CN104098740B - 一种单端孢霉烯族类毒素分子印迹聚合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单端孢霉烯族类毒素分子印迹聚合物，所述单端孢霉烯族类毒素为顺势二羟基结构，该分子印迹聚合物通过如下手段制得：以含双键的取代苯硼酸作为功能单体，在碱性条件下，将指定的单端孢霉烯族类毒素作为模板分子与作为功能单体的含双键的取代苯硼酸形成共价复合物，进一步和含双烯键的交联剂、引发剂及致孔剂混合，通过紫外光照射进行光引发或者热聚进行热引发，引发功能单体与交联剂之间、交联剂与交联剂之间的聚合反应形成聚合物，然后用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有与顺势二羟基可逆结合的苯硼酸位点以及与模板分子形状相互补的空腔的分子印迹聚合物。
Description
技术领域
本发明属于毒素检测领域，特别地涉及一种单端孢霉烯族类毒素分子印迹聚合物。
背景技术
单端孢霉烯族类毒素(Trichothecenes)是一类由镰刀菌属真菌产生的代谢产物，都含有特征性的12，13-环氧-单端孢氧-9-烯环结构，按照他们化学结构的不同而被分为A、B、C、D四型，天然污染农作物的是A、B两型。A、B型单端孢霉烯族类毒素广泛存在于粮食、饲料以及粮谷类食品中，主要来源于被真菌污染的小麦、大麦和玉米等粮食。由这些污染原料制成的食品和饲料中往往含有单端孢霉烯族类毒素(Lancovaetal.，2008)。人类许多急性疾病的爆发与消费镰刀霉污染的粮谷类食品有关(Goyartsetal.，2007)。如果饲料中含有A、B型单端孢霉烯族类毒素，不仅对饲料喂养的动物造成伤害，影响产量和质量，还可能将这些毒素转移到奶、肉、蛋等动物源性食品中，严重危害消费者的健康(Seelingetal.，2006；Valentaetal.，2005)。
目前，单端孢霉烯族类毒素的定量检测方法主要有气质联用法(GC-MS)(Cunhaeta1.，2012；Yelkoeta1.，2012)，液相色谱(Lippoliseta1.，2008)，液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)(Josepeta1.，2012；Rasmusseneta1.，2010)和酶联免疫法(ELISA)(Monaeta1.，2012；Klinglmayreta1.，2010)。可见，单端孢霉烯族类毒素的检测主要采取先富集(固相萃取、柱色谱等技术)再定量检测(依赖质谱、液谱等高端仪器)的方法。该方法具有检测灵敏度高，稳定、可靠等优点。但是，该方法耗时(前处理时间长)、费用高昂(各种柱子、填充材料的价格不菲，所需仪器昂贵)。酶联免疫法是基于抗原抗体专一性反应的免疫方法，具有灵敏度高，无需前处理，回收率高等优点。但是，在免疫反应中使用的单克隆抗体存在价格昂贵、不易保存(需要低温存储)、且生产周期较长等诸多问题。这些问题严重限制了酶联免疫法的使用与推广。因此，发展一种选择性专一、稳定性好、价格低廉的抗体替代者不仅具有重要的科学意义，还具有可观的市场前景。分子印迹聚合物(MIP)(参见G.Wulff,Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.1995，34，1812-1832；G.Vlatakis，L.I.Andersson，P.Muller,K.Mosbach，Nature1993，361，645-647)是重要的抗体仿生材料。
分子印迹技术具有以下优点：一、预定性，可以根据使用目的制备不同的分子印迹聚合物；二、专一性，能专一地识别模板分子，与模板分子间形成类似于抗体与抗原间的相互作用(分子印迹聚合物因此被称为“塑料抗体”或“人工抗体”)；三、实用性，分子印迹聚合物可以通过化学合成大规模制备，价格低廉，而且适用于各种反应条件、稳定性高、使用寿命长。因为这些优点，分子印迹聚合物在对光学异构体拆分、固相萃取、化学仿生传感、模拟酶催化和药物分析技术等领域已展现了良好的应用前景(参见L.X.Chen，S.F.Xu，J.H.Li,Chem.Soc.Rev.2011，40，2922-2942)。
生物分子的印迹有相当的挑战性，主要存在两个方面的困难：第一，生物分子在通常的聚合条件下容易发生构型变化甚至变性；其次，生物分子在聚合物网络内的传质慢，模板分子的除去困难。为了解决以上困难，表面印迹(Hoshinoeta1.，2011)、抗原决定基印迹(Nishinoeta.，2006)、金属配合法(Qineta1.，2009)和纳米技术(Caieta1.，2010)等方法被发展、应用于生物大分子(蛋白)的印迹。但毒素的分子印迹文献报道很少。Choi等采用表面等离子共振法(surfaceplasmonresonance，SPR)在金表面制备了脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)分子印迹聚合物(Choieta1.，2011)。DeSmet等采用本体聚合的方法制备了T-2毒素的分子印迹聚合物(Deeta1.，2010)。Pascale等利用甲叉丁二酸(ItaconicAcid)对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的亲和性，先识别DON再聚合制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的分子印迹聚合物(Pascaleeta1.，2008)。
上述印迹的方法各有优缺点，但是一种印迹方法都只能印迹一种毒素。对于结构存在差异的单端孢霉烯族类毒素而言，发展一种适用于多种毒素的印迹方法具有及其重要的科学意义和市场前景。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种单端孢霉烯族类毒素分子印迹聚合物，所述单端孢霉烯族类毒素为顺势二羟基结构，其特征在于，该分子印迹聚合物通过如下步骤制得：
(1)配置预聚液：以含双键的取代苯硼酸作为功能单体，以单端孢霉烯族类毒素作为模板分子，在碱性条件下，使得所述模板分子与所述功能单体混合均匀并形成共价复合物，再加入含双烯键的交联剂、致孔剂，紫外光引发剂或热引发剂，进一步混合均匀，得到的溶液作为预聚液；
(2)制得聚合物：针对所述预聚液，通过紫外光照射进行光引发或者通过热聚进行热引发，引发功能单体与交联剂之间、交联剂与交联剂之间的聚合反应从而形成聚合物；
(3)制得分子印迹聚合物：用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有与顺势二羟基可逆结合的苯硼酸位点以及与模板分子形状相互补的、空腔的分子印迹聚合物。
本发明适用于所有顺势二羟基结构的单端孢霉烯族类毒素。
具体实施方式
具体的，在一个实施例中，本发明公开了一种单端孢霉烯族类毒素分子印迹聚合物，所述单端孢霉烯族类毒素为顺势二羟基结构，其特征在于，该分子印迹聚合物通过如下步骤制得：
(1)配置预聚液：以含双键的取代苯硼酸作为功能单体，以单端孢霉烯族类毒素作为模板分子，在碱性条件下，使得所述模板分子与所述功能单体混合均匀并形成共价复合物，再加入含双烯键的交联剂、致孔剂，紫外光引发剂或热引发剂，进一步混合均匀，得到的溶液作为预聚液；
(2)制得聚合物：针对所述预聚液，通过紫外光照射进行光引发或者通过热聚进行热引发，引发功能单体与交联剂之间、交联剂与交联剂之间的聚合反应从而形成聚合物；
(3)制得分子印迹聚合物：用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有与顺势二羟基可逆结合的苯硼酸位点以及与模板分子形状相互补的、空腔的分子印迹聚合物。
就该实施例来看，其利用受pH调控的取代硼酸与顺势二羟基间可逆的共价相互作用，以含双键的取代硼酸作为功能单体，在碱性条件下将毒素分子的模板(印迹分子)与功能单体形成复合物，加入交联剂、引发剂和致孔剂，通过紫外光照射(或热聚法)引发功能单体与交联剂间以及交联剂与交联剂间的共聚反应，使用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有可与顺势二羟基可逆结合的苯硼酸位点以及与模板分子形状相互补的空腔的分子印迹聚合物。
进一步的，在另一实施例中，考虑到具体的配比参数的多种适宜选择，优选的，所述模板分子与所述功能单体的质量比为1：10-1：1000，所述碱性条件为pH值大于等于7.5，所述交联剂与致孔剂的体积比为1：2-1：10，所述交联剂与所述功能单体的质量比为1：1-1：100。就上述比例的取值范围而言，其中：
当模板分子与功能单体质量比为1：10时，模板分子碱性条件下与功能单体反应，大部分的复合物与交联剂聚合得到分子印迹聚合物；随着功能单体质量的增加，几个硼酸配基(小分子)围绕识别一个顺势二羟基化合物(大分子)，聚合过程更稳定；功能单体质量的增加至1：1000时，功能单体饱和，制备的聚合物中多个硼酸配基围绕识别一个顺势二羟基化合物，聚合过程稳定，印迹聚合物识别模板分子时结合位点更多，识别灵敏性增加；
当交联剂与致孔剂体积比为1：2时，制备的聚合物致密，孔径小；随着致孔剂体积的增加，聚合物的孔径增大，大孔、中孔、小孔相互穿插；当交联剂与致孔剂体积比为1：10时，聚合物疏松多孔，大孔串中孔，易于粘稠介质的流动；
当交联剂与功能单体的质量比为1：1时，制备的聚合物中功能基团较少，聚合物结构相对简单、稳定；随着功能单体质量的增加，聚合物中功能基团增加，性能表征中出现了功能单体的独特性能；当交联剂与功能单体的质量比为1：100时，制备的聚合物中功能基团数量稳定，印迹聚合物中的分子印迹空腔数稳定。
进一步的，在另一实施例中，所述步骤(2)中，所述通过紫外光照射进行光引发具体包括如下步骤：将预聚液滴入某容器中，或涂覆在衬底表面、并在其上覆盖掩膜板，在紫外光下曝光5-120s，透光部分因紫外光照射诱发而聚合，而被遮挡的部分则不聚合。事实上，紫外光下5s，预聚液就已经聚合；随着曝光时间的增加，聚合物的链越长；到120s时，光引发剂反应完全，聚合物在紫外光下开始老化。
进一步的，在另一实施例中，所述步骤(2)中，所述通过热聚进行热引发具体包括如下步骤：将预聚液滴入某容器或涂覆在衬底表面，然后置于水浴中或加热台上，温度为50-120℃的条件下加热1-24小时。
进一步的，在另一实施例中，所述步骤(2)之后步骤(3)之前，还进一步包括如下步骤：用清洗溶剂来清洗除去所述聚合物中的未聚合部分，所述清洗溶剂为乙腈-水溶液或甲醇-水溶液。
进一步的，在另一实施例中，所述步骤(3)中的酸性溶液为pH值小于等于5的乙腈-水溶液或甲醇-水溶液。
进一步的，在另一实施例中，所述的单端孢霉烯族类毒素为呕吐毒素、F-2毒素或T-2毒素；
所述的取代苯硼酸是对乙烯基苯硼酸、间乙烯基苯硼酸或间丙烯酰胺基苯硼酸；
所述的交联剂可以是聚乙二醇双丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲叉双丙烯酰胺；
所述紫外光引发剂是安息香二甲醚、偶氮二异丁腈、1-羟基环己基苯基酮Irgacure184或安息香乙醚；
所述的热引发剂是偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、过氧化甲乙酮、过氧化环己酮或偶氮二异丁酸二甲酯；
所述的致孔剂是聚乙二醇、1，4丁二醇或十二醇。
进一步的，在另一实施例中，所述掩膜板为多孔、每个孔均含圆环状结构的掩膜板，从而使得预聚液在紫外光照射诱发而聚合后，通过该掩膜板得到多孔的、环状、聚合物，且聚合物沿着每个孔的外边缘，每个孔的中心则成为空白的区域，所述空白的区域有利于后期的检测。
进一步的，在另一实施例中，优选的，所述多孔选择96孔。
就分子印迹材料技术而言，最大的难点有如下两个：1、模板分子不易洗脱；2模板分子易于变形。通过上述实施例，不难发现，在不同的实施例中，本发明能够解决上述难点中的一个或两个：
对于模板分子不易洗脱的问题：1、本发明选用的功能单体是pH值调控的单体，碱性条件识别模板，酸性条件下放出模板，因此洗脱时将洗液调整为酸性就可以将模板分子从聚合物中洗脱；2、本发明配置的预聚液中含有大量的致孔剂，因此制备的聚合物含有大量的孔洞结构，酸性洗液洗脱下来的模板分子可以轻松的从孔洞中传质出来。
对于模板分子易于变形的问题：1、本发明采用光聚法制备聚合物，时间很短，可在2分钟内聚合完成，因此模板分子不会出现变形；2、毒素分子本身就比较耐热，因此选择合适的温度是不会破坏毒素结构的，所以本发明也可以使用热聚法制备印迹聚合物。另外本发明好设计了独特的掩膜板结构，以96孔环状掩膜板为例，其使用效果非常好，达到了在线识别，在线抓取的目的。光聚法制备毒素分子印迹阵列，可以得到各种形貌、结构的印迹阵列。本发明案例中使用的掩膜板，可以在96孔内制备圆环状聚合物，识别毒素分子后，反应终止液为强酸性溶液，将环内识别的毒素洗脱，直接在中心空白区检测，从而实现在线识别、在线检测。
此外，在另一个实施例中，公开了一种F-2毒素分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物通过如下具体光聚法(即光引发)制得：
(1)、准备预聚液，将0.005g对乙烯基苯硼酸和0.001g的安息香二甲醚溶解在200μl的聚乙二醇200(PEG200，平均分子量200)、100μl的聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGMA)，磷酸盐缓冲溶液调整pH值至8.5后加入10mg/ml的F-2毒素标准品50μl，涡旋2分钟(本实施例中F-2毒素与功能单体对乙烯基苯硼酸的质量比为1：10，交联剂PEGMA与致孔剂PEG200的体积比为1：2)；
(2)、在96孔遮掩板的孔内滴加50μl预聚液，贴附含有特定结构的掩膜板(圆环结构)，UV(365nm)曝光60s。去掉掩膜板，将聚合物浸泡于甲醇/水的混合溶液中(甲醇体积比为65％)振荡30min，去除未反应完全的预聚液和致孔剂，再将聚合物浸泡在甲醇/10M磷酸溶液(体积比3：7)中1小时，去除聚合物中的模板分子，最后用甲醇/水的混合溶液(甲醇体积比为65％)震荡10分钟3次，得到F-2毒素分子印迹聚合物。电镜结果表明所得的分子印迹聚合物为多孔结构。这多孔结构有利于印迹的毒素分子在印迹聚合物中的传质。
进一步的，在另一个实施例中，本发明公开了F-2毒素分子印迹聚合物检测F-2毒素标准品的应用实施例：
(1)、配置不同浓度的标准品，稀释溶液为35％的甲醇/水溶液；
(2)、取50ul不同浓度的F-2毒素标准品，加入到酶标板的微孔中，震荡10min；倒出待测液，加入70％的甲醇/水溶液，50ul，震荡10分钟，重复3次该步骤；加入酶标物50ul，震荡孵化30min；倒出酶标物，加入100ul工作洗液，震荡10分钟，重复3次该步骤；加入TMB显色液A和B各50ul，避光显色30min，加入反应终止液100ul，震荡10min，直接进行ELISA分析测试。
就该实施例而言，有如下优势：
(1)、引入圆环掩膜板，光聚后在96孔内得到多孔的环状分子印迹材料。该环状材料沿着96孔的外边缘，中心留下了空白的区域利于后期的ELISA检测；
(2)、该分子印迹材料在多孔的环内识别F-2毒素，与酶标物发生抗原-抗体专一反应，将酶标物也控制在多孔的环内，微米级的孔径有利于TMB显色液识别酶标物。反应终止液是酸性溶液，将显色后的大颗粒从多孔的环状聚合物中洗脱至中心空白的检测区，因此可以在线检测农产品中的F-2毒素。
进一步的，在另一个实施例中，本发明公开了一种呕吐毒素分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物通过如下热聚法制得：
1、准备预聚液，将0.005g间乙烯基苯硼酸和0.001g的偶氮二异庚腈溶解在1000μl的12醇、100μl的乙二醇二甲基丙烯酸酯，磷酸盐缓冲溶液调整pH值至7.5后加入10mg/ml的呕吐毒素标准品5μl，涡旋2分钟(本实施例中呕吐毒素与功能单体间乙烯基苯硼酸的质量比为1：100，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯与致孔剂12醇的体积比为1：10)；
2、在离心管内滴加100μl预聚液，密封离心管后放入80℃的水浴中12h，得到呕吐毒素分子印迹聚合物。在离心管内加入200ul甲醇/水的混合溶液(甲醇体积比为65％)振荡1h，去除预聚液中未反应完全的溶液和致孔剂，再将聚合物浸泡在甲醇/10M醋酸酸溶液(体积比2：8)中4小时，去除聚合物中的模板分子，最后用甲醇/水的混合溶液(甲醇体积比为65％)震荡30分钟3次，得到呕吐毒素分子印迹聚合物。同样的，也可以通过电镜结果来证实所得的分子印迹聚合物为多孔结构。这多孔结构有利于印迹的毒素分子在印迹聚合物中的传质。
进一步的，在另一个实施例中，本发明公开了呕吐毒素分子印迹聚合物检测呕吐毒素标准品的应用：
1、配置不同浓度的标准品，稀释溶液为35％的甲醇/水溶液。
2、取1ml不同浓度的呕吐毒素标准品，加入含有印迹聚合物的离心管内，震荡24h；吸取上层清液。ELISA试剂盒检测上层清液中DON的浓度，得到DON分子印迹材料对DON的吸附等温线。实验结果表明，每克DON分子印迹材料最多可以吸附234μgDON。
进一步的，在另一个实施例中，本发明公开了一种T-2毒素分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物通过如下热聚法制得：
1、准备预聚液，将0.005g间丙烯酰胺基苯硼酸和0.001g的过氧化甲乙酮溶解在400μ1的1，4丁二醇、100μl的甲叉双丙烯酰胺，磷酸盐缓冲溶液调整pH值至11后加入1mg/ml的T-2毒素标准品5μl，涡旋2分钟(本实施例中T-2毒素与功能单体间丙烯酰胺基苯硼酸的质量比为1：1000，交联剂甲叉双丙烯酰胺与致孔剂1，4丁二醇的体积比为1：4)；
2、在离心管内滴加50μl预聚液，密封离心管后放入95℃的水浴中1h，得到T-2毒素分子印迹聚合物。在离心管内加入200ul甲醇/水的混合溶液(甲醇体积比为65％)振荡1h，去除预聚液中未反应完全的溶液和致孔剂，再将聚合物浸泡在甲醇/10M醋酸酸溶液(体积比2：8)中4小时，去除聚合物中的模板分子，最后用甲醇/水的混合溶液(甲醇体积比为65％)震荡30分钟3次，得到T-2毒素分子印迹聚合物。同样的，通过电镜结果能够证实所得的分子印迹聚合物为多孔结构。这多孔结构有利于印迹的毒素分子在印迹聚合物中的传质。
进一步的，在另一个实施例中，本发明公开了T-2毒素分子印迹聚合物检测玉米淀粉中的T-2毒素的应用：
1、将5g玉米淀粉置于离心管内，加入25ml35％的甲醇/水溶液震荡20min，离心10min，4000r/min，取20μL上清液，加入780μL35％的甲醇，混匀，得到待检测的参比样品溶液；在待测参比样品溶液中加入T-2毒素的标准品，配置不同浓度的待测样品溶液；
2、取50ul不同浓度的T-2毒素待测液，加入含有印迹聚合物的离心管内，震荡4h；倒出待测液，加入70％的甲醇/水溶液，200ul，震荡1h，重复3次该步骤；加入酶标物50ul，震荡孵化1h；倒出酶标物，加入200ul工作洗液，震荡1h，重复3次该步骤；加入TMB显色液A和B各100ul，避光显色30min，加入反应终止液100ul，震荡1h，取上层清液进行ELISA分析测试。
以上所示，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种单端孢霉烯族类毒素分子印迹聚合物，所述单端孢霉烯族类毒素为顺式二羟基结构，其特征在于，该分子印迹聚合物通过如下步骤制得：
(1)配置预聚液：以含双键的取代苯硼酸作为功能单体，以单端孢霉烯族类毒素作为模板分子，在碱性条件下，使得所述模板分子与所述功能单体混合均匀并形成共价复合物，再加入含双烯键的交联剂、致孔剂，紫外光引发剂或热引发剂，进一步混合均匀，得到的溶液作为预聚液；
(2)制得聚合物：针对所述预聚液，通过紫外光照射进行光引发或者通过热聚进行热引发，引发功能单体与交联剂之间、交联剂与交联剂之间的聚合反应从而形成聚合物；
(3)制得分子印迹聚合物：用酸性溶液提取清除聚合物中的模板分子，得到含有与顺式二羟基可逆结合的苯硼酸位点以及与模板分子形状相互补的、空腔的分子印迹聚合物。
2.如权利要求1所述的分子印迹聚合物，其特征在于，所述步骤(1)中：所述模板分子与所述功能单体的质量比为1：10-1：1000，所述碱性条件为pH值大于等于7.5，所述交联剂与致孔剂的体积比为1：2-1：10，所述交联剂与所述功能单体的质量比为1：1-1：100。
3.如权利要求1所述的分子印迹聚合物，其特征在于，所述步骤(2)中，所述通过紫外光照射进行光引发具体包括如下步骤：将预聚液滴入某容器中，或涂覆在衬底表面、并在其上覆盖掩膜板，在紫外光下曝光5-120s，透光部分因紫外光照射诱发而聚合，而被遮挡的部分则不聚合。
4.如权利要求1所述的分子印迹聚合物，其特征在于，所述步骤(2)中，所述通过热聚进行热引发具体包括如下步骤：将预聚液滴入某容器或涂覆在衬底表面，然后置于水浴中或加热台上，温度为50-120℃的条件下加热1-24小时。
5.如权利要求1所述的分子印迹聚合物，其特征在于，所述步骤(2)之后步骤(3)之前，还进一步包括如下步骤：用清洗溶剂来清洗除去所述聚合物中的未聚合部分，所述清洗溶剂为乙腈-水溶液或甲醇-水溶液。
6.如权利要求1所述的分子印迹聚合物，其特征在于：所述步骤(3)中的酸性溶液为pH值小于等于5的乙腈-水溶液或甲醇-水溶液。
7.如权利要求1所述的分子印迹聚合物，其特征在于：
所述的单端孢霉烯族类毒素为呕吐毒素、F-2毒素或T-2毒素；
所述的取代苯硼酸是对乙烯基苯硼酸、间乙烯基苯硼酸或间丙烯酰胺基苯硼酸；
所述的交联剂可以是聚乙二醇双丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲叉双丙烯酰胺；
所述紫外光引发剂是安息香二甲醚、偶氮二异丁腈、1-羟基环己基苯基酮Irgacure184或安息香乙醚；
所述的热引发剂是偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、过氧化甲乙酮、过氧化环己酮或偶氮二异丁酸二甲酯；
所述的致孔剂是聚乙二醇、1，4-丁二醇或十二醇。
8.如权利要求3所述的分子印迹聚合物，其特征在于：所述掩膜板为多孔、每个孔均含圆环状结构的掩膜板，从而使得预聚液在紫外光照射诱发而聚合后，通过该掩膜板得到多孔的、环状聚合物，且聚合物沿着每个孔的外边缘，每个孔的中心则成为空白的区域，所述空白的区域有利于后期的检测。
9.如权利要求8所述的分子印迹聚合物，其特征在于：所述多孔选择96孔。
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Also Published As
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