CN107727861B - 一种胃蛋白酶测定试剂盒及测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胃蛋白酶测定试剂盒及测定方法，该试剂盒包括试纸条和反应液；所述试纸条包括本体，该本体包括背衬底板，该背衬底板上设有样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水膜，该样品结合垫和吸水膜分别叠压在硝酸纤维素膜的两端上；该硝酸纤维素膜上设有检测线，该检测线包被有抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体；所述反应液含有经标记的胃蛋白酶底物。本发明利用胃蛋白酶消化蛋白质的特性使底物失去反应原性的特点，通过检测被胃蛋白酶消化后剩余的具有反应原性的底物的量来间接定性和/或定量检测胃蛋白酶，具有灵敏度好、精密度高、易于操作的特点。

Description

一种胃蛋白酶测定试剂盒及测定方法

技术领域

本发明属于胃蛋白酶检测技术领域，具体涉及一种胃蛋白酶测定试剂盒及测定方法。

背景技术

胃食管反流是指胃液等胃内容物反流至食管、咽喉乃至口腔的疾病，常引起烧心、胸痛、咽异物感、咳嗽等症状，并可由于胃液中的胃蛋白酶破坏食管、咽喉、气道黏膜，损害细胞间或细胞膜上的蛋白，引起一系列并发症，是常见的消化科疾病之一。近年来逐渐认为唾液中的胃蛋白酶检测对胃食管反流有一定的诊断参考价值，但ELISA等胃蛋白酶检测方法操作繁琐，检测时间长。因此，建立一种能够快速检测胃蛋白酶的检测手段对于辅助诊断胃食管反流具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种胃蛋白酶测定试剂盒及测定方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种胃蛋白酶测定试剂盒，包括试纸条和反应液；所述试纸条包括本体，该本体包括背衬底板，该背衬底板上设有样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水膜，该样品结合垫和吸水膜分别叠压在硝酸纤维素膜的两端上；该硝酸纤维素膜上设有检测线，该检测线包被有抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体；所述反应液含有经标记的胃蛋白酶底物。标本中胃蛋白酶消化底物后，该被消化的底物无法与抗体进行结合，即无法被检测线所捕获，即检测线的有色标记或荧光标记则减少。

一实施例中：所述胃蛋白酶底物为合成肽。

一实施例中：所述经标记的胃蛋白酶底物的标记物为有色标记或荧光标记，例如标记荧光素、胶体金、量子点、有色乳胶颗粒或荧光乳胶颗粒。

一实施例中：所述样品结合垫上含有胃蛋白酶抑制剂和pH缓冲液，用于终止胃蛋白酶催化反应及调整pH值至适合抗原抗体反应的范围。

一实施例中：还包括能够终止胃蛋白酶催化反应及调整pH值至适合抗原抗体反应的范围的终止液。

一实施例中：所述试纸条还包括壳体，所述本体设在壳体内；所述壳体上在对应样品结合垫的位置开设有加样孔；所述壳体上在对应检测线的位置开设有观察窗。

一实施例中：还包括试剂瓶，该试剂瓶内盛装有所述反应液。

一实施例中：还包括盒体，所述试纸条和试剂瓶位于盒体内。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种胃蛋白酶测定方法，包括：

1)将待测样本与反应液反应，该反应液含有经标记的胃蛋白酶底物；

2)将步骤1)的产物终止消化，剩余的经标记的胃蛋白酶底物与抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体反应，生成经标记的底物-抗体复合物；

3)检测经标记的底物-抗体复合物的量，从而对待测样本中的胃蛋白酶进行间接定性和/或定量检测。

一实施例中：应用上述的试剂盒的胃蛋白酶测定方法，包括：

1)将待测样本与所述反应液反应；

2)将步骤1)的产物滴加在所述样品结合垫终止消化，或者将步骤1)的产物与终止液混合以终止消化后滴加在样品结合垫，然后样品结合垫上的液体逐渐层析至硝酸纤维素膜的检测线，剩余的经标记的胃蛋白酶底物与检测线上包被的抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体反应，生成经标记的底物-抗体复合物；

3)检测经标记的底物-抗体复合物的量，从而对待测样本中的胃蛋白酶进行间接定性和/或定量检测。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明利用胃蛋白酶消化蛋白质的特性使底物失去反应原性的特点，通过检测一定量底物被胃蛋白酶消化后剩余的具有反应原性的底物的量来间接实现胃蛋白酶的定性定量检测，具有灵敏度好、精密度高、易于操作的特点。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明实施例1的胃蛋白酶测定试剂盒示意图。

图2为本发明实施例1和2的试纸条的本体结构示意图。

图3为本发明实施例1和2的试纸条的外观示意图。

图4为本发明实施例中检测不同浓度胃蛋白酶时得到的曲线示意图。

附图标记：试纸条A；本体10；背衬底板11；样品结合垫12；硝酸纤维素膜13，检测线131；吸水膜14；壳体20；加样孔21；观察窗22；试剂瓶B。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例1

请查阅图1至图3，一种胃蛋白酶测定试剂盒，包括盒体，盒体内设有试纸条A和试剂瓶B；

所述试纸条A包括壳体20和设在壳体20内的本体10；该本体10包括背衬底板11，该背衬底板11上设有样品结合垫12，以及硝酸纤维素膜13和吸水膜14，该样品结合垫12和吸水膜14分别叠压在硝酸纤维素膜13的两端上；该样品结合垫12为玻璃纤维素膜或聚酯膜经含有胃蛋白酶抑制剂的pH缓冲液浸泡处理后干燥而得或用该缓冲液涂布后干燥而得，其上含有胃蛋白酶抑制剂和pH缓冲液，能够终止胃蛋白酶催化反应，并将滴加在样品结合垫12上的液体的pH值调整到适合抗原抗体反应的范围；该硝酸纤维素膜13上设有检测线(T线)131，该检测线131包被有抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体，所述壳体20上在对应样品结合垫12的位置开设有加样孔21，在对应检测线131的位置开设有观察窗22。

所述试剂瓶B内盛装有反应液，该反应液含有经标记的胃蛋白酶底物，该胃蛋白酶底物为合成肽；该标记物为有色标记或荧光标记，例如标记荧光素、胶体金、量子点、有色乳胶颗粒或荧光乳胶颗粒等。

实施例2

一种胃蛋白酶测定试剂盒，包括盒体，盒体内设有试纸条A、试剂瓶B和试剂瓶C；

所述试纸条A包括壳体20和设在壳体20内的本体10；该本体10包括背衬底板11，该背衬底板11上设有样品结合垫12，以及硝酸纤维素膜13和吸水膜14，该样品结合垫12和吸水膜14分别叠压在硝酸纤维素膜13的两端上；该硝酸纤维素膜13上设有检测线(T线)131，该检测线131包被有抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体，所述壳体20上在对应样品结合垫12的位置开设有加样孔21，在对应检测线131的位置开设有观察窗22。

所述试剂瓶B内盛装有反应液，该反应液含有经标记的胃蛋白酶底物，该胃蛋白酶底物为合成肽；该标记物为有色标记或荧光标记，例如标记荧光素、胶体金、量子点、有色乳胶颗粒或荧光乳胶颗粒等。

所述试剂瓶C内盛装有终止液，该终止液含有胃蛋白酶抑制剂，以及pH缓冲液，能够终止胃蛋白酶催化反应及调整pH值至适合抗原抗体反应的范围。

实施例3

本发明同时提供了一种胃蛋白酶测定方法，包括：

1)将待测样本与反应液反应，该反应液含有经标记的胃蛋白酶底物；底物应相对于胃蛋白酶远远过量；

2)反应一定时间后，将步骤1)的产物终止消化，然后与抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体混合，剩余的经标记的胃蛋白酶底物与抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体反应，生成经标记的底物-抗体复合物；

3)检测经标记的底物-抗体复合物的量，从而对待测样本中的胃蛋白酶进行间接定性和/或定量检测。

优选地，应用本发明的试剂盒进行胃蛋白酶测定的方法，包括：

1)将待测样本与所述试剂瓶B中的反应液反应，样本中的胃蛋白酶消化底物使其失去反应原性；底物应相对于胃蛋白酶远远过量；

2)反应一定时间后，将步骤1)的产物终止消化，具体地，在应用实施例1的试剂盒时，将步骤1)的产物混匀得到混合液，将混合液滴加在试纸条A的样品结合垫12，混合液的pH值可在样品结合垫12得到中和，使其pH值适合抗原抗体反应，例如pH值为7～9，同时样品结合垫12上的胃蛋白酶抑制剂能够终止胃蛋白酶催化反应；然后样品结合垫上的液体逐渐层析至硝酸纤维素膜13的检测线131，剩余的经标记的胃蛋白酶底物与检测线131上包被的抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体反应，生成经标记的底物-抗体复合物；混合液中已被待测样本中胃蛋白酶消化的不具有反应原性的底物则不会与检测线131上的抗体结合，而是随着液体层析继续前进至被吸水膜14吸收；或，

在应用实施例2的试剂盒时，向步骤1)的产物中加入终止液，混合均匀得到混合液，此过程中终止液的胃蛋白酶抑制剂能够终止胃蛋白酶催化反应，并将混合液pH值调整至适合抗原抗体反应，例如pH值为7～9，然后将混合液滴加在试纸条A的样品结合垫12，然后样品结合垫上的液体逐渐层析至硝酸纤维素膜13的检测线131，剩余的经标记的胃蛋白酶底物与检测线131上包被的抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体反应，生成经标记的底物-抗体复合物；混合液中已被待测样本中胃蛋白酶消化的不具有反应原性的底物则不会与检测线131上的抗体结合，而是随着液体层析继续前进至被吸水膜14吸收；

3)检测经标记的底物-抗体复合物的量，从而对待测样本中的胃蛋白酶进行间接定性和/或定量检测，例如：在荧光分析仪的激发光激发下，经标记的底物-抗体复合物中的标记物显现荧光，或直接显示颜色，根据荧光强度或颜色深浅能够定性或定量地得到反应后混合液中剩余的具有反应原性的底物的量，继而推断得到样本中胃蛋白酶的量。显色程度或荧光强度与胃蛋白酶浓度负相关，颜色越浅或荧光程度越低，说明样本中胃蛋白酶浓度越高。

本发明的试剂盒可以通过以下方法并结合本领域常规技术手段制备得到：

1.胃蛋白酶底物抗体的制备：

将胃蛋白酶底物与BSA或KLH进行偶联，根据不同底物的基团采用不同偶联方式，如下式底物，则选择偶联底物氨基。

偶联方案如下：

将底物与KLH按摩尔比50:1混合加入50mM的pH 6.1MES缓冲液，温和搅拌5分钟后，加入终浓度10mg/ml EDC，继续温和搅拌60min。即得底物偶联物。

免疫：按常规方法用底物偶联物免疫小鼠，获得抗该胃蛋白酶底物的单克隆抗体；

2.胃蛋白酶底物标记

将上述底物与荧光微球进行标记，标记方案如下：

偶联：将微球用50mM的pH 6.1MES缓冲液十倍稀释，然后加入终浓度10mg/ml的底物，温和搅拌5分钟后，加入终浓度5mg/ml EDC，继续温和震荡60min。

清洗：将偶联后的混合物用16000rpm离心30min，去上清收集沉淀，再用50mM pH7.2HEPES缓冲液将沉淀重悬(超声，3s/3s，1分钟)，再次离心16000rpm 30min，同上操作重复清洗3～5遍，收集沉淀。

封闭：用含有2％BSA、0.1％Tween-20的50mM Tris缓冲液重悬(超声，3s/3s，1分钟)已偶联的微球，室温震荡2小时。封闭结束后置于2～8℃冷藏保存，得到经标记的胃蛋白酶底物。

3.反应液配制

配制20mM pH 3.5C₈H₅KO₄-HCl缓冲液，加入0.1％叠氮钠、0.1％Tween-20、2％BSA，搅拌混匀后加入步骤2中得到的标记好的胃蛋白酶底物微球，按1:200稀释加入微球，混匀后放2～8℃冷藏保存。

4.样品结合垫处理液配制

配制0.1M pH 8.5TB缓冲液，加入胃蛋白酶抑制剂，如Diazoacetyl-DL-Nle-OMe，加入0.1％叠氮钠、0.5mM硫酸铜混合后涂布在玻璃纤维上，放37℃干燥6小时，然后置于干燥环境中待用。

5.NC膜包被

将步骤1中得到的抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体按1mg/ml包被在NC膜上，然后置于37℃干燥2小时，置于干燥环境待用。

6.试纸条组装

按图将样品结合垫、NC膜、吸水膜依次粘贴在PVC板，并按4mm每条进行裁切，待用。

7.测试

取含有不同浓度胃蛋白酶的标本，按1:10加入反应液中，反应10min后，将75μl混有标本的反应液加入检测孔中，让其向NC膜上层析。10min后用荧光分析仪对其荧光值进行测定，结果如下表，得到的曲线如图4所示。

胃蛋白酶浓度	第一次检测结果	第二次检测结果	第三次检测结果	均值
					0ng/nl	30104	29845	29901	29950
6.25ng/ml	26741	27019	26594	26785
					12.5ng/ml	22056	23185	22807	22683
25ng/ml	13406	13773	13722	13634
					50ng/ml	6092	5873	5992	5986
100ng/ml	4047	4236	3984	4089

将上述测试结果输入厦门依柯利斯医疗科技有限公司生产的荧光分析仪配套的软件中ELLE中，计算得到标准曲线，并以此标准曲线实测50例体检人员和10例返流性咽炎患者唾液标本；

检测过程：取50μL标本，分别加入500μL反应液中混匀，10分钟后取75μL混有标本的反应液加入胃蛋白酶测定试剂盒中，10分钟后用荧光分析仪进行读值分析，软件根据校准曲线自动计算标本中胃蛋白酶的含量。结果如下表所示，表明本发明的试剂盒能够实现胃蛋白酶的定性定量，是一种能够快速检测胃蛋白酶的检测手段，可用于辅助诊断胃食管反流。

组别	胃蛋白酶
		体检人群(n＝50)	5±3.6ng/mL
返流性咽炎患者(n＝10)	43±11.4ng/mL

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (7)

1.一种胃蛋白酶测定试剂盒，其特征在于：包括试纸条和反应液；所述试纸条包括本体，该本体包括背衬底板，该背衬底板上设有样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水膜，该样品结合垫和吸水膜分别叠压在硝酸纤维素膜的两端上；该硝酸纤维素膜上设有检测线，该检测线包被有抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体；所述反应液含有经标记的胃蛋白酶底物；胃蛋白酶底物应相对于胃蛋白酶远远过量；其中，所述样品结合垫上含有胃蛋白酶抑制剂和pH缓冲液，用于终止胃蛋白酶催化反应及调整pH值至适合抗原抗体反应的范围，或，还包括能够终止胃蛋白酶催化反应及调整pH值至适合抗原抗体反应的范围的终止液。

2.根据权利要求1所述的胃蛋白酶测定试剂盒，其特征在于：所述胃蛋白酶底物为合成肽。

3.根据权利要求1所述的胃蛋白酶测定试剂盒，其特征在于：所述经标记的胃蛋白酶底物的标记物为有色标记或荧光标记。

4.根据权利要求1所述的胃蛋白酶测定试剂盒，其特征在于：所述试纸条还包括壳体，所述本体设在壳体内；所述壳体上在对应样品结合垫的位置开设有加样孔；所述壳体上在对应检测线的位置开设有观察窗。

5.根据权利要求1所述的胃蛋白酶测定试剂盒，其特征在于：还包括试剂瓶，该试剂瓶内盛装有所述反应液。

6.根据权利要求5所述的胃蛋白酶测定试剂盒，其特征在于：还包括盒体，所述试纸条和试剂瓶位于盒体内。

7.一种应用权利要求1至6中任一项所述的试剂盒的胃蛋白酶测定方法，其特征在于：包括：

1)将待测样本与所述反应液反应；

2)将步骤1)的产物滴加在所述样品结合垫终止消化，或者将步骤1)的产物与终止液混合以终止消化后滴加在样品结合垫，然后样品结合垫上的液体逐渐层析至硝酸纤维素膜的检测线，剩余的经标记的胃蛋白酶底物与检测线上包被的抗胃蛋白酶底物的单克隆抗体反应，生成经标记的底物-抗体复合物；

3)检测经标记的底物-抗体复合物的量，从而对待测样本中的胃蛋白酶进行间接定性和/或定量检测。