CN207798850U - 可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条。该胶体金试纸条包括：PVC底板、样品结合垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；吸水垫、硝酸纤维素膜、金标结合垫和样品垫由上而下依次交叠粘贴于PVC底板上；其中，硝酸纤维素膜上自下而上设置横向检测线a、检测线b和质控线；所述检测线分别包被有三唑磷抗原和对硫磷抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；所述金标垫喷涂有纳米金标记的三唑磷单克隆抗体和对硫磷单克隆抗体。该实用新型试纸条具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速的特点，能同时检测农产品中的三唑磷和对硫磷残留，适用于现场监测和大规模、快速筛查检测。

Description

可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条

技术领域

本发明涉及农药残留免疫分析技术领域，特别是一种以纳米胶体金颗粒标记抗体的可实现同时检测对硫磷、三唑磷的快速检测试纸条。

背景技术

三唑磷、对硫磷均为高效、广谱的有机磷类杀虫、杀螨剂，具有触杀、胃毒、熏蒸等作用，对粮、棉、果、蔬菜等主要农作物上的许多重要害虫都有良好的防治效果。然而，随着有机磷农药的大面积推广及应用，其生态安全风险以及对人类和其他非靶标生物的安全隐患也备受关注，特别是与食品安全相关的急性毒性和残留毒性问题。近年来一些剧毒、高毒的农药品种，如甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷等农药，相继被禁止在蔬菜和水果上使用。因此研发有机磷农药残留的快速检测方法与技术具有重要的现实意义。

检测有机磷农药残留的方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱联用法（GC/MS）、液相色谱质谱联用技术（LC/MS）和酶联免疫吸附法(ELISA)等。这些方法较为准确、灵敏，但需要复杂的操作过程与技术培训，只有在专业实验室，专门从事仪器分析的人员才能进行检测，不能满足现场的快速、高通量检测，特别是在对大量样品进行低成本快速筛选时，优势不足。

胶体金免疫层析技术是20世纪80-90年代发展起来的一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法。其原理是以条状纤维层析材料为固相，借助毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体 ( 如抗体或抗原 ) 发生高特异、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过直接目测的胶体金标记物而得到直观的实验结果。

现有免疫检测试纸条多为单条检测线，单个检测对象，检测对象单一，当参照国家标准需要对多个农药残留对进行监测时，需要分别研发相应的检测试纸条分别进行检测，无法满足对农产品中有机磷农药多残留检测的需求，因此迫切需要一种能快速、同步检测多种农药的快速检测技术产品。

发明内容

本实用新型的目的在于研发一种能够同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条与方法，适用于蔬菜、水果等农产品中对硫磷和三唑磷农药残留的现场、同时快速检测与筛查。

为实现上述目的,本实用新型采用以下技术方案：

一种可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条，包括底板，样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜（NC膜）和吸水垫；其中，硝酸纤维素膜位于底板的中段，金标垫覆盖在硝酸纤维素膜的端部及对应的底板上，样品垫由底板的一端向中段延伸，其端部覆盖在金标垫的端部，吸水垫由底板的另一端向中段延伸，其端部覆盖在硝酸纤维素膜的另一端部；金标垫端部与吸水垫端部之间的硝酸纤维素膜上依次设有与底板端面平行的质控线、检测线a（T1）、检测线b（T2）；

所述金标垫是在玻璃纤维膜材料上设有含有胶体金（胶体金颗粒直径为17-20nm）标记的对硫磷单克隆抗体和胶体金（胶体金颗粒直径为17-20nm）标记的三唑磷单克隆抗体的涂层；

临近金标垫的检测线a上设有三唑磷抗原线状涂层，检测线b上设有对硫磷抗原线状涂层，临近吸水垫的质控线上设有羊抗鼠IgG抗体线状涂层；

所述底板为聚氯乙烯材料，样品垫和金标结合垫为玻璃纤维膜，吸水垫为滤纸材质。

进一步，本申请所提供的可同时检测对硫磷、三唑磷的胶体金试纸条，所述的对硫磷抗原是对硫磷半抗原与鸡卵清白蛋白的偶联物，所述的三唑磷抗原是三唑磷半抗原与鸡卵清白蛋白的偶联物。

进一步，本申请所提供的可同时检测对硫磷、三唑磷胶体金试纸条中，金标垫长8mm，宽3.5mm；硝酸纤维素膜长25mm，宽3.5mm；吸水垫长17mm，宽3.5mm；金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫各交叠区域的长度均为1mm。

本申请中，检测线a与检测线b之间的距离为3.5mm，检测线b与质控线之间的距离为4mm；检测线a和检测线b相距较近，而与质控线相距较远，避免了可能对质控线造成的污染与干扰。检测线a和检测线b之间的距离又避免了所检测的两种有机磷农药之间的相互干扰。

本申请提供的一种可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条的检测原理为竞争抑制法（如附图2、3所示）：将样品提取液滴加到样品垫，样品在毛细管作用下沿着试纸条方向（自样品垫端向吸水垫端）泳动，泳动到金标垫时，固态化的金标单抗迅速溶解释放，随样品一起沿着试纸条泳动至检测线，当样品中含有对硫磷或三唑磷农药时，则其会与相应的胶体金标记的单克隆抗体发生反应，形成免疫复合物，抑制了胶体金标记的单克隆抗体与相应检测线（T1或T2）包被的抗原的结合，使相应的检测线截获的金标抗体的量减少，T线颜色变浅或消失；当待测样品中的对硫磷或三唑磷农药的量超过该试纸条的最低检测限时（对硫磷的最低检测限是0.1µg/mL; 三唑磷的最低检测限是0.05µg/mL），则相应的检测线将不显色或完全消失，金标单抗与包被于质控线上的羊抗鼠IgG截获，形成肉眼可见的红色条带，结果为阳性；反之，若待测样品中不含有对硫磷或三唑磷农药，或含有小于该试纸最低检测限的农药时，胶体金标记的单克隆抗体与包被于NC膜上的对应的抗原发生特异性免疫反应而被截获，在检测线位置（T1或T2）形成肉眼可见的红色条带，即阴性结果，过量的金标单抗与包被于质控线上的羊抗鼠IgG截获，形成红色条带。

当质控线没有颜色时，无论检测线是否有颜色，均视为无效结果。

本申请提供的一种可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条,无需专业操作人员及任何辅助类仪器,根据反应所显现的条带几分钟内即可判定结果,操作简便、快速、结果直观准确、成本低,可实现现场检测。与现有技术相比，具有以下优点：

（1）多残留检测。本实用新型免疫层析试纸条具有两条检测线，能够在同一条试纸条上同时检测农产品中对硫磷和三唑磷的残留，与传统的单一检测试纸条及多联试纸条结构不同。

（2）操作简便快捷。本实用新型免疫层析试纸条前处理简单，结果容易判定，检测时长10-15min，可满足现场快速检测的要求；

（3）成本低，易操作。本实用新型免疫层析试纸条成本低廉，生产工艺简单，流程成熟，并且检测过程不需要任何实验设备，无需专业培训即可进行检测。

（4）适用范围广。本实用新型免疫层析试纸条适用于各种农产品和水果中对硫磷和三唑磷农药残留的快速检测。

附图说明

图1为对硫磷、三唑磷免疫层析试纸条的侧面结构示意图；

其中1为样品垫，2为金标垫，3为检测线a，4为检测线b，5为质控线，6为吸水垫，7为硝酸纤维素膜，8为PVC底板。

图2为对硫磷、三唑磷免疫层析试纸条检测原理图。

图3为对硫磷、三唑磷免疫层析试纸条检测结果判定示意图。

图4为对硫磷、三唑磷免疫层析试纸条对加标样品的检测结果示意图。

图5为对硫磷、三唑磷免疫层析试纸条的特异性检测结果示意图。

具体实施方式

本实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1 制备对硫磷、三唑磷免疫层析试纸条

如图1所示，一种可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条，包括底板8，样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜（NC膜）7和吸水垫6；其中，硝酸纤维素膜7位于底板8的中段，金标垫2覆盖在硝酸纤维素膜7的端部及对应的底板8上，样品垫1由底板8的一端向中段延伸，其端部覆盖在金标垫2的端部，吸水垫6由底板8的另一端向中段延伸，其端部覆盖在硝酸纤维素膜7的另一端部；金标垫2端部与吸水垫6端部之间外露的硝酸纤维素膜7上依次设有与底板端面平行的质控线5、检测线b（T2）4和检测线a（T1）3；

本实施例中，免疫层析试纸条是通过如下方法制备、组装的：

1.1胶体金的制备

氯金酸在还原剂的作用下，可聚合为一定大小的金颗粒，形成带负电荷的、由于静电作用而稳定的疏水胶溶液。本申请采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，制备方法见参考文献：“Li X, Li P, Zhang Q, et al. Multi-component immunochromatographic assayfor simultaneous detection of aflatoxin B1, ochratoxin A and zearalenone inagro-food[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2013, 49(22):426-432.”，过程如下：取200 mL双蒸水加入到500 mL广口玻璃瓶中，加入1mL过0.22μm滤膜的2%氯金酸溶液，顺时针方向轻轻晃动至混匀后，放置于微波炉中高火加热5 min至沸腾；取出玻璃瓶，迅速顺时针方向轻轻晃动玻璃瓶，使瓶内溶液旋转后快速加入4.8mL过0.22μm滤膜的1%柠檬酸三钠溶液，沿同一方向继续轻轻晃动玻璃瓶5s，再次放入微波炉中，高火继续加热4 min。取出玻璃瓶，此时瓶内酒红色液体即为制备的胶体金溶液；置室温冷却后，用双蒸水重新定容至200mL，混匀后避光4℃保存。此胶体金溶液是否符合生产需求，除肉眼观察颜色需要为紫红色外，还需要采用紫外可见光分光光度计分析，胶体金溶液需在可见区400nm ～ 600nm有最高吸收峰，透射电子显微镜鉴定制备的胶体金颗粒均一性较好、颗粒直径大小在17-20nm范围内。

1.2胶体金标记对硫磷单克隆抗体和胶体金标记三唑磷单克隆抗体的制备

量取50mL质量浓度为0.01%的步骤1.1制备的胶体金溶液，用K₂CO₃（0.1mol/L）溶液调节溶液pH值为8.0，搅拌状态下缓慢加入稀释浓度为1 mg/mL的对硫磷单克隆抗体（制备方法参考文献 “兰美静, 刘蕊, 郭逸蓉,等. 异源竞争ELISA法筛选有机磷农药宽谱单克隆抗体[C]// 全国农药交流会. 2014.”）300 µL或稀释浓度为1 mg/mL三唑磷单克隆抗体（制备方法参见文献：“Gui W J, Jin R Y, Chen Z L, et al. Hapten synthesis forenzyme-linked immunoassay of the insecticide triazophos.[J]. AnalyticalBiochemistry, 2006, 357(1):9-14.”）420µL，此时其抗体终浓度分别为6µg对硫磷单克隆抗体/mL纳米金溶液和8.4µg三唑磷单克隆抗体/mL纳米金溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%的BSA溶液使BSA终浓度为1%，继续搅拌30min后，1500 rpm离心15 min，留取上清，上清液继续以12000 rpm离心30 min后，弃去上清，加入洗涤保存液（0.01%硼酸，0.2%PEG₂₀₀₀₀，0.02%NaN₃）至原溶液体积；再次以12000 rpm离心30 min后，弃去上清，将沉淀用洗涤保存液重悬至体积为原溶液体积的1/10，即得胶体金标记的对硫磷单克隆抗体溶液和胶体金标记的三唑磷单克隆抗体溶液， 4℃避光保存备用。

1.3 金标垫和样品垫的预处理与制备

将金标垫（玻璃纤维膜，型号为Millipore GFCP000800）浸入金标垫处理液（20mMNa₃PO₄•12H₂O，5%BSA，0.25%Tween-20，10%蔗糖）浸湿后，37℃烘干待用；按照1:1（V/V）比例将步骤1.2制备的两种金标抗体复合物按0.002µg/mm喷涂于步骤1.3已处理好的金标垫上37℃干燥2h后，28℃保存于干燥皿中。

将样品垫（玻璃纤维膜）浸入样品垫处理液（0.01M PBS，2%BSA，2.5%蔗糖，0.02%NaN₃）浸湿后，37℃烘干。

1.4 胶体金试纸条检测区的制备（结构见图2）

在大小为60mm×3.5mm PVC底板8（型号SM31-40，购自上海金标科技生物有限公司）上，首先将硝酸纤维素膜7贴于PVC底板的中部，用Bio-dot XYZ-3050三维喷点仪中的Arijet喷膜，将对硫磷抗原（参见文献：“兰美静, 刘蕊, 郭逸蓉,等. 异源竞争ELISA法筛选有机磷农药宽谱单克隆抗体[C]// 全国农药交流会. 2014.”）、三唑磷抗原（“Gui W J,Jin R Y, Chen Z L, et al. Hapten synthesis for enzyme-linked immunoassay ofthe insecticide triazophos.[J]. Analytical Biochemistry, 2006, 357(1):9-14.”）和羊抗鼠IgG抗体（购自博士德生物工程有限公司）分别线状喷涂包被于硝酸纤维素膜7（型号为Millipore135）上，作为检测线a3、检测线b4和质控线5，检测线a3和检测线b4上的喷涂的对硫磷抗原和三唑磷抗原浓度分别为60µg/mm和30µg/mm，质控线喷涂羊抗鼠IgG抗体，浓度为40µg/mm；本实施例中，检测线a3和检测线b4之间的距离为3.5mm，检测线b4与质控线5之间的距离为4mm。

1.5 试纸条的组装

然后将步骤1.3获得的样品垫1，步骤1.4获得的金标垫2、和吸水垫（滤纸，型号为SX27，购自上海金标科技生物有限公司）6彼此重叠1mm并压紧固定于PVC底板8上，用切条机将组装好的试纸板切成3.5mm的试纸条，保存于28℃的干燥皿中，即获得所述可同时检测对硫磷、三唑磷的免疫层析试纸条。

实施例2 对硫磷、三唑磷免疫层析试纸条的灵敏度测定

用含10%（V/V，体积百分数）甲醇的PBS溶液分别稀释对硫磷和三唑磷农药标准品（天津汇迪生物技术有限公司），将其稀释为1、0.5、0.2、0.1、0.05μg/mL系列浓度，同时设立含有10%甲醇的PBS溶液作为对照组，向96孔板微孔中分别加入100µL上述稀释好的对硫磷和三唑磷农药标样溶液和对照缓冲液作为检测溶液，将实施例1制备的对硫磷、三唑磷免疫层析试纸条的样品垫端分别插入微孔中，10-15 min后观察结果。

检测结果如附图4所示：

在只含三唑磷的标准样品梯度溶液中，随着样品浓度的增加，试纸条的检测线b（T2）没有颜色变化，检测线a（T1）出现不同程度的颜色变化，通过与阴性对照，其针对三唑磷的最低检测限为0.05μg/mL；在只含对硫磷的标准样品梯度溶液中，随着样品浓度的增加，试纸条的检测线a（T1）没有颜色变化，检测线b（T2）出现不同程度的颜色变化，通过与阴性对照，其针对对硫磷的最低检测限为0.1μg/mL；在同时含对硫磷和三唑磷的混合样品溶液中，随着样品浓度的增加，试纸条的检测线a（T1）和检测线b（T2）均出现不同程度的颜色变化，通过与阴性对照，该试纸条针对对硫磷和三唑磷的最低检测限分辨为0.1μg/mL和0.05μg/mL，与检测单一农药时的最低检测限相一致。

判定原理如下：当待测样品中的对硫磷或三唑磷农药的量超过该试纸条的最低检测限时（对硫磷的最低检测限是0.1µg/mL; 三唑磷的最低检测限是0.05µg/mL），则相应的检测线将不显色或完全消失，金标单抗与包被于质控线上的羊抗鼠IgG截获，形成肉眼可见的红色条带，结果为阳性；反之，若待测样品中不含有对硫磷或三唑磷农药，或含有小于该试纸最低检测限的农药时，胶体金标记的单克隆抗体与包被于NC膜上的对应的抗原发生特异性免疫反应而被截获，在检测线位置（T1或T2）形成肉眼可见的红色条带，即阴性结果，过量的金标单抗与包被于质控线上的羊抗鼠IgG截获，形成红色条带。

当质控线没有颜色时，无论检测线是否有颜色，均视为无效结果。

本发明中的对硫磷及三唑磷胶体金试纸条检测对硫磷和三唑磷的最低检测限分别为 0.1μg/mL和0.05μg/mL。

实施例3对硫磷、三唑磷免疫层析试纸条的特异性验证

用含10%甲醇的PBS溶液分别配制乐果、辛硫磷、倍硫磷、马拉硫磷、蝇毒磷、伏杀磷、灭线磷和二嗪农8种有机磷农药溶液，使其终浓度为 1μg/mL。用实施例1获得的试纸条检测的标准方法检测，判断试纸条检测的特异性，每种浓度检测样品做3次重复。检测结果如附图5所示，均为阴性，说明该试纸条具有较好的异性。

实施例4 样品基质对试纸条的影响

测试样品：大米、苹果、包菜。

样品前处理：称取10 g粉碎(匀浆或者切碎)样品，加入10 mL乙腈震荡2 min，加入3g NaCl的离心管中，震荡3min后，4000rpm离心10min，取1 mL上清液用氮气吹干，用1 mL10%甲醇-PBS复溶后用于试纸条检测。

检测方法：分别取上述3种样品的提取液，同时设立含有10%甲醇的PBS溶液作为对照组，向微孔中分别加入100µL上述样品处理液和对照，将试纸条的样品垫端插入微孔中，静置10-15 min观察结果。

结果判断标准：

阳性结果：检测线不显色或颜色明显浅于对照线的颜色；

阴性结果：检测线颜色与对照线颜色基本一致或深于对照线的颜色；当对照线不显色时，则试纸条失效。

检测结果：

在本实施案例中，大米、苹果、包菜3种蔬菜水果样品液和含有10%甲醇的PBS溶液作为对照组检测结果均为阴性，无肉眼可见的明显差别，说明基质干扰可忽略。

实施例5 试纸条对实际样品的检测验证

利用试纸条检测大米中对硫磷、三唑磷农药残留：在大米中分别加入终浓度（对硫磷/三唑磷）为0/0, 0.1/0.05, 0.2/0.1, 0.5/0.2, 1/0.5 µg/g的对硫磷和三唑磷农药混合标样，按实施例4进行样品处理，各取1mL有机相氮气浓缩吹干，分别以丙酮复溶后于气相色谱检测（“沈荣明, 杨韶芸. 气相色谱法测定蔬菜中8种有机磷农药的残留量[J]. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(12):4982-4985.”），以10%甲醇-PBS复溶后，用于试纸条检测。

验证结果：

添加终浓度为（对硫磷/三唑磷）0/0, 0.1/0.05, 0.2/0.1, 0.5/0.2, 1/0.5 µg/g，气相色谱检测结果: 0/0，0.087/0.043，0.189/0.089，0.46/0.18，0.97/0.45µg/g；对硫磷及三唑磷胶体金试纸条检测结果均与气相色谱检测结果一致。

以上实例仅以说明本实用新型的技术方案而非限制，尽管参照较佳实例对本实用新型进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，可以对本实用新型的技术方案进行修改，但其均应涵盖在本实用新型的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条，包括底板，样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，硝酸纤维素膜位于底板的中段，金标垫覆盖在硝酸纤维素膜的端部及对应的底板上，样品垫由底板的一端向中段延伸，其端部覆盖在金标垫的端部，吸水垫由底板的另一端向中段延伸，其端部覆盖在硝酸纤维素膜的另一端部；金标垫端部与吸水垫端部之间外露的硝酸纤维素膜上依次设有与底板端面平行的质控线、检测线b和检测线a；

所述金标垫是在玻璃纤维膜材料上设有含有胶体金标记的对硫磷单克隆抗体和胶体金标记的三唑磷单克隆抗体的涂层；

临近金标垫的检测线a上设有三唑磷抗原涂层，检测线b上设有对硫磷抗原涂层，临近吸水垫的质控线上设有羊抗鼠IgG抗体涂层。

2.根据权利要求1所述的一种可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条，其特征在于，底板的材质为聚氯乙烯，样品垫和金标垫的材质均为玻璃纤维膜，吸水垫的材质为滤纸。

3.根据权利要求1所述的一种可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金颗粒的直径为17-20nm。

4.根据权利要求1所述的一种可同时检测对硫磷和三唑磷的胶体金试纸条，其特征在于，金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫交叠区域的长度为1mm，检测线a与检测线b之间的距离为3.5mm，检测线b与质控线之间的距离为4mm。