CN106970217A - 一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，将有机磷类农药与乙酰胆碱酯酶结合的原理与免疫层析技术相结合，并制备抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，并且该抗体结合电鳗乙酰胆碱酯酶的位点与有机磷结合电鳗乙酰胆碱酯酶的位点相同，以单克隆抗体固定检测线，乙酰胆碱酯酶修饰指示剂，制备定量检测有机磷农药的免疫层析方法，实现有机磷类农药的多残留检测，并根据检测线和质控线的信号强度实现有机磷类农药的定量检测。本方法避免了有机磷农药指示剂的标记和蛋白偶联物的化学制备，简化了检测程序，降低了有机磷农药标准品的使用对人体健康的危害和对环境的严重污染，本发明检测灵敏度高，可以实现准确、快速、现场高通量的检测需求。

Description

一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法

技术领域

本发明属于农药残留检测技术领域，具体涉及一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法。

背景技术

在农业生产过程中，农药的使用起到非常重要的作用，农药可以有效的防治病虫害，然而在提高农副产品产量的同时，也造成了严重的食品和环境污染问题，随雨水进入土壤的农药最后都会流入江河湖海中，不仅破坏了环境，也破坏了人类的饮用水资源，而且农残会积累在水产品中，人类长期食用受农药污染的水产品会造成农药中毒，其中尤以有机磷农药为甚。

有机磷农药是指一类含有三个磷脂键的有机酯类化合物，大多呈油状或结晶状，除少数有机磷农药能溶于水外，一般不溶于水，易溶于苯、丙酮等有机溶剂，有机磷农药常用于防治植物的病虫害，具有种类多、药效高、见效快、使用方便等优点。除了少数的有机磷农药毒性较小以外，一般的农药都具有较大的毒性，很多品种对人畜的急性毒性很强，因此有机磷农药的快速、灵敏、精确、高通量的检测方法非常必要。

传统的有机磷农药的检测方法主要是基于仪器的检测方法，主要包括气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS）、薄层色谱法（TLC）、毛细管电泳法（CE）等方法，然而这一类方法所需仪器价格昂贵，样品前处理复杂耗时，并且需要专业的操作人员进行操作，因此限制了此类方法的普遍使用，同时难以实现现场高通量的检测需求。基于抗原抗体的免疫检测方法主要是利用抗体对抗原的特异性识别与结合，具有灵敏度高、特异性好等特点，并且免疫层析法还能实现快速、现场高通量检测。然而这类方法需要依赖高灵敏高特异性的抗体，而且一种抗体只能单一识别一种抗原或一类有共同抗原决定簇的抗原。而有机磷农药的种类繁多，要想实现农药的多残留检测只能制备针对单一农药的抗体，大大增加了检测成本。

从20世纪80年代起，基于有机磷农药抑制胆碱酯酶活性原理而建立的“酶抑制法”开始被广泛应用于农产品中有机磷类农药的快速筛查，由于其简便快速的特性而迅速得到广泛的应用。将有机磷农药和胆碱酯酶结合的原理与免疫层析试纸条检测方法相结合，可以实现有机磷类农药的多残留检测。

中国专利201610215012.5和201610054574.6描述了利用胆碱酯酶与有机磷农药结合的原理检测有机磷农药的免疫层析方法。专利201610054574.6中检测线上包被有机磷类农药蛋白偶联物，这种方法需要有机磷类农药蛋白偶联物的合成；专利201610054574.6中将有机磷类农药蛋白偶联物或有机磷农药与指示剂偶联，也需要有机磷类农药蛋白偶联物的合成操作，同时还需要有机磷类农药蛋白偶联物或有机磷农药与指示剂的标记步骤，因此这两篇专利均使用了化学合成手段，然而化学合成反应步骤繁琐、副产物多、分离提纯复杂且得率低，并且合成过程中需要使用有机磷农药标准品，有机磷农药标准品毒性较强，极易危害人体健康，同时对环境也会造成严重的污染。

发明内容

要解决的技术问题：传统的基于仪器的有机磷类农药检测方法所需仪器价格昂贵，并且需要专业的操作人员进行复杂的样品前处理过程，限制了此类方法的普遍应用。基于抗原抗体的免疫学检测方法只能实现单一目标物的检测，而不能同时实现有机磷类农药的多残留检测。现有技术中公开的基于乙酰胆碱酯酶和有机磷农药识别的检测方法，需要化学合成反应进行有机磷类农药蛋白偶联物的合成和有机磷类农药与指示剂的标记，然而化学合成反应步骤繁琐、副产物多、分离提纯复杂且得率低，并且有机磷农药的使用会提高对人体健康的危害和对环境的严重污染。

技术方案：本发明公开了一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，包括如下步骤：

步骤1）以电鳗乙酰胆碱酯酶作为免疫原免疫小鼠，制备抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，并且该单克隆抗体结合电鳗乙酰胆碱酯酶的位点与有机磷类农药结合电鳗乙酰胆碱酯酶的位点相同。

步骤2）用化学交联法或物理吸附法将电鳗乙酰胆碱酯酶和质控分子分别偶联到指示剂表面，构成电鳗乙酰胆碱酯酶标记的指示剂和质控分子标记的指示剂，并将两者混合得到标记液。

步骤3）以底板、样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和外壳构建成免疫层析试纸条，其中结合垫上固定有步骤 2）制备的标记液，层析膜上设有检测线（T线）和质控线（C线），检测线上固定有步骤1）制备的抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，质控线上固定有能与所述的质控分子特异性结合的生物分子，所述层析膜、底板和外壳均没有荧光特性。

步骤4）将检测液滴加于试纸条的样品垫处，进行免疫层析，当检测液流经检测线和质控线后，检测线和质控线的位置将会出现荧指示信号，根据检测线和质控线的信号强度，实现目标物的定量检测。

本发明所述的定量检测有机磷类农药的免疫层析方法中所述的指示剂为荧光染料或纳米颗粒。

本发明所述的定量检测有机磷类农药的免疫层析方法中所述的纳米颗粒为胶体金、量子点、磁纳米颗粒、时间分辨荧光微球、彩色乳胶微球、荧光乳胶微球或上转换荧光纳米颗粒的一种。

本发明所述的定量检测有机磷类农药的免疫层析方法中所述的胶体金通过物理吸附法与电鳗乙酰胆碱酯酶和质控分子偶联。

本发明所述的定量检测有机磷类农药的免疫层析方法中所述的量子点、磁纳米颗粒、时间分辨荧光微球、彩色乳胶微球、荧光乳胶微球或上转换荧光纳米颗粒表面修饰有羧基或者氨基基团，并通过化学交联法与电鳗乙酰胆碱酯酶和质控分子偶联。

本发明所述定量检测有机磷类农药的免疫层析方法中所述的化学交联法包括碳二亚胺法、戊二醛法、混合酸酐法或SPDP（3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯）法的一种。

本发明所述定量检测有机磷类农药的免疫层析方法中所述的有机磷农药为对硫磷、杀扑磷、氧化乐果、甲拌磷、甲胺磷、敌敌畏、甲基对硫磷、倍硫磷、敌百虫、毒死蜱、杀螟硫磷、三唑磷、甲基毒死蜱、辛硫磷、喹硫磷。

本发明所述的定量检测有机磷类农药的免疫层析方法中所述的质控分子为抗体，质控线上的标记物为与质控分子特异性识别与结合的小分子偶联物、大分子蛋白质或二抗的一种，或质控分子为链霉亲和素，质控线上的标记物为生物素蛋白偶联物。

一种根据本发明所述的免疫层析方法制备的免疫层析试纸条，由依次在带有粘合剂的底板上相互搭接的样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫组成，还包括放置试纸条的外壳，将试纸条裁切成预定的尺寸，装入外壳中，完成检测卡的装配。

所述的结合垫上固定了电鳗乙酰胆碱酯酶和质控分子标记的指示剂，在层析膜上设有所述的抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体喷涂的检测线、和与质控分子特异性结合的生物分子喷涂的质控线。

所述的结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜，所述的层析膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

本发明所述的免疫层析试纸条在检测食品中有机磷类农药残留中的应用，主要包括以下步骤：

（1）样本前处理；

（2）利用免疫层析试纸条进行检测；

（3）采用检测仪读取检测结果。

本发明检测结果的评判：可以根据试纸条质控线的信号评判检测结果是否有效，当试纸条质控线没有出现信号时，表明试纸条组装过程或者层析条件无效，是一个无效的检测结果，当质控线出现信号时，检测结果有效。

本发明检测结果的定量判定方法：如果两条质控线信号强度的比值超出定量仪内部设定的可接受值时，说明检测结果无效；在检测结果有效前提下，检测线与质控线信号强度的比值越高，表示样品中含有目标分析物的浓度越低，反之越高，依据标准曲线可获得样本中目标物的具体含量。

本发明的标准曲线为：采用定量仪检测一系列不同浓度的标准品，并绘制标准品系列浓度与所对应的校正信号强度关系曲线，即为标准曲线，其中校正信号强度为F＝F_检测线/F_质控线。

本发明所述的制备抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

将电鳗乙酰胆碱酯酶（购自Sigma，CAS：9000-81-1）作为免疫原免疫Balb/C雌性小鼠。使用无菌生理盐水将完全抗原稀释至1mg/mL，取适量免疫原稀释液，与等体积的快速免疫佐剂混合，用注射器乳化均匀后，按照20μg/只的剂量进行皮下多点注射。三周后，按照同样的剂量和方式进行加强免疫3次，免疫四次后对小鼠进行尾部采血，通过离心分离血清，以乙酰胆碱酯酶作为检测目标物，采用ELISA测定血清的效价，选择效价高的小鼠进行细胞融合。

小鼠在最后一次免疫后18天冲击免疫，三天后通过无菌操作去除脾脏，制备脾单细胞悬液，按照10:1的比例与对数期生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行混合，离心去除上清，将细胞振散后，通过聚乙二醇法进行细胞融合。融合后第3天和第5天，分别进行50%、90%HAT培养液换液，第7~9天进行细胞上清的筛选。挑选阳性的细胞上清，以电鳗乙酰胆碱酯酶作为包被原，添加有机磷类农药进行检测，筛选出有机磷类农药对检测具有抑制效果的细胞孔进行亚克隆。

亚克隆采用有限稀释法，每孔0.5~2个细胞，重复三次亚克隆。第一次亚克隆使用HT培养液，后两次使用1640培养液，所有培养液中血清含量均为15%，最终得到所需的单克隆抗体细胞株。将得到的细胞株扩大培养后，冻存保种，其余细胞继续培养，通过体内腹水法制备单克隆抗体，采用辛酸硫酸铵法或蛋白G方法进行纯化，得到单克隆抗体。

有益效果：本发明使用能与有机磷类农药结合的电鳗乙酰胆碱酯酶代替有机磷农药抗体进行有机磷类农药的识别，并制备抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，并且该单克隆抗体结合电鳗乙酰胆碱酯酶的位点与有机磷类农药结合电鳗乙酰胆碱酯酶的位点相同，以单克隆抗体固定检测线，电鳗乙酰胆碱酯酶修饰指示剂，制备定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，可以实现有机磷类农药的多残留检测。本方法采用抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体与电鳗乙酰胆碱酯酶的识别与结合形成检测线，抗原抗体的识别方式具有更强的结合能力，可以增强指示剂在检测线位置的固定效果；避免了有机磷农药蛋白偶联物的化学制备和有机磷农药指示剂的标记，简化了实验程序，降低了合成过程中有机磷农药标准品的使用对人体健康的危害和对环境的严重污染；同时本发明制备的免疫层析试纸条对有机磷检测灵敏度高、检测目标物种类多，可以实现准确、快速、现场高通量的检测需求。

附图说明

图1 免疫层析试纸条的组装示意图。

其中1为底板，2为样品垫，3为结合垫，4为层析膜，5为检测线，6为质控线，7为吸水垫。

图2 毒死蜱检测的荧光信号图。

图3 毒死蜱检测的标准曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，本领域技术人员可以在不脱离本发明内容、本发明所述的范围内适当改进工艺参数，并对其进行适当的变更和组合，所有类似的变更和组合对本领域技术人员来说是显而易见的，也在本发明的保护范围内。

一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，包括如下步骤：

步骤1）以电鳗乙酰胆碱酯酶作为免疫原免疫小鼠，制备抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体：

本发明所述的制备抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

将电鳗乙酰胆碱酯酶（购自Sigma，CAS：9000-81-1）作为免疫原免疫Balb/C雌性小鼠。使用无菌生理盐水将完全抗原稀释至1mg/mL，取适量免疫原稀释液，与等体积的快速免疫佐剂混合，用注射器乳化均匀后，按照20μg/只的剂量进行皮下多点注射。三周后，按照同样的剂量和方式进行加强免疫3次，免疫四次后对小鼠进行尾部采血，通过离心分离血清，以乙酰胆碱酯酶作为检测目标物，采用ELISA测定血清的效价，选择效价高的小鼠进行细胞融合。

小鼠在最后一次免疫后18天冲击免疫，三天后通过无菌操作去除脾脏，制备脾单细胞悬液，按照10:1的比例与对数期生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行混合。离心去除上清液体，将细胞振散后，通过聚乙二醇法进行细胞融合。融合后第3天和第5天，分别进行50%、90%HAT培养液换液，第7~9天进行细胞上清的筛选。挑选阳性的细胞上清，以电鳗乙酰胆碱酯酶作为包被原，添加有机磷类农药进行检测，筛选出有机磷类农药对检测具有抑制效果的细胞孔进行亚克隆。

亚克隆采用有限稀释法，每孔0.5~2个细胞，重复三次亚克隆。第一次亚克隆使用HT培养液，后两次使用1640培养液，所有培养液中血清含量均为15%，最终得到所需的单克隆抗体细胞株。将得到的细胞株扩大培养后，冻存保种，其余细胞继续培养，通过体内腹水法制备单克隆抗体，采用辛酸硫酸铵法或蛋白G方法进行纯化，得到单克隆抗体。

步骤2）用化学交联法或物理吸附法将电鳗乙酰胆碱酯酶和质控分子分别偶联到指示剂表面，构成电鳗乙酰胆碱酯酶标记的指示剂和质控分子标记的指示剂，并将两者混合得到标记液；

步骤3）以底板、样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和外壳构建成免疫层析试纸条，其中结合垫上固定有步骤 2）制备的标记液，层析膜上设有检测线和质控线，检测线上固定有步骤1）制备的抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，质控线上固定有能与所述的质控分子特异性结合的生物分子，所述层析膜、底板和外壳均没有荧光特性。

步骤4）将检测液滴加于试纸条的样品垫处，进行免疫层析，当检测液流经检测线和质控线后，检测线和质控线的位置将会出现指示信号，根据检测线和质控线的信号强度，实现目标物的定量检测。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，本实施例以量子点作为指示剂进行免疫层析试纸条的制备，仅为本发明的较佳实施例，本领域技术人员可以在本发明公开内容的范围内进行适当的组合，来实现和应用本发明的技术方案。

实施例1

量子点免疫层析试纸条检测有机磷农药，包括如下步骤：

（1）CdSe@ZnS量子点的合成

将50mg硒粉在氮气保护条件下加入到50mL含有100mg的NaBH₄的水溶液中，在油浴中加热到50℃，冷凝回流至硒粉溶解得到透明溶液，作为溶剂1；另取50mg硒粉在氮气保护条件下加入到50mL含有200mg的Na₂SO₃的水溶液中，在油浴中加热至沸腾，冷凝回流5h，抽滤得到透明溶液，作为溶剂2。

在氮气保护下将300mg CdCl₂溶于80mL的去离子水中，加入450mg巯基乙酸，调节溶液pH为9~10，使得溶液变为无色透明，在氮气保护下加入溶剂1和溶剂2，搅拌加热至沸腾，冷凝回流40min。然后在10min内分别滴加50mL 0.1M的ZnSO₄溶液和50mL 0.1M的NaS溶液，继续搅拌反应30min，得到羧基修饰的水溶性CdSe@ZnS量子点，通过透射电子显微镜测得量子点的粒径为6~7nm，通过荧光分析仪测得量子点的激发波长为365nm，发射波长为610nm。

（2）电鳗乙酰胆碱酯酶和质控分子分别修饰量子点

将步骤（1）合成的量子点用pH6.5的0.01M的MES（2-吗啉代乙磺酸）缓冲液稀释到1mg/mL，取1mL于1.5mL的离心管中，先向量子点中加入30mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS )，再加入50mg的碳二亚胺（EDC），在室温下缓慢振荡反应1h，然后将活化后的量子点分成两管，每管500μL，向其中一管中加入1mg电鳗乙酰胆碱酯酶，向另一管中加入1mg的生物素抗体，在室温下继续搅拌反应4h，将反应后的量子点在10000r/min的条件下离心10min，去除上清液，将两种物质标记的量子点溶于重悬液中（0.01M PB，1%蔗糖，1%BSA），并将两者进行混合作为标记液置于4℃备用。

（3）试纸条的构建

将步骤（2）制备的标记液用喷膜仪喷涂于结合垫上，用划膜仪将抗电鳗乙酰胆碱酯酶的抗体和生物素BSA偶联物分别划线到层析膜的检测线和质控线上，检测线和质控线的间隔R为：3mm≤R≤8mm，37℃烘干后，按照如图1所示组装荧光免疫层析试纸条：样品垫2、结合垫3、层析膜4、吸水垫7依次粘贴于黑色底板1上，组装好后，按照要求切割为所需宽度，并置于外壳中。

所述的样品垫和结合垫为玻璃纤维素膜，层析膜为Millipore 135的硝酸纤维素膜，吸水纸的厚度为1mm。

（4）检测灵敏度分析

将毒死蜱农药标准品配置成0mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg的浓度，每种浓度的毒死蜱取100μL分别加到试纸条的样品垫位置，进行层析反应，层析完全后，用荧光定量检测仪进行荧光信号的分析。试纸条的检测结果如图2所示，从图中看中，随着毒死蜱浓度的增加，荧光信号越弱；并根据毒死蜱农药标准品的浓度和校正荧光信号强度的对应关系建立标准曲线，如图3所示，在0.1~2mg/kg的浓度范围内，毒死蜱检测的线性关系良好，并通过计算得出毒死蜱的最低检测限为0.036mg/kg，定量限为0.05mg/kg。

（5）实际样本检测

将阴性苹果样本进行前处理后，在其中添加毒死蜱农药，使得添加浓度为0.15mg/kg、0.25mg/kg、0.8mg/kg、1.2mg/kg、1.5mg/kg，用试纸条进行测定，测定的添加回收率为96.2~98.4%，可以满足实际检测的需求。

（6）其它几种有机磷农药的检测

用本实施例构建荧光试纸条的方法，对其它几种有机磷农药进行检测，每种农药的最低检测限和定量限结果如表1所示，从表中可以得出，本发明的检测试纸条对有机磷农药的检测具有较高的灵敏度，可以达到GB2763-2016《食品中农药最大残留限量》的检测标准，并且可以实现有机磷类农药的多残留检测。

表1

Claims (10)

1.一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1）以电鳗乙酰胆碱酯酶作为免疫原免疫小鼠，制备抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，并且该单克隆抗体结合电鳗乙酰胆碱酯酶的位点与有机磷类农药结合电鳗乙酰胆碱酯酶的位点相同；

步骤2）用化学交联法或物理吸附法将电鳗乙酰胆碱酯酶和质控分子分别偶联到指示剂表面，构成电鳗乙酰胆碱酯酶标记的指示剂和质控分子标记的指示剂，并将两者混合得到标记液；

步骤3）以底板、样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和外壳构建成免疫层析试纸条，其中结合垫上固定有步骤 2）制备的标记液，层析膜上设有检测线和质控线，检测线上固定有步骤1）制备的抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，质控线上固定有能与所述的质控分子特异性结合的生物分子，所述层析膜、底板和外壳均没有荧光特性；

步骤4）将检测液滴加于试纸条的样品垫处，进行免疫层析，当检测液流经检测线和质控线后，检测线和质控线的位置将会出现指示信号，根据检测线和质控线的信号强度，实现目标物的定量检测。

2.根据权利要求1所述的一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，其特征在于，所述的指示剂为荧光染料或纳米颗粒。

3.根据权利要求2所述的一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，其特征在于，所述的纳米颗粒为胶体金、量子点、磁纳米颗粒、时间分辨荧光微球、彩色乳胶微球、荧光乳胶微球或上转换荧光纳米颗粒的一种。

4.根据权利要求3所述的一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，其特征在于，所述的胶体金通过物理吸附法与电鳗乙酰胆碱酯酶和质控分子偶联。

5.根据权利要求3所述的一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，其特征在于，所述的量子点、磁纳米颗粒、时间分辨荧光微球、彩色乳胶微球、荧光乳胶微球或上转换荧光纳米颗粒表面修饰有羧基或者氨基基团，并通过化学交联法与电鳗乙酰胆碱酯酶和质控分子偶联。

6.根据权利要求5所述的一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，其特征在于，所述的化学交联法包括碳二亚胺法、戊二醛法、混合酸酐法或SPDP法的一种。

7.根据权利要求1所述的一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，其特征在于，所述的有机磷农药为对硫磷、杀扑磷、氧化乐果、甲拌磷、甲胺磷、敌敌畏、甲基对硫磷、倍硫磷、敌百虫、毒死蜱、杀螟硫磷、三唑磷、甲基毒死蜱、辛硫磷、喹硫磷。

8.根据权利要求1所述的一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，其特征在于，所述的质控分子为抗体，质控线上的标记物为与质控分子特异性识别与结合的小分子偶联物、大分子蛋白质或二抗的一种，或质控分子为链霉亲和素，质控线上的标记物为生物素蛋白偶联物。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的免疫层析方法制备的免疫层析试纸条，其特征在于，由依次在带有粘合剂的底板上相互搭接的样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫组成，还包括放置试纸条的外壳，将试纸条裁切成预定的尺寸，装入外壳中，完成检测卡的装配；

所述的结合垫上固定了电鳗乙酰胆碱酯酶和质控分子标记的指示剂，在层析膜上设有所述的抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体喷涂的检测线，和与质控分子特异性结合的生物分子喷涂的质控线；

所述的结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜，所述的层析膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

10.根据权利要求9所述的免疫层析试纸条在检测食品中有机磷类农药残留中的应用。