KR100715717B1

KR100715717B1 - 꿀벌유래 ＡＣｈＥ 및 그 항체를 이용한 잔류농약 진단키트

Info

Publication number: KR100715717B1
Application number: KR1020050113358A
Authority: KR
Inventors: 심재한; 황태익; 김영식; 김보미
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2005-11-25
Filing date: 2005-11-25
Publication date: 2007-05-08

Abstract

본 발명은 꿀벌유래 아세틸콜린에스터라제(AChE)를 이용한 잔류농약 진단키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 꿀벌두부로부터 추출한 AChE와 특이적으로 결합하는 AChE 항체와 정제된 꿀벌 AChE 혼합용액을 스트립 디스크(strip disk) 멤브레인(membrane)에 흡착시켜 제조된 검정키트로서, 상기 검정키트의 발색제투입구에 발색제를 넣고 시료투입구에 과채류 즙과 발색제를 넣어, 검정창에 나타나는 선의 개수와 색의 농도를 대조창과 비교하여 잔류농약을 진단하는 꿀벌 AChE를 이용한 잔류농약 진단키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 잔류농약 진단키트는 꿀벌유래 AChE가 항체-항원 친화성을 이용하여 진단키트에 효율적으로 부착되어 있어, 유기인계와 카바메이트계 잔류농약을 간단하고 신속하게 진단할 수 있으며, 동시에 키트에 나타난 노란선의 개수 및 농도로 잔류농약의 최저검출농도기준에 대한 간단한 정량까지 가능한 효과가 있다.

꿀벌 AChE, AChE IgG, 진단키트, 유기인계, 카바마이트계

Description

꿀벌유래 ＡＣｈＥ 및 그 항체를 이용한 잔류농약 진단키트{Pesticide Residue Detection Kit Using Acetylcholinesterase(AChE) Originated form Honeybee Head and Antibody Thereof}

도 1은 6단계로 정제된 AChE의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 것이다.

도 2는 Protein A-Agarose Chromatography에서 AChE의 활성과 단백질 함량을 나타낸 것이다.

도 3은 AChE Ab의 면역확산반응을 나타낸 것이다.

도 4는 IgG를 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 흡착시에 흡광도를 측정한 것이다.

도 5는 IgG를 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 흡착시 코팅시간과 온도에 따른 흡착농도를 나타낸 것이다.

도 6은 IgG를 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 흡착시 코팅버퍼(coating buffer) pH에 따른 흡착농도를 나타낸 것이다.

도 7은 BCIP-NBT를 이용하여 IgG와 AChE 혼합비에 따른 흡착효과를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명에 따른 잔류농약 진단키트의 구성을 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명에 따른 잔류농약 진단키트의 사용법을 나타낸 것이다.

도 10a 및 10b는 잔류농약이 최저검출농도 이하인 것과 이상인 것을 나타낸 것이다.

도 11a 및 11b는 다이아지논(diazinon)과 벤디오카브(bendiocarb)를 농도별로 희석하고 이를 농약 스탠다드로 이용하여 최저검출농도를 알아본 것이다.

본 발명은 꿀벌유래 AChE 및 그 항체를 이용한 잔류농약 진단키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ELISA 방법을 응용하여 꿀벌두부로부터 추출한 AChE와 상기 AChE에 특이적으로 결합하는 AChE 항체를 진단키트의 멤브레인(membrane)에 부착시킴으로써, 농산물의 잔류농약을 신속, 간편하게 진단할 수 있는 꿀벌유래 AChE 및 그 항체를 이용한 잔류농약의 진단키트에 관한 것이다.

신경계의 시냅스(synapse)에 존재하는 AChE는 신경세포와 신경근접합부를 지나는 신경세포간 접합부위 회로 후막 등의 신경전달신경계에서 중요한 효소로 신경전달물질인 아세틸콜린(ACh,acetylcholine)을 아세테이트(acetate)와 콜린(choline)으로 가수분해시키는 역할을 한다. 상기 AChE는 유기인(Organophosphorus)계와 카바메이트(Carbamate)계 농약에 의해 저해되는 것으로 알려져 있으며, 해충뿐만 아니라 사람의 AChE도 직접적으로 저해하기 때문에 해충에 서 나타나는 신경독성이 사람에게도 나타난다는 보고가 있어왔다. 아울러 환경 내에서의 반감기 또한 농약에 따라 수일~수십일 가량으로 보고 되어 이들 농약의 농축 및 잔류문제는 인축에 큰 위해의 요인으로 작용하고 있다. 따라서, 신속한 잔류량 측정기술을 보급함으로써 농약을 안전하게 사용하도록 하는 계기를 마련하여야 할 것이나, 현재 사용되는 농약 잔류량 측정은 고가의 장비들(GC, HPLC, GC-MS)을 사용하여 이루어지고 있으며, 기기 1대당 1일 측정 가능한 시료의 수가 한정되어 있어 수많은 과채류 중에서 극히 일부분만을 측정할 수 있으며 많은 시간이 소요되는 문제점이 있다. 또한, 많은 시간과 비용이 드는 정밀분석은 소비자가 섭취한 후에 그 결과가 나오는 경우가 많아 문제가 되었다.

이러한 단점을 보완하기 위해 사용되는 것이 곤충유래 AChE를 이용한 잔류농약 진단방법으로서, 곤충의 AChE의 저해정도를 이용한 유기인계와 카바메이트계 농약의 정량방법은 신속하고 민감한 효소반응을 이용하는 방법으로 그 유용성이 증명되었으며, 특히 곤충의 AChE에 이들 농약이 더 민감하게 반응하는 것으로 나타났다.

그러나, 종래에 사용되는 잔류농약 진단방법은 AChE를 효과적으로 키트화 하지 못하고, 대부분 분광광도계 등 분석기를 이용하여 진단하는 데 그치고 있다. 분석기를 이용하는 진단방법은 진단을 위한 다수의 시료용액을 각각 준비하여 단계에 따라 반응시켜야 하므로 진행 과정이 복잡하고, 휴대가 용이하지 않아 장소에 제한이 있다는 단점이 있다.

예로, 국내등록특허 제10-0441056호는 아세틸콜린에스터라제를 1회 측정용량 으로 분취하여 기질, 반응정지액 및 발색시약을 방울단위로 첨가하여 반응시킨 후 분광광도계로 흡광도를 측정하여 이를 저해율로 환산하여 농산물 중의 잔류농약을 진단하는 방법에 관한 것이다. 아세틸콜린에스터라제를 이용한 분석방법은 종래부터 이용된 방법이며, 반응을 위한 다수의 시료용액을 각각 준비하여야 하므로 유기용매의 소모가 많고, 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 흡광도 측정을 통해 잔류농약을 정량하기 때문에, 휴대가 불편한 단점이 있다.

또한, 청과물에서 카바메이트계 잔류농약을 분석하기 위한 효소 저해제 및 효소면역측정법(Katsoudas E, Abdelmesseh HH., J Food Prot ., 63(12):1758~60, 2000) 역시 아세틸콜린에스터라제 저해 스크리닝으로부터 양성반응을 보인 샘플을 다시 카바릴-특정 효소가 링크된 효소면역측정법을 이용하여 카바메이트계 농약을 분석한 것이나, 이는 카바메이트계 농약만을 분석할 수 있는 것으로 분석농약이 한정되어 있으며, 또한 간단하게 측정할 수 있도록 키트화되지 않고 분석방법만이 기재되어 있다. 이는 AChE가 효소단백질로 당단백 함량이 높아 멤브레인에 부착되지 않으므로 키트화하기 어렵기 때문이라고 볼 수 있다.

이에 본 발명자들은 시간이 절약되고, 간단하게 시료를 측정할 수 있으며 휴대가 간편할 수 있도록 AChE를 효과적으로 키트화하기 위해 예의 노력한 결과, 꿀벌유래 AChE와 상기 AChE에 특이적으로 반응하는 AChE IgG(AChE Ab)를 진단키트 멤브레인에 흡착시켜 AChE를 효과적으로 부착함으로써, 유기인계와 카바메이트계 잔류농약의 진단하고 동시에 간단한 정량까지 할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 꿀벌유래 AChE를 상기 AChE에 특이적으로 반응하는 AChE IgG를 이용하여 진단키트 멤브레인에 효과적으로 부착함으로써, 유기인계와 카바메이트계 잔류농약을 신속, 정확, 간단하게 진단할 수 있는 꿀벌유래 AChE 및 그 항체를 이용한 잔류농약 진단키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 정제된 꿀벌 AChE(acetylcholinesterase)와 상기 꿀벌 AChE에 특이적으로 결합하는 AChE 항체의 혼합용액이 코팅 버퍼(coating buffer) 및 블록킹 버퍼(blocking buffer)를 통해 흡착되어 있는 스트립 디스크 멤브레인(strip disk membrane), 잔류농약 검출반응을 확인할 수 있는 발색제, 대조창 및 검정창을 포함하는 꿀벌 AChE를 이용한 잔류농약 진단키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 꿀벌 AChE는 DEAE 셀룰로오스 크로마토그래피(DEAE Cellulose Chromatography), 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography) 및 FPLC를 단계적으로 행하여 정제된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 AChE 항체는 토끼에서 유래된 AChE IgG인 것을 특징으로 하며, 상기 스트립 디스크(strip disk) 멤브레인(membrane)은 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 AChE와 AChE IgG는 2:1로 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 코팅 버퍼(coating buffer)는 카보네이트 버퍼(carbonate buffer)인 것을 특징으로 하며, 상기 카보네이트 버퍼(carbonate buffer)의 최적 pH는 9.6인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발색제는 0.075M ATC(acetylthiocholine iodide)와 0.01M DTNB를 혼합한 용액인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 진단키트는 멤브레인의 양단에 엽록체 흡착방지를 위한 글래스 필터(glass filter)를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 농약은 유기인계 또는 카바메이트계 살충제인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유기인계 살충제는 포스파미돈(Phosphamidon), 메틸 파라티온(methyl parathion), 에티온(ethion), 구티온(guthion), 디아지논(diazinon), 디클로르보스(dichlorvos), 말라티온 (malathion), 졸론(zolone), 페니트로티온 (fenitrothion), 펜토에이트(phenthoate) 및 에토프로포스(ethoprophos)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하며, 상기 카바메이트계 살충제는 알디카브(aldicarb), 메티오카브(methiocarb), 벤디오카브(bendiocarb), 메토밀(methomyl), 카바릴 (carbaryl), 옥사밀(oxamyl), 카르보푸란(carbofuran), 피리미카브(pirimicarb), 이소프로카브(isoprocarb), 프로폭서(propoxur) 및 티오벤카브(thiobencarb)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: 시료의 준비

ATC(Acetylthiocholine iodide), DTNB(5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)), 소디움 포스페이트 버퍼(Sodium Phosphate Buffer, 이하 "버퍼"라고 명기함), 카보네이트 버퍼(Carbonate buffer), BSA, Triton X-100, Freund's adjuvant 및 BCIP-NBT 등은 시그마(Sigma Chemical Co.: USA)로부터 구입하여 사용하였다.

알디카브(Aldicarb), 다이아지논(diazinon), 에쏘프로포스(ethoprophos), 페니트로티온(fenitrothion), 구티온(guthion), 말라티온(malathion), 파라티온(parathion), 펜토에이트(phenthoate), 포스파미돈(phosphamidon), 메티오카브(methiocarb), 벤디오카브(bendiocarb), 카바릴(carbaryl), 카보푸란(carbofuran), 메티오카브(methiocarb), 메토밀(methomyl), 옥사밀(oxamyl), 피리미카브(pirimicarb), 프로폭서(propoxur), 티오벤카브(thiobencarb)는 한국농업과학기술원에서 제공한 것을 사용하였다.

실시예 2: AChE 추출물의 준비 및 정제

꿀벌(Apis mellifera)을 -70℃에서 냉사시킨 후, 머리만을 절단, 분리하고 0.1M 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.4, 이하에서는 '버퍼'라고 명기한다)을 첨가하여 15분간 20,000rpm에서 마쇄하였다. 마쇄액을 여과지로 필터링(filtering) 한 후, 15분간 13,000rpm에서 원심분리하였고 상등액을 효소현탁액으로 이용하였다. 상기 효소현탁액을 6,000g에서 1시간 원심분리 한 다음, 그 상등액에 (NH₄)₂SO₄ 0.134g/㎖을 첨가하여 3시간 동안 혼합하였다. 상기 혼합액을 6,000g에서 다시 30분간 원심 분리하고, 그 펠렛(pellet)을 0.1M 버퍼에 투석한 후(버퍼는 2시간씩 최소 6번 교환하였다), 이 혼합액을 6,000g에서 다시 2시간 동안 원심분리하여 그 상등액을 효소현탁액으로 사용하였다.

효소의 활성은 Elman 등의 방법에 따라 측정하였다. 활성의 측정은 37℃에서 0.1M 인산버퍼(pH 7.4) 1.2㎖를 효소액 0.1㎖와 함께 시험관에 넣고 수조에서 30분간 반응시킨 후, 0.01M DTNB용액을 100㎕가하여 분광광도계에서 영점을 맞췄다. 기질로서 0.075M ATC(Acethylthiocholine iodide) 20㎕를 가하여 412nm에서 흡광도 변화를 분당 측정하였다.

단백질농도는 BCA를 이용하여 Bradford 방법으로 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 0.1M 인산버퍼(pH 7.4) 1.0㎖와 Bradford 시약 1.0㎖를 혼합한 용액으로 분광광도계 영점을 맞췄다.

1단계: DEAE Cellulose Chromatography

상기 효소현탁액을 DEAE Cellulose Chromatography 하여 AChE를 정제하였다. 레진은 DEAE-Cellulose를 0.1M 버퍼에 섞은 후, 37℃에서 12시간 혼합한 것을 사용하였다. 레진을 컬럼(3×20cm)에 충진한 후 효소현탁액을 흘려주고, 이어서 Equillibration 버퍼인 0.1M 인산버퍼를 흘려주었다. 그리고 나서, 와싱버퍼로 0.1M NaCl을 사용하여 컬럼을 씻어주고 fraction을 수집하였다. 각 fraction의 AChE 활성을 측정하고, 단백질 정량을 하였다.

2단계: Affinity Chromatography

상기 Fraction 중 활성이 높은 2~3개의 fraction을 0.1M 버퍼로 투석(버퍼를 2시간씩 최소 6번 교환)하여 효소현탁액을 만든 후에, 상기 효소현탁액을 Pasteur 등의 방법(Pasteur, N. et al . Molecular biology of Insect Disease Vectors :A Methods Manual ., 399, Chapman and Hall, 1997)에 의해 프로카인아마이드(procainamide)를 기초로 하고 ECH-Sepharose 4B를 기질로 하는 친화성 크로마토그래피를 하였다. 이때 레진은 프로카인아마이드 0.68g를 증류수 5ml에 녹인 것과, EEDQ 0.062g를 에탄올 5ml에 녹인 것을 혼합한 EEDQ 솔루션을 ECH-Sepharose 4B 10ml와 4℃에서 12시간 동안 서서히 혼합한 것을 사용하였다. 상기 레진을 컬럼(1×8.5cm)에 충진하고, 상기 효소현탁액을 흘려주었다. Equillibration 버퍼는 0.1M 인산버퍼에 0.05% Triton X-100을 녹인 PTS 버퍼를 사용하였고, 바인딩 버퍼는 0.03M Net4I를 50mM PTS 버퍼에 녹인 용액을 사용하였으며, 와싱 버퍼는 50mM PTS 버퍼에 50mM NaCl을 혼합한 용액을 사용하였다. Fractions은 2.5㎖씩 수집하였고, 각 fraction의 AChE 활성을 측정하고 단백질 정량을 하였다.

3단계: FPLC( Fast Protein Liquid Chromatography )

상기 친화성 크로마토그래피에 의해 수집된 fraction 중 활성이 높은 2~3개의 fraction을 0.1M 버퍼로 투석(버퍼를 2시간씩 최소 6번 교환)하여 효소현탁액을 만들고, 상기 효소현탁액을 PTFE 0.5㎛ 막으로 여과한 후 FPLC를 하였다. 수집된 각 fraction의 AChE 활성을 측정하고 단백질 정량을 하였다.

결과분석

꿀벌 두부속의 AChE는 추출, 침전, 원심분리, DEAE Cellulose Chromatography, 친화성 크로마토그래피 및 FPLC를 연속적으로 진행하여 정제되었으며, 각 과정에서 효소의 활성과 단백질 함량이 가장 높은 2~3개의 fraction을 투석한 후, 상기 1 내지 3단계의 크로마토그래피를 수행한 결과, 꿀벌 4g에서 119.4㎛ol/min/㎎ AChE 활성을 가진 단백질 17㎍을 수득하였다 (도 1).

실시예 3: AChE Ab (항체)의 준비 및 정제

실시예 2에서 정제된 AChE 300㎎/버퍼 300㎖를 프로이드 어쥬번트(Freund's adjuvant, Sigma Chemical Co.:USA) 500㎕와 혼합한 용액을 총 4번에 걸쳐 3마리의 토끼에 주사하였다. 이때, 제1차주사 한달 후에 제2차 주사하였고, 제2차주사 2주 후에 제3차 주사하였고, 제3차주사 10일 후에 제4차 주사하였고, 마지막 제4차주사 후 3일이 경과하면 각 토끼의 혈액을 1㎖씩 수집하고 ELISA를 통해 Ab의 활성을 측정하여 활성이 가장 높은 혈액을 15~20㎖ 수집하였다.

이 혈액을 5000rpm에서 10분 원심분리하여 세럼(serum)을 분리하여 정제하였 다. 레진으로 Protein A Agarose를 사용하였고, 와싱/바인딩 버퍼로 0.1M NaCl을 첨가한 0.1M 인산버퍼를 사용하였으며, elution 버퍼는 0.2M 글리신(glycine, pH 2.85)을 사용하였다. 상기 레진 1㎖를 컬럼(1×8.5cm)에 붓고 레진 부피의 8배 와싱 버퍼로 씻어주었다. 세럼을 바인딩 버퍼에 1:5 비율로 희석한 후, 컬럼 내 레진과 5~10분 동안 서서히 혼합해 준 후, 컬럼에 다시 붓고 레진 부피의 8배 와싱 버퍼로 씻어주었다. 그 후 elution 버퍼를 각 1㎖씩 흘려주며 fraction을 수집하고 레진부피의 30배 와싱버퍼로 씻어 레진을 재생하고 세럼을 모두 정제할 때까지 상기 과정을 반복하였다. fraction은 A₂₈₀을 재고 가장 높은 흡광도를 가진 2~3개의 fraction을 0.1M 버퍼로 투석(버퍼를 2시간씩 최소 6번 교환)하였다.

그 결과, 상기 Protein A Agarose 크로마토그래피를 통해 토끼 혈액 15㎖에서 31.94㎛ol/min/㎎ 단백질을 함유한 AChE Ab 13.02㎍을 정제할수 있었으며(도 2), 상기 정제된 AChE Ab는 Immunodiffiusion(도 3)을 통해 꿀벌 AChE 특정 항체에만 반응하는 Ab임을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 스트립 흡착도 테스트( Strip adsorption stability test )

스트립 디스크(Strip disk)로 사용 가능한 멤브레인인 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), PTFE, 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), 나일론(nylon), PVDF, polystyrene을 가지고 실시예 3에서 정제된 AChE Ab 흡착도를 ELISA로 측정하였다 (표 1).

멤브레인( membrane )	흡착도(%)
셀룰로오스 아세테이트	97
PTFE	101.50
니트로셀룰로오스	100
나일론	117
PVDF	97
폴리스티렌	107.50

상기 표 1에 나타난 실험결과에 따라 흡착도 100%인 니트로셀룰로오스를 스트립 디스크로 사용하였다. 이는 나일론의 경우 소수성이 높아 흡착도는 높은 편이나 가격이 고가여서 경제성이 떨어지고, 본 발명에서는 농약잔류 검정시 과채류 자체나 그 즙을 이용하므로 유기용매를 이용할 때 사용하는 PTFE를 사용할 필요가 없으며, 폴리스티렌은 굉장히 딱딱하여 잘 부러지고 키트에 부착할 수 있는 시트형태가 나오지 않기 때문이다.

AChE Ab를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 흡착시키고 ELISA reader를 이용하여 A₄₀₅에서 측정한 결과는 도 4와 같고, 이 값을 참고로 니트로셀룰로오스 멤브레인에 AChE Ab를 흡착할 때 최적 코팅 시간, 온도 및 코팅 버퍼 pH를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, 4℃에서 6시간 동안 코팅하고, 코팅 버퍼의 pH는 9.6일 때 가장 최적흡착도를 나타내었다 (도 5 및 도 6).

실시예 5: 진단키트의 준비 및 사용법 규격화

실시예 2 및 3에서 정제된 AChE와 AChE IgG(AChE Ab)를 2:1, 3:1 및 4:1로 비율을 달리하여 혼합한 용액을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 흡착시킨 후, BCIP-NBT를 이용하여 흡착효과를 조사한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, AChE : AChE IgG를 2:1비율로 혼합하여 흡착한 경우(b)가, 기존 방법으로 AChE IgG를 흡착했을 때(a)와 가장 유사한 흡착도를 나타냈다.

도 8에 나타나 있는 스트립(진단키트) 니트로셀룰로오스 멤브레인의 b부분에 디스펜서(dispenser)로 상기 AChE IgG와 AChE를 2:1로 혼합한 용액을 7줄로 흡착시키고, 코팅버퍼로 pH 9.6인 카보네이트 버퍼(carbonate buffer)를 이용하여 3시간 동안 침지한 후, pH 7.6 카보네이트 버퍼(carbonate buffer)로 와싱(washing)하였다. 이때 엽록소 흡착방지를 위해 a부분에 글래스 필터(glass filter)를 부착하였다.

상기 방법으로 제작된 잔류농약 검정키트의 사용법은 다음과 같은 단계로 규격화하였다(도 9).

a) 진단키트 발색제투입구에 발색제튜브의 한쪽만을 잘라 발색제를 시료 투입구에 넣어주는 단계;

b) 과채류를 4~5mm로 잘게 자르거나 즙을 내는 단계;

c) 과채류의 잘게 자른 조각이나 즙을 진단키트 하단 시료투입구에 넣어주는 단계;

d) 상기 시료투입구에 발색제튜브의 한쪽 끝을 잘라 발색제를 넣고 섞어주는 단계; 및

e) 10여분 후에 검정창에 노란색 선이 나타나게 되면, 이때 대조창의 노란색 선의 개수와 색의 농도를 비교하는 단계.

상기 잔류농약 검정키트의 발색제는 1회 검정시 0.075M ATC(Acetylthiocholine iodide) 60㎕와 0.01M DTNB 300㎕를 혼합한 용액을 사용하였다. 검정키트는 상단투입구에 발색제만을 투입(control)하여 검정창에 나타난 결과를 기준으로, 하단시료투입구에 검정하고자하는 과채류의 즙을 발색제와 함께 투입한 후 대조창에 나타난 결과를 비교하여 분석하였다. 대조창의 결과가 검정창의 결과와 동일하면, 검정하고자 한 과채류에는 잔류농약이 최저검출농도이하로 존재하는 것이고, 대조창에 나타나는 노란색 선의 수가 적으면 잔류농약이 최저검출농도이상으로 존재하는 것으로 해석할 수 있으며, 노란선의 색농도로도 잔류농약에 의한 효소활성의 강약을 알 수 있다 (도 10a 및 10b).

또한, 다이아지논(diazinon)과 벤디오카브(bendiocarb)를 농도별로 희석하고 이를 농약 스탠다드로 이용하여 최저검출농도를 알아보았다(도 11a 및 11b). 다이아지논(diazinon)과 벤디오카브(bendiocarb) 스탠다드는 양쪽 모두 농도에 따라 노란선의 갯수 및 색의 농도에서 확연한 차이를 나타내었으며, 이러한 농약 스탠다드를 이용함으로써 노란선의 수만으로도 대략적인 정량이 가능함을 알 수 있다.

실시예 6: 진단키트의 현장 검증 실험

실시예 5의 진단키트 및 사용법을 이용하여, 30가지 유기인계 및 카바마이트계 농약 중 22가지 농약에 대한 최저 검출농도와, 상기 총 22가지 농약에 대한 실제 샘플(20가지의 과채류)에서의 잔류농약 최소 검출농도를 알아보았다.

결과는 아래 표 2 및 표 3과 같다.

총 22가지 유기인계 및 카바마이트계 농약의 최저 검출농도

Pesticide	Detection Limit( ppm )	Pesticide	Detection Limit( ppm )
Aldicarb	0.75	Malathion	1.00
Bendiocarb	1.00	Methiocarb	1.25
Carbaryl	0.75	Methomyl	1.00
Carbofuran	0.75	Methyl-parathion	0.75
Diazinon	0.75	Oxamyl	1.00
Dichlorvos	0.5	Phenthoate	0.75
Ethion	1.0	Phosphamidan	1.25
Ethoprophos	0.5	Pirimicarb	1.25
Fenitrothion	0.5	Propoxur	0.75
Guthion	0.75	Thiobencarb	1.00
Isoprocarb	0.75	Zolone	0.75

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 상기 22가지 농약 standard의 최저 검출농도는 0.5 ~ 1.25ppm인 것을 알 수 있었다.

총 22가지 농약에 대한 샘플(20가지의 과채류)에서의 잔류농약 최소검출농도

	Zolone	Aldicarb	Bendiocarb	Carbaryl	Carbo- furan	Diazinon	Dichlorvos	Ethion	Etho prophos	Fenitrothion	Guthion
고추 (Green) Pepper (Fresh)	0.75	0.75	1.0	1.0	0.75	0.75	0.5	2.0	0.5	2.0	0.75
들깻잎 (Perilla Leaves)				0.75			1.5			0.50
마늘 (Garlic)							0.5
밀감 (Mandarin)
배(Pear)		1.0
배추 (Korean Cabbage)		0.75						1.0
복숭아 (Peach)		1.0	1.5			1.00
사과 (Apple)		0.8	1.0	1.0		0.75				0.75
상추 (Korean Lettuce)		0.75
양배추 (Cabbage)
양상추 (Lettuce)				0.75
양파 (Onion)				1.0						0.5
오렌지 (Orange)		0.8			1.5	1.00		2.0
오이 (Cucumber)	1.0			0.75	0.75			1.0
자두(Plum)				1.0				2.0
키위(Kiwifruit)	1.5	1.0	1.5			0.75		1.0
파 (Welsh Onion)		0.75	1.0
포도 (Grape)		0.8		0.75				2.0		0.75
피망 (Sweet Pepper)		0.75		1.0				1.0
호박 (Squash)								1.0		0.5

	Isoprocarb	Malathi-on	Methiocarb	Methomyl	Methyl-parathion	Oxamyl	Phenthoate	Phosphamidan	Pirimicarb	Pro poxur	Thiobencarb
고추 (Green) Pepper (Fresh))	0.75	1.0	1.25	1.00	0.75	2.0	0.75	1.25	1.25	0.75	1.25
들깻잎 (Perilla Leaves)
마늘 (Garlic)
밀감 (Mandarin)
배 (Pear)						2.5
배추 (Korean Cabbage)						1.5
복숭아 (Peach)			5.0	1.25		1.0
사과 (Apple)			1.25			2.5					1.0
상추 (Korean Lettuce						2.0
양배추 (Cabbage)
양상추 (Lettuce)		2.0		1.0
양파 (Onion)		1.0				1.0
오렌지 (Orange)				1.25		5.0		1.5
오이 (Cucumber)						1.5
자두 (Plum)				1.0		1.0		1.25
키위(Kiwifruit)
파 (Welsh Onion)		2.0		1.25
포도 (Grape)									1.5
피망 (Sweet Pepper)		1.0		1.0	1.0	2.5			2.0
호박 (Squash)						2.0			1.5

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 총 22가지 유기인계 및 카바마이트계 농약에 대한 실제 샘플에서의 잔류농약 최소 검출농도는 0.5 ~ 5.0 ppm이라는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 의해 제작된 잔류농약 검정키트는 농약에 민감하게 반응하는 꿀벌의 AChE를 항체-항원 친화성을 이용하여 효과적으로 부착함으로써, 유기인계 및 카바마이트계 농약을 신속하고 간단하게 검증할 수 있을 뿐만 아니라, 잔류농약 기준최저검출농도를 기준으로 상대적인 비교가능하여 간단하게 정량하는 것이 가능했다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 꿀벌유래 AChE가 항체-항원 친화성을 이용하여 진단키트에 효율적으로 부착되어 있어, 유기인계와 카바메이트계 잔류농약을 간단하고 신속하게 진단할 수 있으며, 동시에 키트에 나타난 노란선의 개수 및 농도로 잔류농약의 최저검출농도기준에 대한 간단한 정량까지 가능한 효과가 있다. 또한, 휴대가 용이하므로 장소에 구애받지 않고 사용할 수 있으며, 분석관련 시약을 간단하게 튜브화함으로써 단계를 더욱 간소화하는 효과가 있다.

Claims

정제된 꿀벌 AChE(acetylcholinesterase)와 상기 꿀벌 AChE에 특이적으로 결합하는 AChE 항체의 혼합용액이 코팅 버퍼(coating buffer) 및 블록킹 버퍼(blocking buffer)를 통해 흡착되어 있는 스트립 디스크 멤브레인(strip disk membrane), 잔류농약 검출반응을 확인할 수 있는 발색제, 대조창 및 검정창을 포함하는 꿀벌 AChE 및 그 항체를 이용한 유기인계 및 카바마이트계 잔류농약 진단키트.
제1항에 있어서, 상기 꿀벌 AChE는 DEAE 셀룰로오스 크로마토그래피(DEAE Cellulose Chromatography), 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography) 및 FPLC를 단계적으로 행하여 정제된 것을 특징으로 하는 잔류농약 진단키트.
제1항에 있어서, 상기 AChE 항체는 토끼에서 유래된 AChE IgG인 것을 특징으로 하는 잔류농약 진단키트.
제1항에 있어서, 상기 스트립 디스크 멤브레인(strip disk membrane)은 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose)인 것을 특징으로 하는 잔류농약 진단키트.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 AChE와 AChE IgG는 2:1로 혼합하는 것을 특징으로 하는 잔류농약 진단키트.
제1항에 있어서, 상기 코팅 버퍼(coating buffer)는 카보네이트 버퍼(carbonate buffer)인 것을 특징으로 하는 잔류농약 진단키트.
제6항에 있어서, 상기 카보네이트 버퍼(carbonate buffer)의 최적 pH는 9.6인 것을 특징으로 하는 잔류농약 진단키트.
제1항에 있어서, 상기 발색제는 0.075M ATC(Acetylthiocholine iodide)와 0.01M DTNB[diothio-bis-(2-nitrobenzoic acid)]를 혼합한 용액인 것을 특징으로 하는 잔류농약 진단키트.
제1항에 있어서, 상기 멤브레인의 양단에 엽록체 흡착방지를 위한 글래스 필터(glass filter)를 포함하는 잔류농약 진단키트.
삭제
제1항에 있어서, 상기 유기인계 농약은 포스파미돈(Phosphamidon), 메틸 파라티온(methyl parathion), 에티온(ethion), 구티온(guthion), 디아지논(diazinon), 디클로르보스(dichlorvos), 말라티온 (malathion), 졸론(zolone), 페니트로티온 (fenitrothion), 펜토에이트(phenthoate) 및 에토프로포스(ethoprophos)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 잔류농약 진단키트.
제1항에 있어서, 상기 카바메이트계 농약은 알디카브(aldicarb), 메티오카브(methiocarb), 벤디오카브(bendiocarb), 메토밀(methomyl), 카바릴 (carbaryl), 옥사밀(oxamyl), 카르보푸란(carbofuran), 피리미카브(pirimicarb), 이소프로카브(isoprocarb), 프로폭서(propoxur) 및 티오벤카브(thiobencarb)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 잔류농약 진단키트.