CN101983970A - 抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv及其制备与应用，属于生物制品领域。本发明从能够分泌抗呕吐毒素DON的单克隆抗体的杂交瘤细胞株McGill078中，通过PCR方法克隆获得该抗体重链和轻链的可变区基因Fab段，通过基因工程的方法将两个基因重组后，构建原核表达质粒载体，转化大肠杆菌表达出能够特异性识别呕吐毒素DON的ScFv抗体活性片段，然后对重组单链抗体ScFv进行纯化和复性；本发明用作呕吐毒素DON抗体的重组单链抗体ScFv具有与呕吐毒素DON结合的活性。其优点是：对呕吐毒素DON的识别与结合活性，使其可用于呕吐毒素DON的残留检测，具有人源化改造后治疗呕吐毒素DON中毒的抗体药物前景，所构建的转化载体质粒易于保存与大量生产。

Description

抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv及其制备方法与应用

技术领域：

本发明涉及一种抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv及其制备方法，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述基因和多肽的制备方法，属生物制品领域。

背景技术：

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又名呕吐毒素，主要是由镰刀菌产生的次级代谢产物之一的单端孢霉烯族毒素，主要产毒菌是禾谷镰刀菌、雪腐镰刀菌等。目前被认为是存在于赤霉病小麦中的主要天然毒素之一。它可引起人畜中毒，因其广泛的存在并大量污染粮食，对人畜构成很大危害。联合国粮农组织和世界卫生组织1973年联合召开的第三次食品添加剂和污染物会议上，单端孢霉烯族毒素被定为最危险的自然发生食品污染物，列入国际研究的优先地位。DON化学性能稳定，具有较强的热抵抗力和耐酸，具有广泛的毒性，特别是对免疫功能具有明显的影响，根据DON的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激。

DON是全世界饲料和粮食的污染霉菌毒素之一，也是我国恶性肿瘤高发区居民粮食主要污染霉菌毒素之一，在我国北方食管癌高发区日常主食中高水平的普遍存在，而且这些毒素可能在食管癌形成中具有一定作用。我国在对江苏、安微、河南、甘肃、江西、贵州、上海赤霉病毒流行区小麦作DON、玉米赤霉烯酮的调查发现安徽小麦中DON含量最高达4,000g/kg，平均含量340g/kg；甘肃小麦受DON污染最严重，平均污染量达2,050g/kg，最高含量达20,000g/kg。小麦中玉米赤霉烯酮的污染，江苏最高约51g/kg、安徽为32g/kg、河南为8g/kg、甘肃为15g/kg、江西为6g/kg、上海为11g/kg。我国安徽，甘肃等地谷物中DON污染量严重超标。

DON的污染常出现于小麦和玉米中，因此绝大部分DON检测方法是针对这些物质。DON的分离检测可用多种不同的方法，如薄层色谱法、酶联免疫吸附试验、气相色谱、高效液相色谱、超临界流体色谱法和毛细管电泳色谱等。各有其优点与不足：如TLC法的精确度低，操作过程复杂，分析结果的可重复性和再现性差；仪器方法具有灵敏、高选择性、准确性和精确性等优点但样品前处理复杂耗时；酶联免疫法优点是快速、灵敏、高通量，但抗体价格影响较大，抗体制备时间长，作为一种较为准确的快速筛查方法，抗体的制备的分子生物学研究已成为国内外研究热点。

目前尚无有效药物治疗霉菌毒素中毒，抗菌素的解毒效果并不明显，而且会造成药物的残留与抗性等毒副作用。免疫治疗方法，因抗体的种间异源性及分子量过大造成宿主的防御性反应，而单链抗体ScFv则可以避免上述治疗难题；ScFv是具有完全抗体结合位点的最小抗体片段，大小为完整抗体的1/6，具有以下优点：(1)保持了抗体的特异性，大大减少了免疫原性；(2)组织穿透力强，分子量小，易进入靶标实体的微循环，且体内清除也较快；(3)无Fc段，可作为导向载体，以酶或细胞因子及药物连接构建双功能抗体，利于治疗与诊断；(4)易于基因操作和基因工程的大量生产；(5)可在多种不同的原核、真核表达系统中表达，如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物细胞等表达系统。

目前关于呕吐毒素DON单链抗体ScFv的研究国内外未见报道，相关专利的申请国内外亦未见报道。

发明内容：

本发明针对以上现有技术存在的缺点，针对抗体杂交瘤细胞株在大规模生产上容易突变，细胞株不稳定，基因易丢失，代价昂贵等诸多缺点，本发明应用基因工程手段，提供了一种抗呕吐毒素DON的单克隆抗体重链和轻链可变区基因及所编码的多肽，重组后表达出特异性识别和结合呕吐毒素DON的抗体活性片段，使大规模廉价生产抗体成为可能。

本发明的另一个目的在于：单链抗体ScFv片段在制备用于呕吐毒素DON残留检测试剂中的应用，为后续人源化改造及免疫治疗呕吐毒素DON中毒提供新的途径。

本发明的目的是这样实现的：为了解决上述的技术问题，发明人从一株单克隆抗体的杂交瘤细胞株(定名为McGill078)，通过PCR方法克隆得到抗体的重链与轻链可变区基因，其主要的步骤为：从杂交瘤细胞株McGill078中用Trizol(Invitrogen)试剂提取总RNA，分离纯化mRNA(PolyATtract mRNA Isolation Systems，Promega)，按照Invitrogen试剂盒(SuperScript III First-Strand Synthesis Systen for RT-PCR)，以Oligo(dT)20为引物，RT-PCR逆转录合成cDNA，然后以设计特异性引物扩增VL和VH基因。其中，扩增VH的引物为：

VHF：5’-ATGGCCCTCGAGGTGAAGCT-3’

VHB：5’-TGAGGAGACGGTGACTGAGG-3’

扩增VL的引物为：

VKF：5’-GACATTGTGATGACACAGTC-3’

VKB：5’-GCTCCAGCTT GGTCCCCCCT-3’

序列测定后从NCBI中BLAST比较分析后，确认重链可变区基因序列为序列表中SEQID No.4所示的核苷酸序列，其编码的多肽序列为序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；轻链可变区基因序列为SEQ ID No.6所示核苷酸序列，其编码的氨基酸序列为SEQ IDNo.5所示氨基酸序列。上述重链、轻链可变区基因经重组后，构建载体质粒转入大肠杆菌后可表达出特异性识别呕吐毒素DON的ScFv抗体可变区基因片段。

对于本发明成功克隆的抗呕吐毒素DON的特异性单克隆抗体的重链、轻链可变区基因，经基因序列数据库(IMGT)和(NCBI)同源性比较，结果表明：所获得的基因序列来自小鼠胚系基因，其中重链、轻链可变区基因和现有报道的各种抗体基因序不完全一致，所获得的重链、轻链可变区基因均可以编码正确的小鼠抗体可变区氨基酸序列。

本发明所涉及及所述的单克隆抗体重链和轻链可变区基因及其编码的多肽在检测呕吐毒素(DON)残留方面的应用。试验结果表明，ScFv抗体的抑制中浓度(I₅₀)为5.3μg/mL，最低检测限I₁₀为0.088μg/mL，线性检测范围在0.1～12.8μg/mL。

以制备的单链抗体ScFv为模板，根据其核苷酸序列及氨基酸一级结构和三维空间构型进行改造(包括人源化)，具有成为免疫治疗呕吐毒素DON中毒的抗体药物前景。

本发明的单克隆抗体重链和轻链可变区基因也可以采用基因工程方法，构建表达多种形式的小分子基因工程抗体，如嵌合抗体、ScFv抗体，抗体融合蛋白，导向药物载体等，并具制备用于呕吐毒素DON中毒的治疗抗体的药用前景。

附图说明

图1为PCR扩增的McGill078抗体重、轻链可变区基因的琼酯糖电泳图。

图2为McGill078单链抗体ScFv基因的PCR产物电泳图；

图3为载体pET26b(+)-ScFv结构示意图；

图4为载体质粒pET26b(+)-ScFv转化大肠杆菌后的克隆基因测序图谱。

图5间接竞争ELISA检测呕吐毒素标准抑制曲线。

具体实施方式

实施例一.抗呕吐毒素单克隆抗体McGill078杂交瘤细胞株的建立及抗抗呕吐毒素单克隆抗体的制备

以文献方法(Casale WL，Journal of Agriculture and Food Chemistry，1988，36：663-668)合成抗原，按常规方法建立了该杂交瘤细胞株(吴建祥，微生物学报(Acta MicrobiologicaSinica)，2000，40(6)：638-645)定名为McGill078，将McGill078杂交瘤细胞株进行培养、传代，重悬后接种于小鼠腹腔，10天后待腹部膨胀后采集腹水约15ml。采用快速批次吸附法纯化鼠腹水中的抗呕吐毒素抗体，并用超滤膜透析法进行浓缩；经测定此单克隆抗体的浓度为9.2mg/ml，抗体类型为IgG1(γ₁，κ)，具有良好的抗原特异性和抗原亲和力。

实施例二.抗呕吐毒素单克隆抗体McGill078重链、轻链可变区基因克隆

1、所用的单克隆杂交瘤细胞株McGill078能分泌特异性识别呕吐毒素DON的抗体，其分泌的抗体分子亚型为IgG₁，其重链、轻链同种型为γ₁/K。

2、取对数生长期的McGill078杂交瘤细胞(2×10⁶)，采用Trizol(Invitrogen)试剂提取总RNA，分离纯化mRNA(PolyATtract mRNA Isolation Systems，Promega)，按照Invitrogen试剂盒(SuperScript III First-Strand Synthesis Systen for RT-PCR)，以Oligo(dT)20为引物，RT-PCR逆转录合成cDNA，然后以特异性引物扩增轻、重链可变区基因，1％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试验盒(promega公司)回收片段，TA克隆插入pMD18-T载体，序列测定、分析。

有关操作步骤如下：

(1)抽提总RNA(参照Invitrogen公司的Trizol抽提总R N A说明书)，分离纯化mRNA(参照Promega公司PolyATtract mRNA Isolation Systems说明书)，RT-PCR扩增单抗McGill078重链和轻链可变区基因VH和VL参照Invitrogen公司的Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR)。

5μg总RNA(or mRNA)           8μL

50μM oligo(dT)20            1μL

10mM dNTP mix                1μL

DEPC-treated water        to 10μL

65℃孵育5分钟，快速置于冰上1分钟，加入以下成分：

10X RT buffer                2μL

25mM MgCL₂                   4μL

0.1M DTT                     2μL

RNAaseOUT(40U/μL)           1μL

Superscript III RT(200U/μL) 1μL

                                  

                             20μL

50℃孵育50分钟，然后85℃灭活5分钟，置于冰上，加入1μLRNAase H，37℃孵育20分钟.

(2)PCR法扩增VH和VL

10X RT buffer minus Mg++   5μL

50mM MgCL₂                 1.5μL

10mM dNTP mix              1μL

5’和3’引物(10μM)      各1μL

cDNA                       2μL

Taq(5U/μL)                0.5μL

加H₂O至                    50μL

                                     

扩增条件：94℃预变性2分钟，然后94℃变性15sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共40个循环。1％琼脂糖电泳，结果见图1。

其中，扩增VH的引物为：

VHF：5’-ATGGCCCTCGAGGTGAAGCT-3’，具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；

VHB：5’-TGAGGAGACGGTGACTGAGG-3’，具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

扩增VL的引物为：

VKF：5’-GACATTGTGATGACACAGTC-3’，具有SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；

VKB：5’-GCTCCAGCTT GGTCCCCCCT-3’，具有SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；

(3)PCR产物的克隆

依据Takara分司TA克隆试剂盒说明书，将单克隆抗体McGill078重链和轻链可变区基因的PCR产物插入pMD18-T载体，16℃过夜，过夜产物转化感受态细胞Top10，铺LB平板(含氨苄抗性100μg/ml，100μg/ml X-gal，and40μg/ml IPTG)。第二天挑取平板上白色单克隆菌落，LB液体培养基振摇，PCR鉴定为阳性菌落测序。

McGill078重链、轻链可变区基因序列分析分别应用以下两个服务器：

http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest？livret＝0&Option＝mouseIg

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

与数据库中的其它报道抗体基因进行同源性比较，分析其胚系来源，结果如下：

McGill078_VH重链可变区的胚系基因来源：

IMGT同源性比较：

V-GENE    IGHV2-6-4*01

J-GENE    IGHJ4*01

D-GENE    IGHD1-1*02

其可变区基因的超变区为：

CDR1：GGG TTC TCA TTA TCC AGA TAT ACT

CDR2：ATA TGG GGT GGT GGA AGT ACA

CDR3：GCC AGA AGG GGA GGT AAC TAC GGA CGG TAT GCT ATG GAC TAC

NCBI BLAST同源性比较：

Sequence producing significant alignments：

gi：641221    LOC641221    ref|XM_001472961.1| 414 3e-113

gi：641221    LOC641221    ref|XM_918576.2|    414 3e-113

gi：100048271 LOC100048271 ref|XM_001479896.1| 411 3e-112

gi：630293    LOC630293    ref|XM_903418.2|    366 7e-99

McGill078_VL轻链可变区的胚系基因来源：

IMGT同源性比较：

V-GENE    IGKV3-12*01

J-GENE    IGKJ2*01

其可变区基因的超变区为：

CDR1：AAA AGT GTC AGT ACA TCT GGC TAT AGT TAT

CDR2：CTT GTA TCC

CDR3：CAG CAC ATT AGG GAG CTT ACA CG

NCBI BLAST同源性比较：

Sequence producing significant alignments：

gi：676193     LOC676193     ref|XM_988029.1|    510 3e-142

gi：100047222  LOC100047222  ref|XM_001477680.1| 455 1e-125

gi：100047628  LOC100047628  ref|XM_001476664.1| 322 1e-85

gi：100047628  LOC100047628  ref|XM_001476679.1| 294 3e-77

gi：100047628  LOC100047628  ref|XM_001476703.1| 281 2e-73

结果表明：单克隆抗体McGill078重链和轻链可变区基因序列来自小鼠胚系基因，与现有报道的其它抗体基因序列不完全一致，属于一种新的抗体可变区基因，其重链可变区基因核苷酸序列如列表中SEQ ID No.4所示，其编码的多肽序列为序列表中SEQID No.3所示；轻链可变区基因序列为SEQ ID No.6所示，其编码的氨基酸序列为SEQID No.5所示。

实施例三.单链抗体ScFv的构建与表达

ScFv的组装，采用重叠延伸法(SOE)用编码亲水性多肽接头的DNA片段(G₄S)₃将克隆的抗体轻、重链可变区基因连接，构成5’VH-Lingker-VL3’形式。ScFv与表达载体pET26b(+)(Novagen公司)经限制性内切酶BamHI、HindIII酶切后，T4连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10F’中进行表达，进而针对以包涵体(IBS)形式表达的ScFv表达系统，进行IPTG诱导表达条件优化、包涵体分离、变性、复性。结果表明，ScFv在大肠杆菌中成功表达。

有关的操作步骤具体如下：

(1)pMD18-T质粒中VH与VL基因的克隆

pMD 18T-VH模版(50ng)

(Or pMD18T-VL)(50ng)               1μl

5’primer                  1μl

3’primer                  1μl

10X PCR buffer             5μl

Mg2+(25mM)                 4μl

dNTPs(2.5mM)               4μl

Taq DNA polymerase(5U/uL)  0.5μl

加水至总体积               50μl

                                  

PCR反应条件为94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。其中在扩增VH基因时，在VH的5’端增加了BamHI酶切位点，在VH的3’端增加了部分linker碱基；在扩增VL基因时，在5’端增加了全部linker碱基，在VL3’端增加了HindIII酶切位点，引物序列如下：

            BamHI

VHF：5’-CG GGA TCC TATG GCC CTA GAG GTG CAG CT-3’

                        Linker                         

VHB：5’-acc gga gcc gcc gcc gcc aga acc acc acc acc TGAGGAGACGG TGA

         CTGAGG-3’

                              Linker                                  

VLF：5’-ggt ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt ggt tca

       GACATTGTGATGACACAGTC-3’

              HindIII

VLB：5’-CCC AAG CTT GCTCCAGCTT GGTCCCCCCT-3’

(2)单链抗体ScFv的构建：

用胶回收的VH，VL进行第二轮PCR：

VH(50ng)        1μl

VL(50ng)        1μl

VHF primer      1μl

VLB primer      1μl

10XPCRbuffer    5μl

dNTPs(2.5mM)               4μl

Mg2+(25mM)                 4μl

Taq DNA polymerase(5U/uL)  0.5μl

加水至总体积：             50μl

                                  

PCR反应条件为94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环，72℃10min。

结果见图2。

(3)PCR产物与表达载体pET26b(+)酶切与连接

酶切：

pET26b(+)或纯化的ScFv PCR产物  100ng

BamHI                          1μl

HindIII                        1μl

10X buffer                     5μl

加水至总体积：                 50μl

                                       

37℃酶切过夜。1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的条带。

连接：

酶切后的ScFv                   20ng

酶切后的pET26b(+)              10ng

T4DNA连接酶                    1μl

5Xbuffer                       2μl

加水至总体积                   10μl

                                     

16℃连接过夜；重组质粒结构示意图见图3。

(4)连接产物转化：

感受态细TOP10F’100ul，加入10ul连接产物，混匀，置冰浴30分钟，42℃热休克90秒，然后置冰浴3分钟，加入0.5ml LB培养基，37℃培养1小时。8000g离心5分钟，留约100ul，弃上清，与沉淀混匀后涂板(含卡那抗性50μg/ml)，37℃培养过夜。第二天挑取平板上单克隆菌落20个，LB液体培养基振摇，PCR及酶切鉴定均为阳性的菌落进行序列测定；结果见图4。

(5)重组质粒pET26b(+)-ScFv的表达：

将含有重组质粒pET26b(+)-ScFv和空载体pET26b(+)的Top10菌株接种到含卡那霉素(100μg/ml)的LB中，37℃震荡过夜，次日转接.37℃培养至菌液吸光度约0.9时，加异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl B.D-thiogalactoside，IPTG)诱导表达蛋白，调节IPTG的终浓度为1mmol/L，25℃诱导过夜，以未加IPTG菌液作对照，进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定高效表达的菌株，检测培养上清及细菌沉淀中重组蛋白的表达。

(6)ScFv抗体的纯化与变性复性：

4℃离心收集菌体，将沉淀重悬于预冷的50mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA(pH7.0)中溶解，先反复冻融3次然后超声破碎细菌，4℃，30000g离心30min。沉淀用3mol/L尿素和50mmol/L Tris-HCl(pH7.0)洗涤，30000g，4℃离心30min收集包涵体。6mol/L盐酸胍和0.1mol/L Tris-HCl(pH7.0)(或者1％的triton X-100)，于4℃摇动过夜溶解包涵体。4℃，30000g离心30min去除沉淀，上清用于纯化。上样于镍金属亲和层析柱，用6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCl和50mmol/L咪唑(pH7.0)洗柱，用含有250mmol/L咪唑、6mol/L尿素和50mmol/LTris-HCl洗脱结合在镍柱上的scFv。将洗脱液加到透析袋中，用TEA缓冲液充分复性24h，中间换液1次，继续用PBS透析24h。纯化的蛋白稀析到复性缓冲液I：50mM Tris-HCL、0.15mMNaCL、2M urea、0.5mM还原型谷胱甘肽、0.1mM氧化型谷胱甘肽、pH8.0，终浓度为100μg/ml，复性24小时后，将蛋白装入复性缓冲液II：50mM Tris-HCL、0.15mMNaCL、pH8.0，透析复性12小时，超滤管Centricon30浓缩蛋白，10-12％SDS-Page电泳分析。超滤浓缩样品至适当体积，BCA法测定蛋白含量-20℃分装保存。

实施例四.SCFV的活性分析：

1、竞争性ELISA

参照文献(免疫学试验技术：鲍建芳，沈建根主编，浙江大学出版社，2006-12-1，ISBN：9787308050371)进行，包被50ng抗原，加入固定量(10ng/孔)的鼠抗呕吐毒素DON单克隆抗体，分别以10ng到100ng量的ScFv作为竞争性抗体与鼠抗进行竞争，以羊抗鼠HRP标记的抗体作为酶标二抗，显色后测定A₄₅₀值。直接ELISA表明纯化复性后的ScFv具有较强的抗原结合能力，竞争性ELISA表明复性后的单链抗体ScFv可以与鼠源的抗体进行竞争，竞争率为65％。

2、间接竞争性ELISA

具体步骤如下：

(1)抗体与标样(待测样)预混：用PBS缓冲液配置系列浓度的赤霉互毒素标样。用PBS将抗体稀释至两倍工作浓度，再与等体积的标样室温预混，对照用PBS与抗体等体积预混，过夜。

(2)包被：CBS缓冲液将工作浓度的包被抗原以100μL/孔分别加入96孔板，4℃过夜。

(3)封闭：每孔加封闭液(1％OVA)200μL，37℃温浴1h。

(4)加样品：将预混液加入酶标板，100μL/孔，以PBS为空白对照，37℃温浴2h。

(5)加酶标二抗：PBS将酶标二抗(HRP标记的抗His-tag抗体)稀释到工作浓度加入酶标板，100μL/孔，37℃温浴1h。

(以上每一步结束都用洗涤液PBST洗3次)

(6)显色：将底物溶液加到酶标板上，100μL/孔，37℃显色15min。

(7)终止反应：50μL/孔2M H₂SO₄快速加到96孔板中，于450nm读取光吸收值。

按照公式抑制率(I)＝100[(OD对照-OD标样)/OD对照]，计算抑制率(I)。最后计算得到，ScFv抗体的抑制中浓度(I₅₀)为5.3μg/mL，最低检测限I₁₀为0.088μg/mL，线性检测范围在0.1～12.8μg/mL，抑制方程为y＝7.678x+9.321，R²＝0.991。抑制曲线见图5。

除上述实施例外，本发明还可能有其它实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均在本发明要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗呕吐霉素DON单链抗体ScFv，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.一种抗呕吐霉素DON单链抗体ScFv的编码基因，其特征在于其编码基因序列为SEQ ID No.2所示。

3.一种抗呕吐霉素DON单链抗体ScFv的重组载体，其特征在于，载体为pET26b(+)-ScFv，其含有SEQ ID No.2所示基因序列。

4.一种抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于以下步骤实现：

1)合成抗原；以蛋白BSA合成免疫用抗原，动物注射免疫Bab/C小鼠，以OVA合成包被用抗原；

2)建立杂交瘤细胞株McGill078；获得免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，阳性克隆筛选后，获得杂交瘤细胞株McGill078，将杂交瘤细胞株McGill078进行培养、传代，重悬后接种于小鼠腹腔，10天后待腹部膨胀后采集腹水15ml；而后采用快速批次吸附法纯化鼠腹水中的抗呕吐毒素抗体，经测定单克隆抗体的浓度为9.2mg/ml，抗体类型为IgG1(γ₁，κ)，具有抗原特异性和抗原亲和力；

3)抗呕吐毒素DON单克隆抗体ScFv的重链、轻链可变区基因克隆

取2×10⁶个对数生长期的McGill078杂交瘤细胞，采用Trizol试剂提取总RNA，分离纯化mRNA；利用Invitrogen试剂盒，以Oligo(dT)20为引物，RT-PCR逆转录合成cDNA；通过PCR方法以特异性引物扩增轻链可变区基因、重链可变区基因；1％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试验盒回收片段，T A克隆插入pMD18-T载体，获得抗呕吐毒素DON单克隆抗体ScFv的重链、轻链可变区基因；

4)单链抗体ScFv的构建与表达

ScFv的构建，采用重叠延伸法SOE用编码亲水性多肽接头(G4S)₃将克隆的抗体轻、重链可变区基因连接，构成5’VH-Lingker-VL3’形式；ScFv与表达载体pET26b(+)经限制性内切酶BamHI、HindIII酶切后，T4连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10F`中进行表达，进而针对以包涵体IBS形式表达ScFv表达系统，进行IPTG诱导表达；

5)单链抗体ScFv的纯化与变性复性，获得单链抗体ScFv；

pET26b(+)-ScFv转化进入TOP10F`，IPTG诱导表达，收集包涵体沉淀，冰浴超声破碎，在菌体裂解物中加入质量体积百分比为1％的triton X-100，20000g离心30分钟，上清液过滤膜，尿素溶解备用，Ni²⁺-IDA His-bind亲和层析纯化蛋白，稀析法和透析法对目的蛋白复性，纯化的蛋白稀析到复性缓冲液I：50mM Tris-HCL、0.15mMNaCl、2M urea、0.5mM还原型谷胱甘肽、0.1mM氧化型谷胱甘肽、pH8.0，调节复性缓冲溶液I终浓度为100μg/ml，复性24小时后，将蛋白装入复性缓冲液II：50mMTris-HCl、0.15mMNaCl、pH8.0，透析复性12小时，浓缩蛋白，获得单链抗体ScFv。

5.根据权利要求4所述的抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于其中特异性引物为：

重链上游引物：VHF：5’-ATGGCCCTCGAGGTGAAGCT-3’

重链下游引物：VHB：5’-TGAGGAGACGGTGACTGAGG-3’

轻链上游引物：VKF：5’-GACATTGTGATGACACAGTC-3’

轻链下游引物：VKB：5’-GCTCCAGCTTGGTCCCCCCT-3’。

6.根据权利要求4所述的抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于其中抗体重链可变区，具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求4所述的抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于其中抗体重链可变区基因，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求4所述的抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于其中抗体轻链可变区，具有SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求4所述的抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于其中抗体重链可变区基因，具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

10.一种抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv在呕吐毒素DON残留检测方面的应用。

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