CN106841623A - 一种荧光分析方法和装置 - Google Patents

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李久彤
周雪雷
田晓峰
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Abstract

本发明涉及一种检测待测物的检测方法和基于所述检测方法的检测装置，本发明提供一测试片，所述测试片包括：加样区、测试区、质控区、和吸水区；将可能含有待测物的测试样本与第一测试液进行混合，形成第一混合液；将第一混合液滴加于所述测试片的加样区，使得所述混合液向所述吸水区流动，并流经所述的测试区和质控区；基于所述测试区的荧光值的变化，并结合质控区的检测结果，获得所述测试样本中待测物存在与否和/或数量的结果。

Description

一种荧光分析方法和装置
技术领域
本发明涉及检测检验技术领域，具体地涉及一种基于测量荧光强度的分析方法和装置。
背景技术
有机磷与氨基甲酸脂类杀虫剂在农业种植领域运用广泛，占杀虫剂用量的70％以上。随着无公害农产品的开发，农药在蔬菜水果中的残留问题已引起人们的普遍关注。如何实现对农产品、食品和环境中农药残留的快速、准确、灵敏检测是控制化学农药施用的关键之一。目前常用的快速检测法---酶抑制法，是根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性之原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘化乙酰硫代胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就不被抑制，实验中加入的底物就能被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应产生黄色物质。如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。用分光光度计测定吸光值，根据计算出的抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。
但在实际应用中，还存在诸多问题，如：乙酰胆碱酯酶工作液不能常温保存，只能放于冰箱，使用中容易失活，影响检测结果的可靠性；在测量吸光度时容易受叶绿素等色素的干扰，易产生假阳性，为消除色素干扰，需使用活性炭或硅藻土，操作繁琐。
1990年，Beggs等综合胶体金和免疫分析技术，建立了胶体金免疫层析法(GICA)，用于检测人尿和血清中的HCG(BEGGS M，NOVOTNY M，SAMPEDROS.A selfperforming chromatographic immunoassay for the qualitative determinationof human chorionicgonadotrophin(HCG)in urine and serum[J].Clin Chem，1990，36：1084-1085)。由于GICA性质稳定、可室温存放、使用方便，此后20多年，GICA在人类医学诊断、兽医以及食品安全监测等领域得到广泛应用，但主要是定性检测。近来有研究人员试图用GICA法检测农药残留，目的在于为了克服酶抑制法检测农药残留的缺陷，由于很难得到针对农药分子的特异性抗体，所以未有明显进展。
因此，本领域急需稳定性好、灵敏度高、使用方便同时又抗色素干扰且无须针对农药的特异性抗体的免疫层析检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于荧光淬灭原理的农药残留检测方法和装置。
在本发明的第一方面，提供了一种检测待测物存在与否和/或数量的免疫分析方法，包括步骤：
(a)提供一测试片，所述测试片包括：加样区、测试区、质控区、和吸水区，
其中所述的测试区包含用于捕获乙酰胆碱酯酶的第一捕获剂，而所述的质控区包含用于捕获质控物质的第二捕获剂；
(b)将可能含有待测物的测试样本与第一测试液进行混合，形成第一混合液，其中第一测试液含有：乙酰胆碱酯酶和任选的质控物质，其中所述的乙酰胆碱酯酶被吸光物质标记；而所述的待测物选自下组：有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、或其组合；
(c)将第一混合液滴加于所述测试片的加样区，使得所述混合液向所述吸水区流动，并流经所述的测试区和质控区；和
(d)基于所述测试区的荧光值的变化，并结合质控区的检测结果，获得所述测试样本中待测物存在与否和/或数量的结果。
在另一优选例中，所述的质控物质是质控抗体。
在另一优选例中，所述的质控抗体标记有可检测标记物。
在另一优选例中，所述的可检测标记物包括：胶体金、荧光团、发光团、或其组合。
在另一优选例中，所述胶体金的粒径为20-40nm。
在另一优选例中，所述的质控抗体被吸光物质或淬灭剂所标记。
在另一优选例中，所述的测试区具有背景荧光、或任选地添加了产生荧光的物质。
在另一优选例中，所述的质控区具有背景荧光、或任选地添加了产生荧光的物质。
在另一优选例中，所述的测试区具有背景荧光并且不添加额外的产生荧光的物质。
在另一优选例中，所述的质控区具有背景荧光并且不添加了额外的产生荧光的物质。
在另一优选例中，在步骤(d)中，基于测试区的荧光值的下降，获得所述测试样本中待测物数量的定量结果。
在另一优选例中，在步骤(d)中，基于标准曲线或下列公式I和II，得出所述测试样本中待测物数量的定量结果：
C测试＝k×Δ荧光值 I
Δ荧光值＝Y测试－Y0 II
式中，
C测试为测试样本中待测物的浓度；
k为常数(可通过实验确定)；
Y测试为测试所述测试样本时获得测试区的荧光值；
Y0为未添加所述测试样本或第一混合液时测试区的空白荧光值。
在另一优选例中，所述的荧光物质选自下组：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点和稀土元素离子(如Eu3+)及其螯合物。
在另一优选例中，所述的待测物选自下组：氯吡硫磷、敌敌畏、涕灭威、或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测待测物存在与否和/或数量的试剂盒或试剂组合，包括：
(i)一测试片，所述测试片包括：加样区、测试区、质控区、和吸水区，
其中所述的测试区包含用于捕获乙酰胆碱酯酶的第一捕获剂，而所述的质控区包含用于捕获质控物质的第二捕获剂；
(ii)第一容器，以及位于所述第一容器中的、用于与测试样本进行混合的第一测试试剂，所述第一测试试剂为乙酰胆碱酯酶，其中所述的乙酰胆碱酯酶被吸光物质标记；
(iii)任选的第二容器，以及位于第二容器中的质控物质；
其中，所述的第一容器和第二容器是相互独立的或是同一容器；
并且，所述的待测物选自下组：有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、或其组合。
在另一优选例中，所述的待测物选自下组：氯吡硫磷、敌敌畏、涕灭威、或其组合。
在另一优选例中，所述的第一测试试剂为溶液形式或固态形式。
在另一优选例中，所述的第二测试试剂为溶液形式或固态形式。
在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是同一容器，并且所述的第一测试试剂和第二测试试剂为混合的干粉形式。
在另一优选例中，所述的质控物质是质控抗体。
在另一优选例中，所述的质控抗体标记有可检测标记物。
在另一优选例中，所述的可检测标记物包括：胶体金、荧光团、发光团、纳米金棒、纳米银或其组合。
在另一优选例中，所述胶体金的粒径为20-40nm。
在另一优选例中，所述的质控抗体被吸光物质或淬灭剂所标记。
在另一优选例中，所述的测试区具有背景荧光、或任选地添加了产生荧光的物质。
在另一优选例中，所述的质控区具有背景荧光、或任选地添加了产生荧光的物质。
在另一优选例中，所述的测试区具有背景荧光并且不添加额外的产生荧光的物质。
在另一优选例中，所述的质控区具有背景荧光并且不添加了额外的产生荧光的物质。
在另一优选例中，所述的荧光物质选自下组：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点和稀土元素离子(如Eu3+)及其螯合物。
在本发明的第三方面，提供了一种定量检测待测物的荧光测量装置，所述的装置包括：
(a)一如本发明第二方面所述的试剂盒或试剂组合；和
(b)一用于检测荧光强度的检测器。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有使用说明书，所述说明书描述了本发明第一方面所述的方法。
在另一优选例中，所述装置还包括光源和计算机。
所述光源通过光导纤维照射到检测线处，激发出的荧光通过光导纤维进入检测器，由计算机进行数据处理和分析。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明方法的基本原理。
图2显示了氯吡硫磷标准曲线。
图3显示了敌敌畏标准曲线。
图4显示了涕灭威标准曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一种快速准确的农药残留检测方法。该方法不必使用针对目标小分子(即农药)的特异性抗体。与之相反，本发明方法采用荧光淬灭原理并且使用乙酰胆碱酯酶及其捕获剂(如抗体)进行免疫检测。基于检测样品中农药的存在与否以及数量，本发明方法可灵敏地检测到相应荧光变化，从而定性或定量地获得检测结果。在此基础上，发明人完成了本发明。
在本发明方法中，不仅可以通过目测检测线的颜色来定性判断是否含有待测物，还可以通过测量其荧光强度的方式来定量检测待测物，可以直接通过淬灭物质对NC膜的自有荧光强度的影响，从而测定待测物的数量。本发明方法还对GICA进行了技术改造，使其性能得到大幅提升，由定性变为定量，同时继承了GICA原有的一切优点。本发明大大促进了农药残留检测方法的开发及应用，不仅灵敏度高，定量准确，而且操作十分简便、快捷、且成本低廉。
检测方法
本发明还提供了对所述测试片进行定量检测的方法和装置，其中可以通过含有光源和检测器的装置对对待测物进行定量检测。
本发明检测方法的基本原理如图1所示。新的免疫检测思路与改造后的GICA相结合用于农药残留检测，可以克服酶抑制法的缺陷，使农药残留检测更方便、稳定、快速、灵敏、准确。
本发明人研究发现，有机磷和氨基甲酸酯能使乙酰胆碱酯酶催化中心的丝氨酸残基中的羟基发生磷酸化和甲胺酰化，改变其化学结构，使酶失活。此外，该结构的变化还可有效地导致针对乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体与其结合能力的丧失或下降。基于此，本发明人用吸光物质或淬灭剂标记乙酰胆碱酯酶，用其单克隆抗体作为捕获抗体，构建经改造的GICA测试片。
现结合图1进一步说明本发明的基本原理：
首先构建与GICA基本相似的测试片，不同之处在于，构建前先对硝酸纤维素膜(NC)进行荧光物质标记，即图1中侧流片中部的阴影区域，该区域的任意位置荧光强度基本一致，且不随层析过程而发生改变。检测线T固定了5(抗乙酰胆碱酯酶抗体)，质控线C固定了2(质控抗体)。
上图左侧的试剂杯中含有干化的4(抗2的抗体标记荧光淬灭剂)、7(乙酰胆碱酯酶标记荧光淬灭剂)混合物，将液体样本加入其中复溶干化混合物并反应一段时间。
(i)若样本中不含有机磷和氨基甲酸酯类农药：6(乙酰胆碱酯酶)的结构未改变，可被5正常识别并捕获，吸取试剂杯中的液体加到样品垫上，在向前层析的过程中，检测线处形成复合物8(5和7形成复合物)，质控线处形成复合物9(2与4形成复合物)，NC膜此两处的荧光淬灭。
(ii)若样本中含有机磷和氨基甲酸酯类农药：6(乙酰胆碱酯酶)的结构被破坏，5不能正常识别6并捕获之，吸取试剂杯中的液体加到样品垫上，在向前层析的过程中，检测线处不能形成复合物8，此处NC膜的荧光未淬灭，但质控线处仍形成复合物9，此处NC膜的荧光淬灭。测量检测线处的荧光强度可确定两类农药的残留量，也可肉眼观察检测线处颜色的深浅进行定性或半定量判断。
农药残留物
目前在蔬菜生产中使用的农药主要有以下几类：
一是有机磷农药，主要有乐果、敌百虫、敌敌畏、内吸磷、对硫磷、马拉硫磷等60余种。
二是有机氯农药，主要有林丹、七O五四、毒杀芬、氯丹等。
三是氨基甲酸酯类农药，主要有抗蚜威、克百威、西维因、残杀威、杀螟丹等。
四是拟除虫菊酯类农药，主要有氯氰菊脂(灭百可)、溴氰菊脂(敌杀死)、杀灭菌脂(速灭杀丁)等。
本发明提供的方法用于检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药。
荧光物质
用于本发明标记的荧光物质和淬灭剂应配合使用，基本原则是荧光物质的激发与发射光谱和(或)淬灭剂的吸收光谱部分或完全重叠，最优的是完全重叠，如此会有较高的检测灵敏度。
代表性的荧光物质包括(但并不限于)：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、稀土元素离子(如Eu3+)及其螯合物等组合，只要所选荧光物质的发射光谱与所选淬灭剂的吸收光谱有重叠即可。
如本文所用，术语“淬灭剂指可衰减荧光物质所发射荧光的物质。
代表性的淬灭物质包括(但并不限于)：胶体金、纳米金棒、纳米银等组合，只要所选淬灭物质的吸收光谱与所选荧光物质的激发或发射光谱重叠即可。
吸光物质(淬灭剂)
用于本发明的吸光物质应有较宽泛的紫外可见甚至红外吸收光谱，总的原则是其吸收光谱与测试片自有荧光的激发或发射光谱部分或完全重叠。最优的是完全重叠，如此会有较高的检测灵敏度。
代表性的吸光物质包括(但并不限于)：胶体金、纳米金棒、纳米银棒等组合，它们的吸收光谱范围为300-1000nm不等，只要所选吸光物质的吸收光谱与测试片自有荧光激发或发射光谱重叠即可。
胶体金颗粒可用任何常规方法制造，例如总结于G.Frens,1973 NaturePhysical Science,241:20(1973)中的方法。其他方法描述于美国专利No.5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775。
如本文所用，术语“纳米金棒”指具有一定纵横比、且横轴和纵轴处于5-200纳米范围的金颗粒。
一种特别优选的吸光物质是胶体金，尤其是粒径为20-40nm的胶体金。
捕获抗体和固相载体
本发明中，所述捕获抗体为抗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，固相载体为硝酸纤维素膜。
荧光淬灭原理
含吸光物质标记的物质被检测线的捕获试剂捕获后，会在检测线处富集，当测试片自有荧光的激发或发射光谱与该吸光物质的吸收光谱全部或部分重叠时，因共振能量转移，吸光物质会对测试片自有荧光产生淬灭作用，即淬灭检测线的荧光强度。
检测装置
本发明中，所述检测可以包括：测试片、检测器、光源、光导纤维和计算机。还可以包括一份检测方法的使用说明。其中测试片的工作原理如上所述，荧光强度的检测方法可以如下所述(但不仅限于此)，任何可用于检测荧光强度的方法均可用于本发明的检测装置。
荧光强度的检测
光源通过光导纤维照射到检测线处，激发出的荧光通过光导纤维进入检测器，所得到的数据由计算机进行处理和分析。
所述光导纤维可以是Y型的，分别连接于光源、检测线和检测器。
本发明中，光源用于提供某一发射波长的光线，从而激发荧光物质发出荧光。可选用任何可以提供合适波长的光源，包括(但不限于)：LED、氙灯、卤钨灯、激光等。
一种优选的光源是激光光源，激光光源可用本领域常规的方法和设备(如激光器)产生。代表性的激光器包括(但并不限于)：半导体激光器、氦氖激光器、氩离子激光器、还包括波长可选的激光器、多波长激光器和双波长激光器等。
激光器产生的激光波长与激光介质有关，常见的激光波长见下表1：
表1常见的激光波长
激光种类 波长(纳米)
氩氟激光(紫外光) 193
氪氟激光(紫外光) 248
氙氯激光(紫外光) 308
氮激光(紫外光) 337
氩激光(蓝光) 488
氩激光(绿光) 514
氦氖激光(绿光) 543
氦氖激光(红光) 633
罗丹明6G染料(可调光) 570-650
694
钕-钇铝石榴石(近红外光) 1064
本发明中的检测器可以是(但不限于)光电倍增管、CCD或光电池等。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明方法克服了酶抑制法检测农药残留的缺陷，不必使用针对目标小分子(即农药)的特异性抗体。
(2)本发明方法采用荧光淬灭原理并且使用乙酰胆碱酯酶及其捕获剂(如抗体)进行免疫检测，由定性变为定量。
(3)本发明大大促进了农药残留检测方法的开发及应用，不仅灵敏度高，定量准确，而且操作十分简便、快捷、且成本低廉。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
测试片
应注意，测试片的具体构造可以变化，这取决于意图用测试片来进行的具体测试。在实施例之外制造测试片的变动方法，也落于本发明范围之中。
如图1所示，测试片可包括背衬片，其长度与测试片相同。
加样区位于测试片的一端，样品垫位于加样区，可通过粘合剂粘贴于加样区。
吸收区位于测试片的另一端，在加样区的远端，吸水垫片位于吸收区。
结合区位于加样区和吸收区之间，在加样区的近端和吸收区的远端，结合垫片位于结合区。
测试区(也称检测线T)位于结合区和吸收区之间，通常测试区设置在膜片上，通过所述膜片连接结合垫和吸水垫。优选地，所述膜片上还设置有对照区(也称质控线C)，对照区位于测试区和吸收区之间，也可以位于测试区和结合区之间，并与测试区之间有适当的空间。
测试片制造方法，优选地，分别将样品垫片、结合垫片、膜片、吸水垫片通过粘合剂粘贴于背衬板上，即得所述测试片。
背衬片可以用任何稳定的、无孔的材料制成，其强度应足以支承材料和粘于其的测试片。因为许多测定用水作为扩散介质，因此背衬片较佳地是基本上不透水的。在一个优选例中，背衬片是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的(如PVC胶板)。
样品垫片可用任何吸收性材料制成。可使用的材料例子包括：纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜。
结合垫片或膜片可以用任何材料制成，只要该材料有足够孔隙度从而允许在表面和内部发生流体的毛细管作用。结合垫片或膜片应有足够的孔隙度，从而允许涂有抗体或抗原的颗粒移动。结合垫片或膜片还可被含待检测分析物的样品中所用的液体润湿(例如，对于水性液体具有亲水性，对于有机溶剂具有疏水性)。通过例如在美国专利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(这些方法描述了将疏水表面转变成亲水表面)，可以改变其疏水性从而使其具有亲水性以便用于水性液体。可用于制造结合垫片或膜片的材料例子包括：聚脂膜、纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一个优选例中，结合垫片是用聚脂膜制成的，膜片是用硝酸纤维素制成的。
吸收垫片可以用任何能吸收作为样品和缓冲液的液体的材料制成。吸收垫片的吸收能力应足够大，以便吸收添加至测试片的液体。适用于吸收垫片的材料的例子包括纤维素和玻璃纤维。
测试片中硝酸纤维素膜(NC)荧光
在另一优选例中，所述的测试区具有背景荧光、或任选地添加了产生荧光的物质。
在另一优选例中，所述的质控区具有背景荧光、或任选地添加了产生荧光的物质。
在另一优选例中，所述的测试区具有背景荧光并且不添加额外的产生荧光的物质。
在另一优选例中，所述的质控区具有背景荧光并且不添加了额外的产生荧光的物质。
试剂和设备：
针对乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，自制；
乙酰胆碱酯酶，市售品
30nm的胶体金，市售品；
硝酸纤维素膜(NC)，市售品；
图1中的质控抗体(Ab)和抗质控抗体(Anti-Ab)的抗体均为自制；
小牛血清白蛋白(BSA)，市售品；
检测器：USB4000-FL(美国海洋光学公司)；
光源：532nm激光光源。
实施例1：生菜中氯吡硫磷(有机磷类)残留的检测
1、纳米金标记乙酰胆碱酯酶及抗质控抗体的抗体
1.1胶体金-抗体保存液
四硼酸钠 0.1g
小牛血清白蛋白(BSA) 0.25g
0.025g
加水溶解后用6N HCl调pH至7.4，补水至250ml，用0.45μm滤膜过滤后，4-8℃保存。
1.2工作液
6.1g
NaCl 8.5g
PVP40 5.0g
硼酸 2.1g
PEG 1.0g
10％BSA 50ml
0.2g
加水溶解后用6N HCL调pH至7.0-7.5，补水至1000ml，用0.45μm滤膜过滤后，4-8℃保存。
1.3纳米金标记乙酰胆碱酯酶(Gold-Ache)
1.3.1取20-30nm颗粒胶体金液20ml，在磁力搅拌下缓慢加入已Ache1.0ml(0.6mg/ml)，在室温下搅拌30min；
1.3.2加10％的BSA 0.8ml(终浓度0.4％)，室温搅拌5min；
1.3.3加10％的PEG 0.4ml(终浓度0.2％)，室温搅拌5min；
1.3.4 12000-15000r/min离心60-40min，小心吸离心上清，沉淀溶于0.5ml保存液中，得到Gold-Ache，光密度(O.D)约为100O.D，其中Ache的浓度为1mg/ml，置4℃保存备用；
1.4纳米金标记抗质控抗体的抗体(Gold-anti-Ab)
同1.3操作，得到光密度(O.D)约为100O.D的Gold-anti-Ab。
1.5分别将上述Gold-Ache和Gold-anti-Ab用工作液稀释至光密度为5O.D，分别取10μL加入酶标板同一微孔中混匀，减压干燥后密封保存，得干化的荧光淬灭剂。
2、抗Ache单克隆抗体及质控抗体的固定
2.1配制pH7.4的磷酸盐缓冲液，分别稀释Ache单克隆抗体和质控抗体至0.5mg/ml的浓度；
2.2按图1构建荧光标记的测试片；
2.3用划膜仪分别将Ache单克隆抗体和质控抗体溶液划于图1测试片中的T线和C线位置，37℃烘干过夜。
3、标准曲线制备
3.1用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制氯吡硫磷系列标准溶液(浓度见表2)；
3.2分别取表2中6种浓度的标准溶液各100μL，加入干化的荧光淬灭剂，使其复溶，得6只检测液；
3.3取6只测试片，水平放置，分别在各样品垫上加检测液60μl；
3.4 10min后，分别测定各测试片上检测线处及检测线与质控线中间处575nm的荧光强度(F1、F2)，计算F2/F1的值，数据见表2，标准曲线见图2。
表2：氯吡硫磷标准系列浓度与相应荧光强度比值
标准系列浓度(mg/kg) 荧光强度(F1) 荧光强度(F2) F2/F1
0 21080 7669 0.3638
0.05 20913 8725 0.4172
0.1 20304 9746 0.48
0.2 20930 12104 0.5783
0.5 20984 15151 0.722
1 21548 19288 0.8951
以浓度C为横坐标、F2/F1为纵坐标作标准曲线，见图2。
对应的曲线方程为：F2/F1＝(A1-A2)/[1+(X/X0)P]+A2，其中：
A1＝0.3601，A2＝1.4052，X0＝11.8661，p＝0.8709
4、生菜中氯吡硫磷残留的检测试验
4.1选取有代表性的生菜样品1kg，反复冲洗浸泡，阴干，使其表面没有水分。
4.2用48％的毒死蜱乳油对水稀释4000倍，均匀喷洒于洗净的生菜表面，隔夜阴干；
4.3将喷洒了农药的生菜叶剪成1cm左右碎片，取样品1g，放入烧杯中，加入5ml pH7.4PBS缓冲液，振荡1-2min，倒出提取液，静置1-2min，待用。
4.4取4.3的提取液100μl，加入干化的荧光淬灭剂，使其复溶，得检测液；取60μL检测液加于测试片的样品垫，10min后，分别测定测试片上检测线处及检测线与质控线中间处575nm的荧光强度(F1、F2)，计算F2/F1的值，将F2/F1带入曲线方程中算的生菜样品中的氯吡硫磷浓度为0.13mg/kg；
4.5重复“4.1-4.4”试验，但4.2中的稀释倍数为2000倍，最终测得氯吡硫磷浓度为0.22mg/kg；
4.6重复“4.1-4.4”试验，但4.2中的稀释倍数为1000倍，最终测得氯吡硫磷浓度为0.52mg/kg；
用高效液相色谱法(HPLC)检测以上3份提取液中的氯吡硫磷，结果分别为0.15、0.26、0.49mg/kg，本发明方法与HPLC法的检测结果符合度较高。
实施例2：菠菜中敌敌畏(有机磷类)残留的检测
“纳米金标记乙酰胆碱酯酶与抗质控抗体的抗体”及“抗Ache单克隆抗体及质控抗体的固定”同实施例1。
1、标准曲线制备
1.1用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制敌敌畏系列标准溶液(浓度见表3)；
1.2分别取表3中6种浓度的标准溶液各100μL，加入干化的荧光淬灭剂，使其复溶，得6只检测液；
1.3取6只测试片，水平放置，分别在各样品垫上加检测液60μl；
1.4 10min后，分别测定各测试片上检测线处及检测线与质控线中间处575nm的荧光强度(F1、F2)，计算F2/F1的值，数据见表3，标准曲线见图3。
表3：敌敌畏标准系列浓度与相应荧光强度比值
标准系列浓度(mg/kg) 荧光强度(F1) 荧光强度(F2) F2/F1
0 22080 12884 0.5835
0.1 20913 13317 0.6368
0.2 21304 14911 0.6999
0.4 21930 16042 0.7315
1 22984 17854 0.7768
2 21048 17594 0.8359
以浓度C为横坐标、F2/F1为纵坐标作标准曲线，见图3。
2、菠菜中敌敌畏残留的检测试验
2.1选取菠菜样品，反复冲洗浸泡，阴干，使其表面没有水分。在洗净的菠菜表面均匀喷洒敌百虫溶液，隔夜阴干；
2.2用80％乳油对水分别稀释4000倍，均匀喷洒于洗净的菠菜表面，隔夜阴干；
2.3将喷洒了农药的菠菜叶剪成1cm左右碎片，取样品1g，放入烧杯中，加入5ml pH7.4PBS缓冲液，振荡1-2min，倒出提取液，静置1-2min，待用。
2.4取2.3的提取液100μl，加入干化的荧光淬灭剂，使其复溶，得检测液；取60μL检测液，加于测试片的样品垫，10min后，分别测定测试片上检测线处及检测线与质控线中间处575nm的荧光强度(F1、F2)，计算F2/F1的值，将F2/F1带入曲线方程中算得菠菜样品中的敌敌畏浓度为0.15mg/kg；
2.5重复“2.1-2.4”试验，但2.2中的稀释倍数为2000倍，最终测得敌敌畏浓度为0.35mg/kg；
2.6重复“2.1-2.4”试验，但2.2中的稀释倍数为1000倍，最终测得敌敌畏浓度为0.74mg/kg；
用高效液相色谱法(HPLC)检测以上3份提取液中的敌敌畏，结果分别为0.12、0.29、0.69mg/kg，本发明方法与HPLC法的检测结果符合度较高。
对应的曲线方程为：F2/F1＝(A1-A2)/[1+(X/X0)P]+A2，其中：
A1＝0.5817，A2＝0.9198，X0＝0.5594，p＝0.7969
实施例3：土壤中涕灭威(氨基甲酸酯类)残留的检测
“纳米金标记乙酰胆碱酯酶与抗质控抗体的抗体”及“抗Ache单克隆抗体及质控抗体的固定”同实施例1。
1、标准曲线制备
1.1用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制涕灭威系列标准溶液(浓度见表4)；
1.2分别取表4中6种浓度的标准溶液各100μL，加入干化的荧光淬灭剂，使其复溶，得6只检测液；
1.3取6只测试片，水平放置，分别在各样品垫上加检测液60μl；
1.4 10min后，分别测定各测试片上检测线处及检测线与质控线中间处575nm的荧光强度(F1、F2)，计算F2/F1的值，数据见表4，标准曲线见图4。
表4：涕灭威标准系列浓度与相应荧光强度比值
标准系列浓度(mg/kg) 荧光强度(F1) 荧光强度(F2) F2/F1
0 10087 6468 0.6412
0.1 10108 7469 0.7389
0.2 10304 8305 0.806
0.4 10030 8624 0.8598
1 10984 10118 0.9212
2 9989 9653 0.9664
以浓度C为横坐标、F2/F1为纵坐标作标准曲线，见图4。
对应的曲线方程为：F2/F1＝(A1-A2)/[1+(X/X0)P]+A2，其中：
A1＝0.6405，A2＝1.0112，X0＝0.2715，p＝0.9467
2、土壤中涕灭威残留的检测试验
2.1取已确认无涕灭威的土壤样品1kg，加入15％的涕灭威颗粒剂5mg后充分拌匀；
2.2称取上述土壤10g，加pH7.4的磷酸盐缓冲液100μL，振荡1-2min，静置1-2min；
2.3取2.2的上清液液100μl，加入干化的荧光淬灭剂，使其复溶，得检测液；取60μL检测液加于测试片的样品垫，10min后，分别测定测试片上检测线处及检测线与质控线中间处575nm的荧光强度(F1、F2)，计算F2/F1的值，将F2/F1带入曲线方程中算得涕灭威土壤样品中的浓度为0.065mg/kg；
2.4重复“2.1-2.3”试验，但2.1中涕灭威的加入量为10mg，最终测得浓度为0.156mg/kg；
2.5重复“2.1-2.3”试验，但2.1中涕灭威的加入量为20mg，最终测得浓度为0.289mg/kg；
用高效液相色谱法(HPLC)检测以上3份提取液中的敌敌畏，结果分别为0.071、0.171、0.296mg/kg，本发明方法与HPLC法的检测结果符合度非常高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种检测待测物存在与否和/或数量的免疫分析方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一测试片，所述测试片包括：加样区、测试区、质控区、和吸水区，
其中所述的测试区包含用于捕获乙酰胆碱酯酶的第一捕获剂，而所述的质控区包含用于捕获质控物质的第二捕获剂；
(b)将可能含有待测物的测试样本与第一测试液进行混合，形成第一混合液，其中第一测试液含有：乙酰胆碱酯酶和任选的质控物质，其中所述的乙酰胆碱酯酶被吸光物质标记；而所述的待测物选自下组：有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、或其组合；
(c)将第一混合液滴加于所述测试片的加样区，使得所述混合液向所述吸水区流动，并流经所述的测试区和质控区；和
(d)基于所述测试区的荧光值的变化，并结合质控区的检测结果，获得所述测试样本中待测物存在与否和/或数量的结果。
2.如权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于，所述的质控物质是质控抗体。
3.如权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于，所述的质控抗体被吸光物质或淬灭剂所标记。
4.如权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于，所述的测试区具有背景荧光、或任选地添加了产生荧光的物质。
5.如权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于，所述的质控区具有背景荧光、或任选地添加了产生荧光的物质。
6.如权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于，在所述步骤(d)中，基于测试区的荧光值的下降，获得所述测试样本中待测物数量的定量结果。
7.如权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于，所述的待测物选自下组：氯吡硫磷、敌敌畏、涕灭威、或其组合。
8.一种用于检测待测物存在与否和/或数量的试剂盒或试剂组合，其特征在于，包括：
(i)一测试片，所述测试片包括：加样区、测试区、质控区、和吸水区，
其中所述的测试区包含用于捕获乙酰胆碱酯酶的第一捕获剂，而所述的质控区包含用于捕获质控物质的第二捕获剂；
(ii)第一容器，以及位于所述第一容器中的、用于与测试样本进行混合的第一测试试剂，所述第一测试试剂为乙酰胆碱酯酶，其中所述的乙酰胆碱酯酶被吸光物质标记；
(iii)任选的第二容器，以及位于第二容器中的质控物质；
其中，所述的第一容器和第二容器是相互独立的或是同一容器；
并且，所述的待测物选自下组：有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、或其组合。
9.如权利要求8所述的试剂盒或试剂组合，其特征在于，所述的第一容器和第二容器是同一容器，并且所述的第一测试试剂和第二测试试剂为混合的干粉形式。
10.一种定量检测待测物的荧光测量装置，所述的装置包括：
(a)一如权利要求8所述的试剂盒或试剂组合；和
(b)一用于检测荧光强度的检测器。
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