CN108717054A - 一种量子点标记抗体探针试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学检测领域，涉及检测草莓中苯噻菌酯残留量的可视化、快速检测方法，涉及农药残留检测，尤其涉及一种量子点标记抗体探针试纸条及其制备方法和应用。包括底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫以及吸收垫，所述硝酸纤维素膜位于底板上方，硝酸纤维素膜左侧的底板上依次设有样品垫和结合垫、右侧的底板上设有吸收垫；所述结合垫上分布有量子点标记抗体探针，硝酸纤维素膜上还分布有苯噻菌酯抗原和羊抗鼠抗体。本发明提供一种适用于定量检测苯噻菌酯在草莓中残留量的可视化、快速检测试纸条。

Description

一种量子点标记抗体探针试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学检测领域，涉及检测草莓中苯噻菌酯残留量的可视化、快速检测方法，涉及农药残留检测，尤其涉及一种量子点标记抗体探针试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
近五年来，杀菌剂在农药总用量的比重迅速增加，带来的潜在毒性风险不断增大，尤其针对生食水果中杀菌剂残留的现场快速检测新方法研究备受关注。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（strobilurins）是目前应用最广泛的杀菌剂品种之一，其代表性品种嘧菌酯2014年在我国销售额达到14 亿美元。苯噻菌酯（试验代号Y5247，benzothiostrobin）是华中师范大学研制的有我国自主知识产权的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂候选品种，化学名称是(E)-3-甲氧基-2[2-(5-甲氧基苯并噻唑-2-硫代亚甲基)苯基]丙烯酸甲酯。主要用于防治蔬菜和瓜果类白粉病、霜霉病、灰霉病、褐斑病、黑星病、玉米小斑病、水稻稻曲病、柑橘地腐病、油菜菌核病等。苯噻菌酯较进口的嘧菌酯具有更高的配体效率和相当的杀菌活性，但原药成本、亩用药成本均低于进口的嘧菌酯，具有较强的市场竞争力，也必将产生十分显著的经济与社会效益。苯噻菌酯合成及其控释组合已获得中国发明专利（ZL200810047642.1, CN101379967B，CN 107696048 A），已在中国、美国、欧洲等世界各地应用（Pub. no.:CN102302012 B, CN 101379967 A, CN 101268780 B, US 2010/0292285 A1,09741682.0, WO 2007/073637 A1,WO 2009/135407 A1）。据悉，江苏七洲绿色化工股份有限公司已购买苯噻菌酯的相关专利，近期将有新产品上市。该公司申请的中国专利中有关于苯噻菌酯和苯醚甲环唑的杀菌剂组合（CN 103548840 A），另外还有与三唑类杀菌剂（CN103503883 A）、氟环唑（CN 103828817 A）、百菌清（CN 104094941 A）、霜脲氰（CN104222122 A）、烯酰吗啉（CN 104222110 A）、环丙唑（CN 104351209 A）等组合的专利；其他单位也有一些包括苯噻菌酯的杀菌剂组合专利（CN 105340881, CN 105510543 A, CN105831132 A, CN 106172435, CN 106172429 A, CN 105961405 A, CN 106172430 A, CN106614627 A, CN 106665597 A, CN 106818778 A, CN 106900726 A, CN 106900727 A,CN 106973917 A, CN 107156140 A, CN 107156141 A, CN 107347896 A, CN 107212009A, CN 107136097 A, CN 107372537 A, CN 107484761 A, CN 107484762 A, CN107484764 A, CN 103027054 A, CN 106172435 A, CN 106172430 A）。截止目前，关于苯噻菌酯免疫检测方法的三个授权专利来自南京农业大学，苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途（CN 103613563 A），苯噻菌酯抗体特异性结合多肽及其用途（CN104987361 A），苯噻菌酯免疫复合体特异性结合多肽及其用途（CN 105153280 A）。另有毒性试验证明，苯噻菌酯对蜜蜂等有益生物及作物有良好的安全性，对环境较友好，但其大量使用之后的较长期的毒性风险依然是不明确的。有必要开发苯噻菌酯的现场快速定量检测新方法，以实现从源头对其残留的控制，防范于未然，也为该农药的快检质量标准体系的完善构建新的检测方法。所以，本专利采用来自南京农业大学开发的苯噻菌酯的抗体和抗原，构建基于CdSe/ZnS量子点的免疫荧光试纸条，用于水果中苯噻菌酯的快速可视化检测技术。
在国内膳食结构中，果蔬和谷物类占据主要地位，针对生产、保质周期短，消费量大的生食水果等农产品的农残管控，从源头治理、实现过程控制是一项有效举措。新的现场快速检测技术开发需求越来越旺盛，生食水果的生产、销售基地开展自查和适时检测的需求将逐年增长。目前，草莓已成我国的重要生食水果，而且是世界产量第二的小浆果，经济价值高，消费量越来越大，其农残超标问题广受关注。露地和保护地草莓的霜霉病、白粉病的防治主要采用包括嘧菌酯、苯噻菌酯在内的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。构建草莓中农残快检新方法关系着千家万户的“舌尖上的安全”。而基于免疫反应构建的试纸条具有特异性强、使用成本低、分析速度快等优点，能满足草莓的现场快速低成本分析的需求。综上所述，农残的超标问题不仅严重影响人民的身心健康，而且对农产品的国内、国际贸易产生巨大影响，影响我国农业的发展和农民增收，所以快速、高效、灵敏的现场检测农残的定量分析新方法的开发尤为重要。农残的检验检测关系到消费者健康、农产品国际贸易和我国农业的可持续发展，甚至影响社会稳定与民众对政府的信任。在一段时间内，除了新品种的育成和生物技术的引入等致使农产品产量、品质有所提高之外，科学合理地使用农药仍是农业可持续发展和保障消费者食品质量与数量的重要手段，所以农残检测标准体系的革新和新检测方法的开发需求将是持续递增的。
文献报道的果蔬等农产品的农残检测方法主要是仪器分析方法，如基于QuEchERS技术、固相萃取法（SPE）等前处理方法，然后采用高效液相色谱法、超高效液相色谱串联质谱法、气相色谱串联质谱法、电分析方法等对农残进行检验检测。现行有效的国家标准中，植物源农产品的农药残留检测方法也以包括气相色谱串联质谱法（GC-MS）和高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS）在内的仪器分析方法为主（GB 23200.33-2016、GB 23200.34-2016、GB 23200.35-2016、GB 23200.50-2016、GB 23200.72-2016、GB 23200.93-2016）。在实际应用中，农产品中所含农残种类众多，多残留检测成为仪器分析方法发展的重要方向[5]。仪器分析方法试验周期较长，需要专业人才，费用较高。构建特异性强、痕量农残的低成本、快速定量检测新方法，可弥补仪器分析方法的这些不足。
纳米材料的出现，尤其是荧光量子产率高、荧光稳定性好、耐光漂白的量子点的应用，为农残检测新技术的发展注入了新的物质基础。量子点（Quantum dots, QDs）是一种半径小于或接近激子玻尔半径的半导体纳米材料，一般由II-VI族或III-V族元素组成，是三维受限的零维纳米晶体。量子点相对于传统的有机荧光染料和荧光蛋白的优点有：1. 量子点的激发光谱宽，高于带隙能量的光都能激发，且发射光谱较窄，因此就可以用一种激发光同时激发不同发射波长的量子点，即所谓“一元激发多元发射”。为农药残留检测需要的多种农药同时检测提供可能；2. 可以通过调整量子点尺寸与组成，得到不同的荧光发射波长；3. 量子点的光稳定性远高于几乎所有的有机染料分子的光稳定性；4. 量子点生物相容性好，经过化学修饰可以进行特异性连结；5. 量子点荧光寿命长，生物样本的自发荧光的衰减时间为几纳秒，而量子点的荧光寿命长达几十纳秒（20-50 ns），所以可获得量子点的无背景干扰的荧光信号。但基于量子点的农残检测技术的发展方兴未艾。本发明拟提供一种能够检测苯噻菌酯的量子点标记抗体探针，和基于该探针的免疫层析试纸条。
现有文献报道显示，量子点标记抗体探针已越来越多地用于农残检测领域，已经成为农残检测新技术的热点课题之一。有文献报道以量子点共价偶联酶、抗体[12]、DNA 适配体、分子印迹聚合物等制备探针用于农残检测。X. Yan基于荧光内滤效应，通过包覆硅壳的量子点荧光的变化为指标，检测农残的报道。Y. Fan以ZnCdSe 和CdSe 两种量子点做探针，基于荧光信号的“开关”，测定多种农药的残留；Y. Dong基于碳量子点用于农残检测。
上述基于溶液状态的探针检测体系具有特异性强、灵敏度高的优势，一般溶液状态的探针只能用一次。所以有文献采用量子点标记乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的固体膜，用于检测苯噻菌酯在草莓中的残留量，构成膜的材料有硅树脂，聚二甲硅氧烷（PDMS）以及玻璃等。较早的报道多是基于量子点标记乙酰胆碱酯酶的探针，检测有机磷农药和氨基甲酸酯类农药总量，但是该类探针检测的只是两类药物的总量，不能对单一药物进行检测，适合现场半定量初筛。特异性检测一种农药的探针一般都是在溶液状态实现检测，开发固体基质上的便携、可视化现场检测新方法成为新的需求增长点。所以很有必要构建基于量子点免疫荧光探针对苯噻菌酯的可视化、定量的快速检测的试纸条，弥补现在量子点探针用于农残现场快速检测中的不足。
国内外对苯噻菌酯的残留测定方法已有高效液相色谱法和基于辣根过氧化物酶标记抗体构建了苯噻菌酯的ELISA检测方法，基于量子点标记抗体探针检测苯噻菌酯的免疫荧光分析方法暂未见报道。
本发明对上述苯噻菌酯在草莓中残留量检测的问题，提供一种适用于定量检测苯噻菌酯在草莓中残留量的可视化、快速检测试纸条。
发明内容
本发明提出一种量子点标记抗体探针试纸条及其制备方法和应用，解决了现有技术中苯噻菌酯在食品中残留量的常规检测方法为高效液相色谱法、ELISA法等，这些仪器分析方法虽然可靠，但需要专业的技术人员、检测成本高，不适合对生产保质期短、场地分散的常用水果的日常检测，不利于对水果农药残留源头监管和质量安全。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种量子点标记抗体探针试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫以及吸收垫，所述硝酸纤维素膜位于底板上方，硝酸纤维素膜左侧的底板上依次设有样品垫和结合垫、右侧的底板上设有吸收垫；所述结合垫上分布有量子点标记抗体探针，纤维素膜上还分布有苯噻菌酯抗原和羊抗鼠抗体（本发明所用抗体和抗原由南京农业大学研制）。基于竞争法原理实现检测，量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针既可与苯噻菌酯特异性结合，又可以和苯噻菌酯的抗原特异性结合，但是结合了苯噻菌酯的量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针不能再和抗原结合。试纸条上喷涂一定量抗原作为检测线（test line, T线），喷涂一定浓度和抗苯噻菌酯抗体种属匹配的二抗作为控制线（control line, C线）。加标样品中的苯噻菌酯添加到样品垫之后，流经结合垫时和量子点标记抗体探针特异性结合。随着样品中苯噻菌酯浓度的增大，未结合抗原的量子点标记抗体探针减少，与抗原结合的量子点标记抗体探针减少，条带变弱直至荧光信号消失。
所述底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫以及吸收垫的宽度为0.8 cm，样品垫与结合垫重叠0.2 cm，结合垫和吸收垫与硝酸纤维素膜分别重叠0.2 cm。
所述宽度2.5 cm的硝酸纤维素膜上依次设有检测线简称T线，共三条检测线，依次记为T3、T2、T1线，硝酸纤维素膜上还设有一条控制线简称C线，T3线与结合垫端的距离为0.6cm，T3线、T2线以及T1线之间的间隔为0.4 cm， T1线与C线之间的距离为0.5 cm。
所述T3、T2和T1线上设有苯噻菌酯抗原（由南京农业大学研制），苯噻菌酯抗原为苯噻菌酯-牛血清白蛋白复合物，T3、T2和T1线上苯噻菌酯抗原的浓度依次为0.11 mg/mL、0.42mg/mL、1.68 mg/mL。
所述C线上设有羊抗鼠抗体（购自Sigma），浓度为0.2 mg/mL。
一种量子点标记抗体探针试纸条的制备方法，步骤为：
（1）量子点标记苯噻菌酯抗体探针的制备：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）通过共价偶联法制备量子点标记苯噻菌酯抗体探针；
（2）样品垫的处理步骤：用含有2 % w/v牛血清白蛋白、2 %蔗糖、0.1 %叠氮化钠和2.5% w/v聚乙烯基吡咯烷酮的20 mM、 pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液浸泡玻璃纤维膜12 h，捞出沥干，37 ℃烘4 h，烘干后放4 ℃备用，即得样品垫和初级结合垫；
（3）结合垫的处理步骤：裁取0.8 cm宽步骤（2）得到的初级结合垫，向初级结合垫上，以5 - 10 μL/cm的速度喷涂0.1 - 0.8 μmol/L量子点标记苯噻菌酯抗体探针，自然晾干，即得结合垫；
（4）硝酸纤维素膜的处理步骤：裁取2.5 cm硝酸纤维素膜（nitrocellulose filtermembrane，简称NC膜），（型号：Millipore 12004），（G - 4，上海捷宁生物科技有限公司），在硝酸纤维素膜的近吸水垫端0.6 cm处，用划膜液点划0.2 mg/mL的羊抗鼠抗体作为C线，从C线向远离吸水垫端依次用苯噻菌酯抗原喷涂出T1、T2、和T3线，三者之间间隔0.4 cm，T1、T2、和T3线上苯噻菌酯抗原的浓度为1.68、0.42和0.11 mg/mL，喷涂之后自然晾干即得试纸条硝酸纤维素膜；
（5）吸收垫的处理步骤：裁取1.5-2 cm的吸水纸作为吸收垫；
（6）试纸条的组装：将步骤（4）得到的试纸条硝酸纤维素膜固定于底板居中的位置上，将结合垫一端压在硝酸纤维素膜上，重叠0.2 cm，另一端固定在底板上，并与底板平齐；将样品垫一端压在结合垫上，重叠0.2 cm，另一端固定于底板上，并与底板平齐；使吸收垫的一端与底板的另一端平齐，吸收垫的另一端压在硝酸纤维素膜上，重叠0.2 cm，完成试纸条的组装。
所述步骤（1）的操作步骤为：
1. 取200 μL pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液分散到浓度位2 μmol/L的表面羧基的CdSe/ZnS量子点（购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司），先加入50 μL用10 mM的MES缓冲溶液溶解的浓度为1.5 mM 的EDC，于110 rpm 37 ℃ 条件下活化15 min，然后加入50 μL浓度为1.5 mM的NHS，于110 rpm 37 ℃ 条件下活化30 min，然后用孔径为100 kDa滤膜的超滤管重复超滤两次，除去多余的EDC和NHS，得活化后的量子点；
2. 步骤1得到的活化后的量子点用10 mM的MES缓冲液分散，加入500 μL 用PBS分散的浓度为0.5 mg/mL的抗苯噻菌酯抗体（由南京农业大学研制），于110 rpm、 37 ℃条件下反应2 小时，得量子点标记抗苯噻菌酯抗体复合物；
3. 将步骤2得到的量子点标记抗苯噻菌酯抗体复合物于10000 rpm速度条件下离心10min，取上清液置于超滤管内，3500 rpm离心3 min，向超滤管内加入适量20 mM pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，3500 rpm离心3 min，重复加入适量20 mM pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，于3500 rpm离心3 min，即得量子点偶联抗体复合物；
4. 以20 mM pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液作为缓冲溶液，通过尺寸排阻色谱法对步骤3得到的量子点偶联抗体复合物进行纯化，分段收集得到量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针。
一种量子点标记抗体探针试纸条在检测苯噻菌酯残留含量中的应用，包括如下步骤：
a、准确称取去柄草莓样品20.00 g，置于100 mL离心管中，分别加入20 mL水、40 mL乙腈，于恒温超声波振荡20 min后，加入5 g氯化钠，盖上盖子涡旋3 min，于5000 rpm离心5min，取乙腈层上清液30 mL，置于加热板40 ℃蒸发至干，残留物待净化；
b、将步骤a得到的残留物用2 mL含有0.1%的Triton X-100的20 mM磷酸盐缓冲溶液，加5 mg的N-丙基乙二胺，涡旋2 min后4000 rpm离心5 min，取上清液即为试纸条检测用样品；
c、取步骤b得到的样品150 μL置于5 mL离心管，将试纸条的样品垫部分置于离心管底部，将离心管和试纸条一起放置于37 ℃培养箱孵育15 min；样品垫滴加样品溶液后，由于吸水垫的吸收作用，样品会在试纸条上进行层析流动，流经结合垫时，量子点标记苯噻菌酯抗体探针释放到液体中，与样品中的目标物结合，并由于层析作用在试纸条上继续流动；当量子点标记苯噻菌酯抗体探针流经T 线时，未与目标物结合的量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针，可与T 线抗原结合，在紫外灯下显色。而结合目标物的复合物不能与T线划涂的抗原再结合。目标物浓度越大，T线颜色越浅，当探针的所有结合位点被目标物占据后，便不能与T线上的抗原结合，T线不显色，此时对应的样品浓度称为消线浓度（cut-off value）（消线浓度一般指当基于竞争法的试纸条的检测线无信号时对应的被检测物浓度）；无论量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针是否与目标物结合，均可与C线上的羊抗鼠抗体结合显色，当C线不显色时视为检测结果无效。即样品中农药含量越高，T线荧光条带越浅，当达到消线浓度时，T线不会显色。但是无论样品垫中农药含量多少，C线都会出现荧光条带。本发明拟根据T线的荧光强度定量，构建苯噻菌酯残留量的现场快速、可视化、定量检测方法，用于苯噻菌酯在草莓中的残留含量检测。
d、将孵育后的试纸条取出并在凝胶成像仪中进行成像，根据苯噻菌酯浓度和相对强度的线性关系方程，利用外标法定量；在暗箱式紫外灯下拍照片记录检测结果与比色卡对比，三条检测线对应三个消线浓度，用于定量检测草莓中的苯噻菌酯含量。
所述步骤d中苯噻菌酯浓度和相对强度的线性关系方程式如下：在50 - 1200 μg/L范围内，对检测线T1：y = -0.000008 x + 0.159，r = 0.9752；对检测线T2：在50 - 600 μg/L范围内，y = -0.00014 x + 0.09151，r = 0.9642；对检测线T3：在25 - 350 μg/L浓度范围内，y = -0.00004 x + 0.02147，r = 0.9241，其中y为检测线的荧光强度和对应控制线的荧光强度的比值相对强度值。
将步骤b所得的样品用高效液相色谱串联质谱法进行验证。仪器条件如下：岛津UPLC-MS/MS 8050，色谱柱Agilent poroshell 120 SB-C18 柱 (3.0×75 mm, 2.7 μm)，柱温为25 ℃，流动相为乙腈-0.1%甲酸的水溶液（体积比为60 : 40），流速为0.5 mL/min，进样量为2 µL。质谱检测器选用电喷雾电离源（ESI）的负离子模式，选择离子扫描模式（SIM）（m/z ：402），驻留时间：100 ms，锥孔电压：30 kV，DL管温度：300℃。建立标准曲线，（用于验证试纸条检测结果，未检出显著性差异。
本发明的有益效果在于：
1. 本发明的目的是解决果蔬中苯噻菌酯残留的快速、可视化检测方法问题，提取液用量较少，后期净化较简单，降低了检测成本；只需要一台暗箱式紫外灯，即可实现苯噻菌酯的可视化、多浓度的定量检测，所需检测设备简单，检测成本低廉，易推广；不需要专门的技术人员，有较强的实用性。具有在基层监管和水果生产、销售单位及水果消费者中推广应用的价值。
2. 本发明以40 mL乙腈作为提取液，与已报道的甲醇作为提取液相比用量较少，后期净化较简单；与甲醇作为提取液相比，提取、盐析后，加热板蒸干，不需要旋蒸，能提高工作效率；检测所用的仪器普及率较高，方法易推广应用。方法的重现性、准确度、精密度及检出限均可满足苯噻菌酯在草莓中的残留分析要求。
3. 基于固态的试纸条易于处理，降低环境污染的几率。仅需15 min的孵育即可出结果，提高了检测的工作效率，有较强的实用性，具有很好的推广应用价值。
4. 该试纸条保存在密封、避光的室温环境，一年内仍然能实现对苯噻菌酯的多浓度检测，RSD% <10（n = 6），具有较好稳定性。
附图说明
图1为本发明制备的量子点标记抗体探针试纸条的结构示意图。
图2为CdSe/ZnS量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针的色谱纯化过程。
图3为试纸条检测草莓中苯噻菌酯的比色卡。
图4为试纸条检测草莓中苯噻菌酯的操作流程图。
图5为本发明实施例中苯噻菌酯检测试纸条的凝胶成像仪图片；其中A为用同一批次试纸条检测同一浓度草莓加标样品的检测重复性结果的图片（n=6），B为线性关系结果图片（三条检测线对应不同浓度范围的三条线性关系曲线），C为空白样品和未知浓度加标样品的检测结果图片。
图6为苯噻菌酯的加标浓度与各自对应检测线荧光强度和控制线荧光强度比值的线性关系。
图7为基于UPLC-MS/MS方法检测草莓中苯噻菌酯的线性关系图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的一种量子点标记抗体探针试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫以及吸收垫，所述硝酸纤维素膜位于底板上方，硝酸纤维素膜左侧的底板上依次设有样品垫和结合垫、右侧的底板上设有吸收垫；所述结合垫上分布有量子点标记抗体探针，纤维素膜上还分布有苯噻菌酯抗原和羊抗鼠抗体（本发明所用抗体和抗原由南京农业大学研制）。基于竞争法原理实现检测，量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针既可与苯噻菌酯特异性结合，又可以和苯噻菌酯的抗原特异性结合，但是结合了苯噻菌酯的量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针不能再和抗原结合。试纸条上喷涂一定量抗原作为检测线（test line, T线），喷涂一定浓度和抗苯噻菌酯抗体种属匹配的二抗作为控制线（control line, C线），加标样品中的苯噻菌酯添加到样品垫之后，流经结合垫时和量子点标记抗体探针特异性结合。随着样品中苯噻菌酯浓度的增大，未结合抗原的量子点标记抗体探针减少，与抗原结合的量子点标记抗体探针减少，条带变弱直至荧光信号消失。
所述底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫以及吸收垫的宽度为0.8 cm，样品垫与结合垫重叠0.2 cm，结合垫和吸收垫与硝酸纤维素膜分别重叠0.2 cm。
所述宽度2.5 cm的硝酸纤维素膜上依次设有检测线简称T线，共三条检测线，依次记为T3、T2、T1线，硝酸纤维素膜上还设有一条控制线简称C线，T3线与结合垫端的距离为0.6cm，T3线、T2线以及T1线之间的间隔为0.4 cm， T1线与C线之间的距离为0.5 cm。
所述T3、T2和T1线上设有苯噻菌酯抗原（由南京农业大学研制），苯噻菌酯抗原为苯噻菌酯-牛血清白蛋白复合物，T3、T2和T1线上苯噻菌酯抗原的浓度依次为0.11 mg/mL、0.42mg/mL、1.68 mg/mL。
所述C线上设有羊抗鼠抗体（由南京农业大学研制），浓度为0.2 mg/mL。
本实施例的一种量子点标记抗体探针试纸条的制备方法，步骤为：
（1）量子点标记苯噻菌酯抗体探针的制备，操作步骤为：
1. 取200 μL pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液分散到浓度位2 μmol/L的表面羧基的CdSe/ZnS量子点（购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司），先加入50 μL用10 mM的MES缓冲溶液溶解的浓度为1.5 mM 的EDC，于110 rpm 37 ℃ 条件下活化15 min，然后加入50 μL浓度为1.5 mM的NHS，于110 rpm 37 ℃ 条件下活化30 min，然后用孔径为100 kDa滤膜的超滤管重复超滤两次，除去多余的EDC和NHS，得活化后的量子点；
2. 步骤1得到的活化后的量子点用10 mM的MES缓冲液分散，加入500 μL 用PBS分散的浓度为0.5 mg/mL的抗苯噻菌酯抗体（由南京农业大学研制），于110 rpm、 37 ℃条件下反应2 小时，得混合液；
3. 将步骤2得到的混合液于10000 rpm速度条件下离心10 min，取上清液置于超滤管内，3500 rpm离心3 min，向超滤管内加入适量20 mM pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，3500 rpm离心3min，重复加入适量20 mM pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，于3500 rpm离心3 min，即得量子点偶联抗体复合物；
4. 以20 mM pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液作为缓冲溶液，通过尺寸排阻色谱法对步骤3得到的量子点偶联抗体复合物进行纯化，分段收集得到量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针，CdSe/ZnS量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针的色谱纯化过程如图2所示。
（2）样品垫的处理步骤：用含有2 % w/v牛血清白蛋白、2 %蔗糖、0.1 %叠氮化钠和2.5 % w/v聚乙烯基吡咯烷酮的20 mM pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液浸泡玻璃纤维膜12 h，捞出沥干，37 ℃烘4 h，烘干后放4 ℃备用，即得样品垫和初级结合垫；
（3）结合垫的处理步骤：裁取0.8 cm宽步骤（2）得到的初级结合垫，向初级结合垫上，以5-10 μL/cm的速度喷涂0.1-0.8 μmol/L量子点标记苯噻菌酯抗体探针，自然晾干，即得结合垫；
（4）硝酸纤维素膜的处理步骤：裁取2.5 cm硝酸纤维素膜（nitrocellulose filtermembrane，简称NC膜），（型号：Millipore 12004），（G-4，上海捷宁生物科技有限公司），在硝酸纤维素膜的近吸水垫端0.6 cm处，用划膜液点划0.2 mg/mL的羊抗鼠抗体作为C线，从C线向远离吸水垫端依次用苯噻菌酯抗原喷涂出T1、T2、和T3线，三者之间间隔0.4 cm，T1、T2、和T3线上苯噻菌酯抗原的浓度为1.68、0.42和0.11 mg/mL，喷涂之后自然晾干即得试纸条硝酸纤维素膜；
（5）吸收垫的处理步骤：裁取1.5-2 cm的吸水纸作为吸收垫；
（6）试纸条的组装：将步骤（4）得到的试纸条硝酸纤维素膜固定于底板居中的位置上，将结合垫一端压在硝酸纤维素膜上，重叠0.2 cm，另一端固定在底板上，并与底板平齐；将样品垫一端压在结合垫上，重叠0.2 cm，另一端固定于底板上，并与底板平齐；使吸收垫的一端与底板的另一端平齐，吸收垫的另一端压在硝酸纤维素膜上，重叠0.2 cm，完成试纸条的组装。
标准卡及标准曲线的确定，标准比色卡构建步骤：
1. 取按上述步骤制备的试纸条若干，分别置于装有不同浓度苯噻菌酯的在草莓中的加标样品处理液150 μL的5 mL离心管，将试纸条的样品垫部分置于离心管底部，将离心管和试纸条一起放置于37 ℃培养箱孵育15 min；
2. 试纸条孵育结束后晾干，用凝胶成像仪成像，以检测线的荧光强度定量，确定三条检测线各自的线性范围和消线浓度。
3. 根据凝胶成像仪的结果，用三条检测线对应的苯噻菌酯消线浓度用试纸条进行与步骤2相同的检测过程，在暗箱式紫外灯下用照相机拍照记录结果，作为标准比色卡使用，通过肉眼观察比色，检定待检测样品的浓度分布量。如图3，T3的半数抑制浓度（IC50，即检测线T3荧光相对各自控制线的比值变成空白样品的相对应光强度的50%时对应的苯噻菌酯的浓度）肉眼观察的T3线浓度有变化的最低浓度做为检出限，肉眼可见的检出限为25 μg/L，T3、T2和T1对应的消线浓度依次为150 μg/L、600 μg/L和1200 μg/L。
应用例
a、准确称取去柄草莓样品20.00 g（精确至0.01 g），置于100 mL离心管中，分别加入20mL水、40 mL乙腈，于恒温超声波振荡20 min后，加入5 g氯化钠，盖上盖子涡旋3 min，于5000 rpm离心5 min，取乙腈层上清液30 mL，置于加热板40 ℃蒸发至干，残留物待净化；
b、将步骤a得到的残留物用2 mL含有0.1%的Triton X-100的20 mM磷酸盐缓冲溶液，加5 mg的N-丙基乙二胺，涡旋2 min后4000 rpm离心5 min，取上清液即为试纸条检测用样品；
c、取步骤b得到的样品150 μL置于5 mL离心管，将试纸条的样品垫部分置于离心管底部，将离心管和试纸条一起放置于37 ℃培养箱孵育15 min；样品垫滴加样品溶液后，由于吸水垫的吸收作用，样品会在试纸条上进行层析流动，流经结合垫时，量子点标记苯噻菌酯抗体探针释放到液体中，与样品中的目标物结合，并由于层析作用在试纸条上继续流动；当量子点标记苯噻菌酯抗体探针流经T线时，未与目标物结合的量子点标记苯噻菌酯抗体探针，可与T线抗原结合，在紫外灯下显色。而结合目标物的复合物不能与T线划涂的抗原再结合。目标物浓度越大，T线颜色越浅，当探针的所有结合位点被目标物占据后，便不能与T线上的抗原结合，T线不显色，此时对应的样品浓度称为消线浓度（cut-off value）；无论量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针是否与目标物结合，均可与C线上的羊抗鼠抗体结合显色，当C线不显色时视为检测结果无效。即样品中农药含量越高，T线荧光条带越浅，当达到消线浓度时，T线不会显色。但是无论样品垫中农药含量多少，C线都会出现荧光条带。本发明拟根据T线的荧光强度定量，构建苯噻菌酯残留量的现场快速、可视化、定量检测方法，用于苯噻菌酯在草莓中的残留含量检测，具体检测操作流程如图4所示。
分别在已制备好的草莓空白对照样品和添加不同浓度的苯噻菌酯标样样品，摇匀，放置2 h后，依样品提取净化方法进行处理。不同浓度的苯噻菌酯对应的线形关系方程式如下：在50 - 1200 μg/L范围内，对检测线T1：y = -0.000008 x + 0.159，r = 0.9752；对检测线T2：在50 - 600 μg/L范围内，y = -0.00014 x + 0.09151，r = 0.9642；对检测线T3：在 25-350 μg/L浓度范围内，y = -0.00004 x + 0.02147，r = 0.9241。对浓度25 μg/L的样品，检测线1，2，和3相对强度的RSD%依次为8.3，8.2，8.4（n = 6）（图5A）。检测线1，2，和3对应的半数抑制浓度依次为：350 μg/L，50 μg/L，25 μg/L。检测线1，2，和3对应消线浓度依次分别为1200，600，和150 μg/L，（图5B）。实际样品测定结果与超高效液相色谱串联质谱法无显著性差异（图5C）。测得本方法的添加回收率如下：当添加水平为6、30、120 mg/kg时，测得苯噻菌酯在草莓中的平均回收率为77 - 103%，相对标准偏差为7.4 - 8.9 %；符合残留分析要求。
取一定量的苯噻菌酯标准品，用乙腈溶解定容，并稀释成所需浓度的标准溶液进行测定，工作曲线浓度：25, 50, 150, 350, 550, 600, 800, 950, 1200, 和1500 μg/L，在上述UPLC-MS/MS液相色谱条件下进行测定结果，以溶液浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y。线性方程为y = 1899970x+872446，线性相关系数r = 0.9995，见图7。最小检出量为0.2ng，最低检测浓度均为0.1 mg/kg，相对保留时间约为3.7 min。用于验证试纸条检测结果，苯噻菌酯的加标浓度与各自对应检测线荧光强度和控制线荧光强度比值的线性关系如图6所示。加标样品用两种方法测结果如表1所示。
表 1 加标样品用两种方法测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种量子点标记抗体探针试纸条，其特征在于：包括底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫以及吸收垫，所述硝酸纤维素膜位于底板上方，硝酸纤维素膜左侧的底板上依次设有样品垫和结合垫、右侧的底板上设有吸收垫；所述结合垫上分布有量子点标记抗体探针，硝酸纤维素膜上还分布有苯噻菌酯抗原和羊抗鼠抗体。
2.如权利要求1所述的一种量子点标记抗体探针试纸条，其特征在于：所述底板为宽6cm的荧光定量用底板，硝酸纤维素膜宽2.5 cm，样品垫和结合垫宽0.7 - 1.2 cm，吸收垫的宽度为1.5 - 2 cm，样品垫与结合垫重叠0.2 cm，结合垫硝酸纤维素膜分别重叠0.2 cm，吸收垫覆盖硝酸纤维素膜0.2 cm。
3.如权利要求2所述的一种量子点标记抗体探针试纸条，其特征在于：所述宽度2.5 cm的硝酸纤维素膜上依次设有检测线简称T线，共三条检测线，依次记为T3、T2、T1线，硝酸纤维素膜上还设有一条控制线简称C线，T3线与结合垫端的距离为0.6 cm，T3线、T2线以及T1线之间的间隔为0.4 cm， T1线与C线之间的距离为0.5 cm。
4.如权利要求3所述的一种量子点标记抗体探针试纸条，其特征在于：所述T3、T2和T1线上设有苯噻菌酯抗原，苯噻菌酯抗原为苯噻菌酯-牛血清白蛋白复合物，T3、T2和T1线上苯噻菌酯抗原的浓度依次为0.11 mg/mL、0.42 mg/mL、1.68 mg/mL。
5.如权利要求3所述的一种量子点标记抗体探针试纸条，其特征在于：所述C线上设有羊抗鼠抗体，浓度为0.2 mg/mL。
6.如权利要求1-5任一项所述的一种量子点标记抗体探针试纸条的制备方法，其特征在于，步骤为：
（1）量子点标记苯噻菌酯抗体探针的制备：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺通过共价偶联法制备量子点标记苯噻菌酯抗体探针；
（2）样品垫的处理步骤：用含有2 % w/v牛血清白蛋白、2 %蔗糖、0.1 %叠氮化钠和2.5% w/v聚乙烯基吡咯烷酮的20 mM pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液浸泡玻璃纤维膜12 h，捞出沥干，37 ℃烘4 h，烘干后放4 ℃备用，即得样品垫和初级结合垫；
（3）结合垫的处理步骤：裁取0.8 cm宽步骤（2）得到的初级结合垫，向初级结合垫上，以5-10 μL/cm的速度喷涂0.1-0.8 μmol/L量子点标记苯噻菌酯抗体探针，自然晾干，即得结合垫；
（4）硝酸纤维素膜的处理步骤：裁取2.5 cm硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜的近吸水垫端0.6 cm处，用划膜液点划0.2 mg/mL的羊抗鼠抗体作为C线，从C线向远离吸水垫端依次用苯噻菌酯抗原喷涂出T1、T2、和T3线，三者之间间隔0.4 cm，T1、T2、和T3线上苯噻菌酯抗原的浓度为1.68、0.42和0.11 mg/mL，喷涂之后自然晾干即得试纸条硝酸纤维素膜；
（5）吸收垫的处理步骤：裁取1.5 - 2 cm的吸水纸作为吸收垫；
（6）试纸条的组装：将步骤（4）得到的试纸条硝酸纤维素膜固定于底板居中的位置上，将结合垫一端压在试纸条硝酸纤维素膜上，重叠0.2 cm，另一端固定在底板上，并与底板平齐；将样品垫一端压在结合垫上，重叠0.2 cm，另一端固定于底板上，并与底板平齐；使吸收垫的一端与底板的另一端平齐，吸收垫的另一端压在试纸条硝酸纤维素膜上，重叠0.2 cm，完成试纸条的组装。
7.如权利要求6所述的一种量子点标记抗体探针试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的操作步骤为：
1）. 取200 μL、 pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液分散到浓度为2 μmol/L的表面羧基的CdSe/ZnS量子点，先加入50 μL用10 mM的MES缓冲溶液溶解的浓度为1.5 mM 的EDC，于110 rpm、37 ℃ 条件下反应15 min，然后加入50 μL浓度为1.5 mM的NHS，于110 rpm 、37 ℃ 条件下反应30 min，然后用孔径为100 kDa滤膜的超滤管重复超滤两次，除去多余的EDC和NHS，得活化后的量子点；
2）. 步骤1得到的活化后的量子点用10 mM的MES缓冲液分散，加入500 μL 用PBS分散的浓度为0.5 mg/mL的抗苯噻菌酯抗体，于110 rpm、 37 ℃条件下反应2 小时，得量子点标记抗苯噻菌酯抗体复合物；
3）. 将步骤2）得到的量子点标记抗苯噻菌酯抗体复合物于10000 rpm速度条件下离心10 min，取上清液置于超滤管内，3500 rpm离心3 min，向超滤管内加入适量20 mM、 pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，3500 rpm离心3 min，重复加入适量20 mM、 pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，于3500 rpm离心3 min，即得量子点偶联抗体复合物；
4）. 以20 mM、 pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液作为缓冲溶液，通过尺寸排阻色谱法对步骤3）得到的量子点偶联抗体复合物进行纯化，分段收集得到量子点标记抗苯噻菌酯抗体探针。
8.一种量子点标记抗体探针试纸条在检测苯噻菌酯残留含量中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
a、准确称取去柄草莓样品20.00 g，置于100 mL离心管中，分别加入20 mL超纯水、40mL乙腈，于恒温超声波振荡20 min后，加入5 g氯化钠，盖上盖子涡旋3 min，于5000 rpm离心5 min，取乙腈层上清液30 mL，置于加热板40 ℃蒸发至干，残留物待净化；
b、将步骤a得到的残留物用2 mL含有0.1%的Triton X-100的20 mM磷酸盐缓冲溶液，加5 mg 的N-丙基乙二胺，涡旋2 min后4000 rpm离心5 min，取上清液即为试纸条检测用样品；
c、取步骤b得到的试纸条检测用样品150 μL置于5 mL离心管，将试纸条的样品垫部分置于离心管底部，将离心管和试纸条一起放置于37 ℃培养箱孵育15 min；
d、将孵育后的试纸条取出在凝胶成像仪中成像，根据苯噻菌酯浓度和相对强度的线性关系方程，利用外标法定量，在暗箱式紫外灯下拍照片记录检测结果与比色卡比对，三条检测线对应三个消线浓度，定量检测草莓中的苯噻菌酯含量。
9.如权利要求8所述的量子点标记抗体探针试纸条在检测苯噻菌酯残留含量中的应用，其特征在于：所述步骤d中苯噻菌酯浓度和相对强度的线性关系方程式如下：在50 -1200 μg/L范围内，对检测线T1：y = -0.000008 x + 0.159，r = 0.9752；对检测线T2：在50- 600 μg/L范围内，y = -0.00014 x + 0.09151，r = 0.9642；对检测线T3：在25-350 μg/L浓度范围内，y = -0.00004 x + 0.02147，r = 0.9241，其中y为检测线的荧光强度和对应控制线的荧光强度的比值相对强度值。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109900668A (zh) * 2019-03-15 2019-06-18 浙江工业大学 一种基于含上转换荧光纳米材料的检测试纸条在检测酒中酒精度的方法
CN110018145A (zh) * 2019-04-23 2019-07-16 吉林大学 一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法
CN110646603A (zh) * 2019-09-30 2020-01-03 云南省烟草农业科学研究院 一种烯酰吗啉胶体金试剂盒及其应用
CN110938116A (zh) * 2019-06-18 2020-03-31 南京农业大学 一种多价苯噻菌酯模拟表位多肽及其应用
CN111770955A (zh) * 2018-11-01 2020-10-13 韩国浦项科技大学校企公司 包含非共价连接的有机纳米结构分子的硝酸纤维素膜
CN113063938A (zh) * 2021-03-13 2021-07-02 河南省农业科学院 一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1811449A (zh) * 2006-02-23 2006-08-02 上海交通大学 量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法
US7875875B2 (en) * 2006-03-07 2011-01-25 Fujitsu Limited Semiconductor device and manufacturing method thereof
CN103048460A (zh) * 2012-12-15 2013-04-17 武汉珈源生物医学工程有限公司 一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法
CN103364562A (zh) * 2013-08-01 2013-10-23 青岛宝依特生物制药有限公司 磺胺类药物残留检测试纸条及使用方法
WO2015021991A1 (en) * 2013-08-16 2015-02-19 Cheminova A/S Combination of 2-methylbiphenyl-3-ylmethyl (z)-(1r)-cis-3-(2-chloro-3,3,3-trifluoroprop-1-enyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate with at least one insecticide, acaricide, nematicide and/or fungicide.
CN105785009A (zh) * 2014-12-23 2016-07-20 广州万孚生物技术股份有限公司 一种定量检测试纸条及其检测用标准曲线制定方法、检测方法和应用
KR20160103366A (ko) * 2015-02-24 2016-09-01 엘지전자 주식회사 InP계 양자점 및 그 제조방법
CN106198981A (zh) * 2016-06-30 2016-12-07 天津大学 一种基于量子点的ca199免疫层析试纸条的制备方法
CN106405112A (zh) * 2016-09-10 2017-02-15 天津大学 基于量子点的ca15‑3免疫层析试纸条的制备方法
CN106442977A (zh) * 2016-09-10 2017-02-22 天津大学 基于量子点的ca125免疫层析试纸条的制备方法
CN206057339U (zh) * 2016-05-18 2017-03-29 深圳市正海生物科技有限公司 免疫层析试纸条及便携式检测仪
CN106970217A (zh) * 2017-03-22 2017-07-21 江苏美正生物科技有限公司 一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法
CN107907679A (zh) * 2017-11-06 2018-04-13 南京诺唯赞医疗科技有限公司 一种免疫层析试纸条及其制作方法与应用
WO2020053365A2 (en) * 2018-09-13 2020-03-19 Syngenta Participations Ag Pesticidally active azole-amide compounds

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1811449A (zh) * 2006-02-23 2006-08-02 上海交通大学 量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法
US7875875B2 (en) * 2006-03-07 2011-01-25 Fujitsu Limited Semiconductor device and manufacturing method thereof
CN103048460A (zh) * 2012-12-15 2013-04-17 武汉珈源生物医学工程有限公司 一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法
CN103364562A (zh) * 2013-08-01 2013-10-23 青岛宝依特生物制药有限公司 磺胺类药物残留检测试纸条及使用方法
WO2015021991A1 (en) * 2013-08-16 2015-02-19 Cheminova A/S Combination of 2-methylbiphenyl-3-ylmethyl (z)-(1r)-cis-3-(2-chloro-3,3,3-trifluoroprop-1-enyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate with at least one insecticide, acaricide, nematicide and/or fungicide.
CN105785009A (zh) * 2014-12-23 2016-07-20 广州万孚生物技术股份有限公司 一种定量检测试纸条及其检测用标准曲线制定方法、检测方法和应用
KR20160103366A (ko) * 2015-02-24 2016-09-01 엘지전자 주식회사 InP계 양자점 및 그 제조방법
CN206057339U (zh) * 2016-05-18 2017-03-29 深圳市正海生物科技有限公司 免疫层析试纸条及便携式检测仪
CN106198981A (zh) * 2016-06-30 2016-12-07 天津大学 一种基于量子点的ca199免疫层析试纸条的制备方法
CN106405112A (zh) * 2016-09-10 2017-02-15 天津大学 基于量子点的ca15‑3免疫层析试纸条的制备方法
CN106442977A (zh) * 2016-09-10 2017-02-22 天津大学 基于量子点的ca125免疫层析试纸条的制备方法
CN106970217A (zh) * 2017-03-22 2017-07-21 江苏美正生物科技有限公司 一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法
CN107907679A (zh) * 2017-11-06 2018-04-13 南京诺唯赞医疗科技有限公司 一种免疫层析试纸条及其制作方法与应用
WO2020053365A2 (en) * 2018-09-13 2020-03-19 Syngenta Participations Ag Pesticidally active azole-amide compounds

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHUANGJIE WANG.ET: "Quantum-Dot-Based Lateral Flow Immunoassay for Detection of Neonicotinoid Residues in Tea Leaves", 《AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
司芳芳等: "纳米标记免疫层析法在农药残留检测中的应用研究进展", 《农药学学报》 *
袁玉龙: "苯噻菌酯残留免疫分析方法研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111770955A (zh) * 2018-11-01 2020-10-13 韩国浦项科技大学校企公司 包含非共价连接的有机纳米结构分子的硝酸纤维素膜
CN111770955B (zh) * 2018-11-01 2022-12-23 韩国浦项科技大学校企公司 包含非共价连接的有机纳米结构分子的硝酸纤维素膜
CN109900668A (zh) * 2019-03-15 2019-06-18 浙江工业大学 一种基于含上转换荧光纳米材料的检测试纸条在检测酒中酒精度的方法
CN110018145A (zh) * 2019-04-23 2019-07-16 吉林大学 一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法
CN110018145B (zh) * 2019-04-23 2022-01-25 吉林大学 一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法
CN110938116A (zh) * 2019-06-18 2020-03-31 南京农业大学 一种多价苯噻菌酯模拟表位多肽及其应用
CN110646603A (zh) * 2019-09-30 2020-01-03 云南省烟草农业科学研究院 一种烯酰吗啉胶体金试剂盒及其应用
CN110646603B (zh) * 2019-09-30 2022-11-15 云南省烟草农业科学研究院 一种烯酰吗啉胶体金试剂盒及其应用
CN113063938A (zh) * 2021-03-13 2021-07-02 河南省农业科学院 一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法
CN113063938B (zh) * 2021-03-13 2023-09-12 河南省农业科学院 一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法

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