). "IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: adatabase and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC,IgSF and MhcSF." Nucleic Acids Res 38(Database issue): D301-307. Lefranc, M.P., C. Pommie, et al. (2003). "IMGT unique numbering for immunoglobulin and Tcell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains." Dev CompImmunol 27(1): 55-77.）中的描述。
密码子（codon）：亦称三联体密码(triplet code)，指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。
前述DON模拟抗原可以替换价格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测，该模拟抗原具有与天然DON分子相似的免疫反应特性，效果良好。
本发明的有益效果是：本发明DON模拟抗原可以替代价格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测。该模拟抗原具有与天然DON分子相似的免疫反应特性，可提高DON检测灵敏度，减少DON标准品对操作人员健康和环境的危害，节约成本。本发明DON模拟抗原具有耐酸碱耐热性能。本发明制备DON模拟抗原的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质模拟抗原的筛选和制备，具有很高的应用价值。
附图说明
图1为DON模拟抗原（VHH）的氨基酸编号及结构域示意图。
图2为以DON模拟抗原建立的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围为2.18-62.25ng/mL，IC50为8.77 ng/mL。
具体实施方式
实施例1.驼源天然单域重链抗体库的构建
1）驼源白细胞的分离：在离心管中加入淋巴细胞分离液，再加入血液样品，700g离心20min；小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中，加入1/2体积的PBS，800g离心15min；弃上清，用PBS洗下离心管壁上的白细胞，850g离心10min；弃上清，300μL PBS重悬白细胞并计数；以体积比1：10加入裂解液（RNAiso）保存备用。
2）总RNA提取：向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡 15 s 使其充分乳化，室温静置 5 min；4℃ 12000g 离心 15 min，取上清转移至另一新鲜离心管中；加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温静置10min；4℃ 12000g 离心 10 min，弃上清，缓慢加入75%乙醇1mL，小心洗涤离心管管壁；4℃，12000g 离心 5 min 后弃去乙醇；室温干燥沉淀 5min，加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀，待 RNA 沉淀完全溶解后于 -80 ℃ 保存。
3）cDNA的合成：将反转录用的引物、dNTP Mixture和模板RNA混合，65 ℃ 5min，迅速冰浴。具体配制如下：
Oligo dT Primer（2.5 µM） 1 µL
dNTP Mixture（10 mM each） 1 µL
Total RNA < 5 µg
RNase free dH2O 5 µL
Total 10 µL
然后在上述 Microtube 中配置下列反转录反应液：
上述变性后反应液 10 µL
5×PrimeScript Buffer 4 µL
RNase Inhibitor（40 U/µL） 0.5 µL
PrimeScript RTase（200 U/µL 1 µL
RNase free dH2O 4.5 µL
Total 20 µL
PCR 仪上按下列条件进行反转录反应：42 ℃ 30 min，50 ℃ 30 min，70 ℃ 10min。PCR 产物于 -20 ℃ 保存备用。
4）抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应。
第一轮PCR：
5×PrimeSTAR Buffer 10 µL
dNTP Mixture（each 2.5 µM） 4 µL
Primer AlpVh-LD（10 µM） 1 µL
Primer CH2-R（10 µM） 1 µL
1 st-Strand cDNA 1 µL
PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/µL） 0.5µL
ddH2O 32.5µL
Total 50 µL
PCR 反应条件：94 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 45s，30 cycles；72℃ 7 min。
采用试剂盒回收 PCR 扩增产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板。
第二轮PCR：
5×PrimeSTAR Buffer 10 µL
dNTP Mixture（each 2.5 µM） 4 µL
Primer AlpVh-SfiⅠ 1 µL
Primer AlpVHHR1-NotⅠ/AlpVHHR2-NotⅠ 1 µL
第一轮PCR产物 1 µL
PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/µL 0.5µL
ddH2O 32.5µL
Total 50 µL
PCR 反应条件：94 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 15s，72 ℃ 45 s，5cycles；98℃ 10 s ，68 ℃ 40 s ，30cycles ； 72 ℃ 7 min。
5) 文库构建：
A. VHH编码基因及载体的双酶切
分别采用Sfi I和Not I 酶对VHH编码基因和pHEN1载体进行双酶切。
B. 酶切后产物的连接
将载体pHEN1和VHH片段混匀（摩尔比1∶5），于 16 ℃ 连接 12 h。先后加入 5 µL（1/10 量）的 3 M CH3COONa（pH 5.2）和 125 µL（2.5 倍量）的冷无水乙醇，-20 ℃ 静置1h，12000 rpm 离心回收沉淀，用 70 % 的冷乙醇清洗沉淀，室温干燥，溶于10 µL 去离子水中。
C. 电转化
取5 μL连接产物加至80 μL感受态细胞E.coli TG1中，充分混匀，冰上放置1min。转入0.1 cm 的电击杯中电击转化（电压为 1.8 kV），立即向电击杯中加入900µL SOC培养基，37 ℃ 180 rpm 培养1 h 。将菌液涂布于SOB-AG平板，37 ℃倒置培养过夜。
6）文库的救援：接种超过10倍库容量的细胞于100mL 2×YT/amp/2%葡萄糖，培养至OD600达0.5；加入辅助噬菌体（20:l感染复数），37℃，静置15min后，220rpm培养45min；4℃，3000g离心10min；弃上清，加入100mL新鲜的2×YT/amp/kan培养基重悬沉淀，30℃培养过夜；4℃ 3000g离心10min，取上清；加入1/5体积的PEG-NaCl溶液，4℃静置2h；4℃10000rpm离心20min，弃上清，沉淀用1mL PBS重悬；取10μL测定库容，其余加入终浓度50%甘油，-80℃保存。
实施例2.DON模拟抗原的亲和淘选及其鉴定
1）DON模拟抗原的亲和淘选：首先，用PBS (pH 7.4) 稀释抗DON单克隆抗体，并以终浓度10 μg/mL 包被酶标板，37 ℃孵育4 小时。第二天用PBST (10mM PBS，0.5 % Tween-20 (v/v) ) 洗涤3次后，加入300 μL的7 % BSA-PBS（3 % OVA-PBS）37℃封闭2小时。2小时后弃封闭液，用PBST洗涤5次，每孔加入100 μL驼源天然单域重链抗体库（滴度约2.0×1011cfu），37℃孵育1小时。吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤10次，加入100 μL的Glycine-HCl(0.2M, pH 2.2) 洗脱6-8min后，立即用15 μL Tris-HCl (1M，pH 9.1) 中和。取10 μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染20 mL生长至对数期的E. coli TG1菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。
在第二、第三和第四轮的淘选过程中，包被的抗DON单克隆抗体浓度分别为7.5 μg/mL， 5 μg/mL和2.5 μg/mL，洗脱时采用竞争洗脱，所用DON标品浓度分别为5 μg/mL，1 μg/mL和0.5 μg/mL，加入噬菌体孵育后用PBST洗涤次数分别为10次，12次和15次，其余步骤同上。
2）阳性噬菌体克隆的鉴定： 从第三轮和第四轮淘选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑取48个克隆，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法（IndirectEnzyme Linked immunoasorbent assay, I-ELISA）进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：首先，用PBS (pH 7.4) 将抗DON单克隆抗体稀释至 10 µg/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) )洗涤3次后，加入300µL的5%脱脂奶粉，37℃封闭2小时；弃封闭液，PBST洗涤3次后，加入100 µL噬菌体扩增液（2.0×1011 cfu），以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育1小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100 µL，37 ℃孵育1小时；加入100µL TMB底物溶液，避光显色10min；加入50µL终止液（2MH2SO4）终止反应；用酶标仪（Thermo Scientific Multiskan FC）测定450 nm处的吸收值。选取OD450大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。
3) DON模拟抗原的鉴定：采用间接竞争ELISA的方法进行DON模拟抗原的鉴定，具体方法为：用PBS (pH 7.4) 将抗DON单克隆抗体稀释至10 µg/mL， 4℃包被过夜；第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，加入300µL的5%脱脂奶粉，37℃孵育1小时；加入50 µL经间接ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆（1.0×1011 cfu）和50 µL DON标准品（浓度范围为0-100 ng/ml），37℃孵育1小时；加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100 µL，37℃孵育1小时；加入100µL TMB底物溶液，避光显色10min，测定OD450，能结合抗DON单克隆抗体，且能被DON标准品所阻断的噬菌体，鉴定为DON的模拟抗原。
实施例3.DON模拟抗原编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
将经过间接竞争ELISA鉴定展示有DON模拟抗原的噬菌体克隆进行DNA测序，根据DNA测序结果及密码子表可获得DON模拟抗原的氨基酸序列。得本发明模拟抗原氨基酸，序列如SEQ ID NO. :1。
实施例4.DON模拟抗原的大量制备
（1）以噬菌体扩增的方式进行制备
将展示有模拟抗原的噬菌体加入至20 mL接种有E.coli TG1的培养物中，37℃220 rpm振荡培养6 h。将培养物转入另一离心管中，4 ℃ 10000 rpm离心10 min，将上清的上部80 %转入一新鲜的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4 ℃静置120 min后，4℃10000 rpm离心10min，弃上清；再加入少量PBS清洗噬菌体。4℃ 10000 rpm离心10min，弃上清，加入1mL PBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。
（2）以蛋白表达的形式进行制备
分别采用Nco I和Not I 酶对外源编码VHH基因和表达载体（pET-25b）进行双酶切，将VHH编码基因克隆至表达载体pET-25b，经PCR和酶切验证后，将重组表达载体转入大肠杆菌Rosetta（DE3）。从转化平板上挑一单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养过夜，将过夜培养物按1 %接种量（v/v）接种于50 mL的LB/Amp，2 %葡萄糖培养基中，37℃，220 r/min振荡培养；当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入0.1mM的IPTG，30℃，220 r/min振荡培养8-12h；将培养物于4℃，8000rpm，离心20 min收集菌体沉淀。重悬细胞于5mL 预冷的PBS溶液，超声破碎10min后，8000rpm离心20min取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得DON模拟抗原（VHH）。
实施例5.DON模拟抗原耐酸碱实验
（1）包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4) 将抗DON单克隆抗体稀释至10 µg/mL，100µL包被于酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有5%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。
（2）活性检测
将本发明DON模拟抗原（VHH）分别用pH 5.0，6.0，7.0，8.0和9.0的PBS稀释至10 µg/mL，取100µL加入步骤（1）处理好的板条中，37℃孵育1小时。加入1:3000稀释HRP标记的抗His二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD450。比较不同pH条件下的吸光度值，结果显示VHH置于在pH 5.0-9.0的溶液中，其免疫检测性能（OD值）未见区别，显示出较好的耐酸碱性能。
实施例6.DON模拟抗原耐热实验
（1）包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4) 将抗DON单克隆抗体稀释至10 µg/mL，100µL包被于酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有5%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。
（2）活性检测
用10 mM PBS (pH 7.4) 将DON模拟抗原（VHH）稀释至10 µg/mL，分别置于50，60，70，80和90℃水浴5min，恢复到室温后，再分别取100µL加入步骤（1）处理好的板条中，37℃孵育1小时。加入1:3000稀释HRP标记的抗His二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD450。比较不同温度处理条件下的吸光度值，结果显示VHH置于在50-90℃水浴5min后，其免疫检测性能（OD值）未见区别，显示出较好的耐热性能。
实施例7.DON模拟抗原作为竞争抗原在ELISA中的应用
(1) 样品提取
称取1g 样品（谷物及其相关制品），加入5 毫升PBS（pH 7.4）溶液，充分振荡5分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤，取1毫升滤液加入1毫升 PBS混匀后，即为样品提取液，待用。
（2）包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4)将抗DON单克隆抗体稀释至10 µg/mL， 4℃包被过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次，加入300µL的5%脱脂奶粉， 37℃封闭1小时后，用PBST洗板6次待用。
（3）标准曲线的建立
取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 µL展示有DON模拟抗原的噬菌体（1.0×1011 cfu）/VHH蛋白表达物（10µg/mL）及一系列不同浓度的50 µL DON标准品，37℃孵育1小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗/抗VHH的组氨酸标签二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD450。以DON浓度对数为横坐标，结合率（加入DON的孔的OD450/未加入DON的孔的OD450×100%）为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
（4）样品的检测
取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 µL展示有DON模拟抗原的噬菌体（1.0×1011 cfu）/VHH蛋白表达物（10µg/mL）及待测样品提取液，37℃孵育1小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗/抗VHH的组氨酸标签二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD450，计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中DON的含量。
实施例8.DON模拟抗原作为固相包被抗原在ELISA中的应用
(1) 样品提取
称取1g 样品（谷物及其相关制品），加入5 毫升PBS（pH 7.4）溶液，充分振荡5分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤，取1毫升滤液加入1毫升 PBS混匀后，即为样品提取液，待用。
（2）包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4) 将表达的DON模拟抗原（VHH）稀释至10µg/mL，100µL包被于酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有5%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。
（3）标准曲线的建立
取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 µL 抗DON单克隆抗体（5µg/ml）和一系列不同浓度的50 µL DON标准品，37℃孵育1小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD450。以DON标准品浓度对数为横坐标，结合率（加入DON的孔的OD450/未加入DON的孔的OD450×100%）为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。结果显示标准曲线呈S型，线性相关性较好，检测范围为2.18-62.25 ng/mL，IC50为8.77 ng/mL（图1）。
（4）样品的检测
取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 µL 抗DON单克隆抗体（5µg/ml）和待测样品提取液，37℃孵育1小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD450。计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中DON的含量。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大学
<120> 基于纳米抗体的脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原及其应用
<130> 2014
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 1
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala His Ile Thr Arg Leu Gly Val Thr Tyr Tyr Ile Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Thr Glu Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ser Thr Val Pro Tyr Ser Ala Asn Tyr Trp Ser Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> Lama pacos
<220>
<221> Domain
<222> (1)..(25)
<223> FR1
<400> 2
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Lama pacos
<220>
<221> Domain
<222> (1)..(8)
<223> CDR1
<400> 3
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Lama pacos
<220>
<221> Domain
<222> (1)..(17)
<223> FR2
<400> 4
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
His
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Lama pacos
<220>
<221> Domain
<222> (1)..(7)
<223> CDR2
<400> 5
Ile Thr Arg Leu Gly Val Thr
1 5
<210> 6
<211> 38
<212> PRT
<213> Lama pacos
<220>
<221> Domain
<222> (1)..(38)
<223> FR3
<400> 6
Tyr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Thr Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> Lama pacos
<220>
<221> Domain
<222> (1)..(17)
<223> CDR3
<400> 7
Ala Ala Arg Arg Gly Ser Thr Val Pro Tyr Ser Ala Asn Tyr Trp Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> Lama pacos
<220>
<221> Domain
<222> (1)..(11)
<223> FR4
<400> 8
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> Lama pacos
<400> 9
ggagacggtg acctgggtcc cctggcccca gtaggaccag taattagcac tataaggtac 60
tgtcgaaccc cgtctagctg cacagtaata aacggccgtg tcctcaggtt tcaggctgtt 120
catttgcaga tacaccgtgt tctcggtgtt gtctctggag atggcgaatc ggcccttcac 180
ggagtctata tagtatgtaa caccaagccg tgtaatatgc gctacgaatt cacgctcctc 240
ccctggagcc tggcggaacc agcccatgcc ataactactg aaggtgcgtc cagaggctgc 300
acaggagagt ctcagagagc ccccagcctg caccaatcct cccccagact ccacgagctg 360
caactg 366

Claims (3)

1.基于纳米抗体的脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO. :1所示。
2.编码权利要求1所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO. :9。
3.如权利要求1所述模拟抗原的制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原的噬菌体粒子；所述基因工程重组表达的方式是指将编码模拟抗原的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原的大量制备。
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