CN1321194C - 农药残毒检测试剂盒、其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种农药残毒检测试剂盒、其制备方法和用途。所述试剂盒包括乙酰胆碱酯酶、保护剂、底物与显色剂，其中采用的乙酰胆碱酯酶是从敏感家蝇品系头部得到对农药高度敏感的单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶。该试剂盒可常温保存，当用于检测蔬菜或水果上残留的农药时，对农药具有高的敏感度和测定准确度。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种农药残毒检测试剂盒，尤其是一种包含单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶的农药残毒检测试剂盒；本发明还涉及该种试剂盒的制备方法及应用。
【技术背景】
目前，在粮食、蔬菜、水果种植过程中普遍使用农药，农产品不可避免地带有残留的微量农药，而农药对人们的健康有危害是不言而喻的。随着生活水平的提高，人们对食品安全越来越重视，因此，农产品上的农药残留问题日益为人们所关注。
对每个蔬菜、水果样本都进行仪器分析是不可能的，因此，人们迫切需要一种可对大量蔬菜、水果样本进行快速初筛的手段来保证农产品上的农药残毒在国家允许安全范围内。
农药残毒快速检测技术方面的研究已有报道。在仪器方面，对分光光度计进行改装使之适合酶抑制法检测的要求，成为专用仪器(如北京瑞利、上海光电所等)。在利用现有酶和仪器配合实际应用方面，农业部农药检定所等已经制定了利用丁酰胆碱酯酶检测农药残毒的标准。但采用仪器检测的方法仍然不能满足低成本、快速检测的市场需要。
有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂是被广泛普遍使用的农药种类，它们主要毒理机制是抑制乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的活性，造成乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)的积累，影响了正常的神经传导，使昆虫中毒而致死。
对于上述二类农药，目前有包括上面提到方法之内的多种方式进行检测，其中酶抑制法检测是最主要的方法之一。酶检测方法中所采用的酶主要有二种，其一，植物酯酶，参见CN1366065A、CN1293363A、CN1279292A；其二，胆碱酯酶，例如，乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶，参见CN1349094A、CN1224160A。但目前的酶法检测存在假阳性率偏高，对有些农药灵敏度不够的缺陷。
依据酶抑制法原理检测农药残毒的手段有试纸法、比色法、固定化酶法(酶电极或酶芯片，也有人称生物传感器)。无论何种方法，酶是决定检测方法灵敏度和可靠性的最关键因素。酶对常用有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感度决定了方法的灵敏度，酶的种类决定了方法的可靠性。
本发明者对用于酶抑制法的有关酶系，如酯酶(包括动物源和植物源的)、丁酰胆碱酯酶、乙酰胆碱酯酶等进行了比较研究证实，乙酰胆碱酯酶能够专一性的被有机磷和氨基甲酸酯类农药抑制，用其检测这两类农药比丁酰胆碱酯酶、羧酸酯酶等具有明显的专一性和可靠性，检测结果的假阳性率也明显低于其它酶系，就综合指标而言，乙酰胆碱酯酶用于农药残毒快速检测优于其它酶系。
但是，现在用于农药残毒快速检测试剂盒中乙酰胆碱酯酶存在的关键问题是如何提高酶的敏感度和延长酶的常温保存时间。
本发明者通过深入细致的研究发现，不同来源的乙酰胆碱酯酶对农药敏感度不同，采用室内的敏感家蝇进行了育种工作可使其对农药的敏感度进一步提高，另外，通过添加保护剂，使之与酶配合，可以延长酶的常温保存时间，于是完成了本发明。
【发明内容】
本发明的目的提供一种敏感度高、并可在常温下保存的农药残毒检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种农药残毒检测试剂盒的制备方法。
本发明的再一目的是提供所述农药残毒检测试剂盒用于检测农产品中的农药残毒的应用。
本发明采用如下技术方案：
本发明的农药残毒检测试剂盒，其特征在于，它包括单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶、保护剂、底物和显色剂。
其中，所述的单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶是从敏感家蝇品系头部分离纯化得到的；保护剂为糖和/或蛋白质；底物为乙酰硫代胆碱或丁酰硫代胆碱，显色剂为二硫双硝基苯甲酸。所述的保护剂与乙酰胆碱酯酶的重量比为10-500∶1，优选50-200∶1。
本发明的农药残毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，试剂盒中的单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶的制备步骤包括：盐析、差速离心、凝胶过滤层析、亲和层析和冷冻干燥。
本发明所述农药残毒检测试剂盒通过采用从对农药敏感的家蝇品系头部得到的对农药高度敏感的单一型乙酰胆碱酯酶，克服了混合乙酰胆碱酯酶分子型检测农药残毒中存在的酶源对农药的敏感度低、线性关系不好、假阳性率高的问题。另外，通过添加保护剂，使之与所述的单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶配合，解决了试剂盒不能常温保存的问题。
【附图说明】
图1是敏感的单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶的纯化方法流程图。
图2是乙酰胆碱酯酶的敏感度及最适反应条件测定方法流程图。
图3是蔬菜水果样本测定方法流程图。
图4是单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶图谱。
【具体施方式】
常温保存需要用保护剂，保护剂为糖和/或蛋白质。本发明中可以选用的糖选自例如蔗糖、环糊精和甘露醇及其混合物，优选三者的混合物。可以选用的蛋白质为例如牛血清蛋白。保护剂与乙酰胆碱酯酶的比例为10-500∶1，优选为50-200∶1，最优选为100∶1，可得到能在常温下保存的试剂盒。可以利用保护剂(如环糊精)的网架结构可固定分子型乙酰胆碱酯酶。
底物可以是常规的乙酰胆碱，例如卤代乙酰胆碱，如氯化乙酰胆碱、溴化乙酰胆碱，卤代硫代乙酰胆碱，如溴化硫代乙酰胆碱或碘化硫代乙酰胆碱，乙酰硫代胆碱或丁酰硫代胆碱，优选乙酰硫代胆碱或丁酰硫代胆碱。
显色剂可以是DTNB(二硫双硝基苯甲酸)。
参见图1。在本发明中，采用的家蝇品系主要是通过家蝇同胞培养技术培育出的农药敏感品系。利用该品系，通过盐析、差速离心、凝胶过滤层析、亲和层析、冷冻干燥等步骤，从敏感家蝇品系头部分离纯化对农药高度敏感的单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶。具体纯化路线可参见图1和实施例。
将按上述步骤收集得到的干粉(即，乙酰胆碱酯酶酶粉，下称酶粉)与保护剂，例如蔗糖、环糊精与甘露糖的混合物，优选为蔗糖∶环糊精∶甘露醇＝1∶4∶5的混合物，按例如1∶100(w/w)混合，固化后即为检测试剂盒的酶源(A)；将底物与显色剂组合，即得到试剂盒的显色源(B)。A、B和缓冲液一起经包装后即得农药残毒检测试剂盒。
在具体的实施方案中，可以将敏感家蝇品系通过液氮速冻2分钟，取出后用振荡器将其头部与身子分开，在通过筛子将头与身子分离。将得到的头部用组织剪碎机剪碎，过滤后差速离心，盐析、脱盐、蔗糖密度梯度离心、亲和层析、冻干得到对农药敏感的单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶，该酯酶通过非变性凝胶电泳检测为单一条带，参见图4。按照上述的成份及比例，通过对酶浓度、底物浓度、显色剂浓度的调整使光密度值在0.6/分以上。
本发明试剂盒的用途是检测蔬菜或水果上残存的农药，特别是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，将本发明试剂盒中的乙酰胆碱酯酶加入到蔬菜或水果样本进行检测，检测时，酶活性降低则样本中含有农药残毒，反之则无毒。
本发明采用从混合型乙酰胆碱酯酶中分离对农药敏感的单一分子型或纯化的单聚体乙酰胆碱酯酶克服了混合分子型敏感度低、误差大、假阳性率高的缺陷；另外，通过添加保护剂，将之与酶配合，使试剂盒能在常温保存。
本发明可以广泛应用于各种蔬菜水果的快速农药残毒检测，其推广和应用可以大大减少或避免因食物(含蔬菜、水果)引起的农药急性中毒的发生以及出口存在的农药残毒超标问题。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
将敏感家蝇头部经液氮冷冻后分离，按家蝇头与匀浆液(pH7.5，0.1mol/L)1∶5比例放入匀浆机中匀浆。匀浆经1000g、10000g和100000g差速离心后，取上清液用硫酸铵沉淀(50～60％饱和度)，再用G25柱脱盐。脱盐后，冷冻干燥制成干粉。将干粉溶解在缓冲液(pH7.5，0.1mol/L)中(w/v：1∶1)通过G200层析柱和亲和层析柱，收集含活性洗脱液冷冻干燥后得干粉，即为乙酰胆碱酯酶酶粉。将酶粉与保护剂(蔗糖∶环糊精∶甘露醇＝1∶4∶5)按1∶100(w/w)混合，固化后即为检测试剂盒的酶源(A)；按上述方法用底物和显色剂代替酶粉，即得到试剂盒的显色源(B)。A、B和缓冲液(pH7.5，0.1mol/L，含0.05％～0.1％的Triton X-100)，其中，3mL缓冲液(pH7.5)的反应体系中含底物和显色剂各0.6mg。经包装后即得农药残毒检测试剂盒。
实施例2
将敏感家蝇头部经液氮冷冻后分离，按家蝇头与匀浆液(pH7.5，0.1mol/L)1∶5比例放入匀浆机中匀浆。匀浆经1000g、10000g和100000g差速离心后，取上清液用硫酸铵沉淀(50～60饱和度)，再用G25柱脱盐。脱盐后，冷冻干燥制成千粉。将干粉溶解在蒸馏水中(w/v：1∶1)，通过蔗糖密度梯度离心，收集10％～20％蔗糖梯度段的成分，经G200层析柱，收集含活性洗脱液冷冻干燥后得干粉，即为乙酰胆碱酯酶酶粉。将酶粉与保护剂(淀粉∶环糊精∶甘露醇＝1∶5∶5)按1∶150(w/w)混合，固化后即为检测试剂盒的酶源(A)；按上述方法用底物和显色剂代替酶粉，即得到试剂盒的显色源(B)。A、B和缓冲液(pH7.5，0.1mol/L，含0.05％～0.1％的Triton X-100)，其中，3mL缓冲液(pH7.5)中含底物和显色剂各0.6mg。经包装后即得农药残毒检测试剂盒。
生物实施例1
参见图2和图3。将农药标准品用丙酮配制成母液(约100～200mg/L)，使用前用提取液(含0.05％～0.1％的Triton X-100)稀释到所需的浓度。将农药的标准品母液用提取液稀释成5～8浓度梯度，分别取3mL加入乙酰胆碱酯酶0.1mL(加入量为无抑制剂对照活性为0.8～1.0ΔOD412值/3分钟)，15分钟～30分钟(时间长短取决于药剂种类和抑制率规定标准35％或45％)后，加入底物和显色剂(各0.6mg)，在分光光度计上读取ΔOD412值/3分钟。对照用丙酮代替农药母液。每个测定独立重复3次。
按下述公式计算抑制率：
抑制率(％)＝(1-(药剂处理组ΔOD412值/3分钟)/(对照ΔOD412值/3分钟))×100
依据抑制率和对应的药剂浓度对数值作回归方程，计算抑制率35％或45％(取决于药剂的种类和抑制反应时间)对应的药剂浓度值即为敏感度，结果见下表1。
表1本发明试剂盒的乙酰胆碱酯酶对几种代表性药剂的敏感度
| 农药名称 | 敏感度 | 备注 |
| 敌敌畏 | ＜0.01mg/L | 0.01-0.05mg/L抑制率35-71％ |
| 辛硫磷 | ＜0.5mg/L | 0.5mg/L 抑制率80-92％ |
| 甲胺磷 | ＜3mg/L | 3-10mg/L 抑制率23-86％ |
| 灭多威 | ＜0.3mg/L | 0.3-0.7mg/L 抑制率91-95％ |
| 丁硫克百威 | ＜0.3mg/L | 0.15-0.7mg/L 抑制率19-65％ |
由表1可见，本发明试剂盒对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂有高度的敏感性。可以检测出低浓度的农药残毒。
生物实施例2
参见图2和图3。将农药标准品用丙酮配制成母液(约100～200mg/L)，使用前用提取液(含0.05％～0.1％的Triton X-100)稀释到所需的浓度。将农药的标准品母液用提取液稀释成表2所列出的相应浓度，分别取3mL加入乙酰胆碱酯酶0.1mL(加入量为无抑制剂对照活性为0.8～1.0ΔOD412值/3分钟)，15分钟～30分钟(时间长短取决于药剂种类和抑制率规定标准35％或45％)后，加入底物和显色剂(各0.6mg)，在分光光度计上读取ΔOD412值/3分钟。对照用丙酮代替农药母液。每个测定独立重复3次。整个试验分别设18℃、25℃和30℃处理。结果见下表2。
按下述公式计算抑制率：
抑制率(％)＝(1-(药剂处理组ΔOD412值/3分钟)/(对照ΔOD412值/3分钟))×100
表2温度对药剂敏感度的影响
(表中百分率数值为本发明试剂盒的乙酰胆碱酯酶抑制率)
| 农药名称 | 浓度(mg/L) | 温度(℃) | ||
| 18 | 25 | 30 | ||
| 马拉硫磷 | 3 | 25％ | 29％ | 28％ |
| 辛硫磷 | 0.5 | 91％ | 92％ | 89％ |
| 甲胺磷 | 3 | - | 34％ | 31％ |
| 敌敌畏 | 0.02 | 41％ | 55％ | 70％ |
| 敌敌畏 | 1 | 75.5％ | 70.0％ | 71.0％ |
| 灭多威 | 1 | 98％ | 93.3％ | 90.0％ |
| 丁硫克百威 | 0.3 | 54％ | 59％ | 62％ |
由上表2可见，温度对本发明试剂盒影响不大，本发明试剂盒可以在常温下测定出低浓度的农药特别是常用的有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂。
生物实施例3
按照实施例1制备的试剂盒在20-30℃避光条件下保存三周，采用常规方法测定其各时间点的酶活性。酶活性值单位为ΔOD412值/3分钟
表3室温保存对乙酰胆碱酯酶活性的影响(表中为3次测定的平均值)
| 时间(天) | 0 | 1 | 3 | 7 | 14 | 21 |
| 酶活性 | 1.0 | 0.9 | 1.1 | 0.8 | 1.0 | 0.9 |
由上表3可见，本发明试剂盒中的乙酰胆碱酯酶可在常温下保存三周，而不影响其酶活性，因此，可以在常温下进行农药残毒检测。
生物实施例4
表4本发明试剂盒与常规试剂比较
| 项目 | 本发明试剂盒 | 常规试剂盒 |
| 保存温度 | 常温，保存期大于2周 | 低温保存(在冰箱中) |
| 使用温度 | 室温，18-30℃ | 恒温 |
| 酶源 | 单一分子型或纯化的单聚体 | 混合型丁酰胆碱酯酶或乙酰胆碱酯酶 |
| 显色剂和底物 | 一体 | 分离 |
| 来源 | 敏感家蝇头部 | 来源多样，造成重现性差 |
由上表4可见，本发明试剂盒具有明显优于常规试剂盒的特点。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基本上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种制备单一分子型单聚体乙酰胆碱酯酶的方法，包括如下步骤：
1)将家蝇头与pH7.5的匀浆液放入匀浆机中制备匀浆；
2)匀浆经差速离心后，取上清液用50～60％饱和度的硫酸铵沉淀；
3)取沉淀经G25柱脱盐，并冷冻干燥，制成干粉；
4)将干粉溶解在pH7.5缓冲液中，通过蔗糖密度梯度离心，收集10％～20％蔗糖梯度段的液体；
5)将步骤4)收集得到的液体，通过G200层析柱和亲和层析柱，收集含有活性洗脱液，冷冻干燥后制得单一分子型单聚体乙酰胆碱酯酶干粉。
2.如权利要求1所述的方法，其中，家蝇是通过同胞培养技术培育出对农药敏感的家蝇品系。
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