CN103038360A - 测定生物样品中蛋白酶的方法 - Google Patents

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Abstract

一种测定生物样品中组织蛋白酶B潜在可用活性的方法，包括组织蛋白酶B活性形式的活性，能从样品中存在的前体形式组织蛋白原B激活的组织蛋白酶B形式，和能被激活且在样品中由蛋白酶抑制剂抑制其活性的组织蛋白酶B形式，其中样品中存在的组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，样品中所存在组织蛋白酶B的游离蛋白酶抑制剂从样品中耗尽或其抑制剂功能受遏制，且蛋白酶抑制剂从组织蛋白酶B抑制形式中退出，然后测定样品中活性组织蛋白酶B的活性。

Description

测定生物样品中蛋白酶的方法
技术领域
本发明涉及测定生物样品中组织蛋白酶B潜在可用活性的方法，包括组织蛋白酶B活性形式的活性，和能从样品中存在的前体形式组织蛋白原B激活的组织蛋白酶B形式，和能被激活且其蛋白酶活性在样品中被蛋白酶抑制剂抑制的组织蛋白酶B形式。
发明背景
为了测定组织提取物或体液如血清中的酶浓度，可用酶检测和免疫学试验如ELISA。在医学分析和临床诊断情况中，测定样品中完整和活性酶的存在量通常很重要，从而能说明病因学、疾病效果和预后。酶的永久失活形式如变性酶或酶片段通常不相关，因而不考虑测定这种酶且一般应该不考虑。
然而，其他失活酶形式如其活性短暂且由抑制剂或酶前体可逆性抑制的酶（称为酶原）可在疾病成因、影响和/或预测中发挥决定性作用。如果生物学过程需要其酶活性，这种失活酶形式可在某些情况下转变成其活性形式。在这些情况中，例如，所述抑制剂通过某些机制灭活或从酶中撤出，或者酶原转变为其活性形式。组织或体液中活性和短暂失活酶的总体浓度对于特定疾病有重要启示。
测定酶浓度的酶检测使用由活性酶进行或催化的这类反应。然而，如果所述酶形式也能包括在内，作为暂时抑制失活形式和/或作为失活酶原在生物样品中可用（例如，这通常是用蛋白酶的情况），则这些酶形式由于其失活而不能用这类测试检测。因此，样品中可测量的酶活性通常不与真正可用的酶活性对应，因为至少一部分酶活性由抑制剂抑制或以酶原的失活形式存在。
熟知在感染癌症的癌症患者组织样品中，溶酶体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B水平相较健康人的对应组织样品增加。因此，认为组织蛋白酶B是癌症疾病中的诊断和预后因子。一部分组织蛋白酶B是胱抑素抑制形式。此情况中考虑的半胱氨酸蛋白酶抑制剂属于半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族，来自I家族的胱抑素A和胱抑素B在胞内有活性，来自II家族的胱抑素C在胞外有活性，因此在血清中也如此。
WO97/00969中，对于组织蛋白酶B浓度的酶学测定，建议在组织样品中通过亲和色谱从受抑制组织蛋白酶B中撤出半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制剂，其中生物样品通过填充有琼脂糖凝胶的亲和色谱柱，木瓜蛋白酶共价结合所述琼脂糖凝胶。木瓜蛋白酶也是半胱氨酸蛋白酶且对半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的结合亲和性高于组织蛋白酶，因此木瓜蛋白酶从组织蛋白酶中撤出抑制剂。然后，去抑制组织蛋白酶B的活性用其酶活性测量。
不同于组织样品，血清中观察到组织蛋白酶B在没有去抑制时不能测量。因此，推断全组织蛋白酶B在血清中受抑制。
通过直接ELISA测量显示前列腺癌患者血清中组织蛋白原B（组织蛋白酶B的酶原）和组织蛋白酶B的累积值相较健康人的对应值增加约3倍，而同一时间血清中在测量前去抑制的组织蛋白酶B活性相较健康人仅高约30%。通过夹心ELISA方法，结肠癌患者血清中组织蛋白酶B和组织蛋白原B浓度的累积值相较健康人增加约5倍。因此，推断组织蛋白原B浓度或组织蛋白酶B和组织蛋白原B浓度的累积值相较单独组织蛋白酶B值是更重要的癌症疾病指示物。
在免疫学试验如ELISA中，样品中的酶分子通过抗体方法特异性检测。尽管免疫学试验一般比酶检测更灵敏，但抗体不区分酶活性形式与受抑制剂抑制的酶形式；因此这些免疫学试验检测活性和受抑制酶的累积量。根据这些免疫学试验所用的抗体，还能检测酶原、永久性失活酶且一定程度上也能检测变性酶。由于在酶基础上评价疾病的成因、影响和预后通常取决于活性或可激活的酶，因为仅这些酶形式最终激发或催化生物学过程，还检测永久性失活酶形式的这些免疫学试验可对所用试验的需要意义产生负影响，并因此仅部分符合医学分析和诊断。另外，免疫学试验通常需要设备和时间上的高消耗并因而成本高且一般仅在医疗机构特殊实验室中进行。
发明目的
因此，本发明的任务是提供测定与癌诊断特别相关的蛋白酶组织蛋白酶B的方法，所述方法相较熟知的免疫学方法更符合成本效益且运行更简单，同时适于通过抑制剂可逆抑制组织蛋白酶B和组织蛋白原B在生物样品中具体在血浆或血清中测定活性组织蛋白酶B，并通过检测永久性失活组织蛋白酶B来避免误差。
发明描述
所述任务通过测定生物样品中组织蛋白酶B潜在可用活性的方法来解决，包括组织蛋白酶B活性形式的活性，和能从样品中存在的前体形式组织蛋白原B激活的组织蛋白酶B形式，和能被激活且在样品中由蛋白酶抑制剂抑制其活性的组织蛋白酶B形式，有下列步骤：
a)通过以下方式将样品中存在的组织蛋白原B通过以下方式转变成组织蛋白酶B活性形式：
a.i)将所述样品接触第一酶（蛋白水解酶），所述第一酶的功能性是通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，或
a.ii)降低pH值到某一值，在该处组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，
b)通过将所述样品接触第二酶（抑制剂结合酶）来耗尽所述样品中组织蛋白酶B的游离蛋白酶抑制剂或阻遏其抑制剂功能并从组织蛋白酶B受抑制形式中撤出蛋白酶抑制剂，所述第二酶能结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中
b.i)所述第一酶（蛋白水解酶）和所述第二酶（抑制剂结合酶）是相同的酶，前提是所述酶具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式以及结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，
或
b.ii)若使用，所用的第二酶（抑制剂结合酶）不同于所述第一酶（蛋白水解酶），
其中
-第二酶（抑制剂结合酶）是没有降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，或
-第二酶（抑制剂结合酶）是有降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，第二酶降解组织蛋白酶B的该蛋白水解活性在样品中于步骤b）的反应时间后失活，或第二酶从样品中移出并由某一酶替代，所述某一酶没有降解组织蛋白酶B的活性但能结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，
c)将样品接触组织蛋白酶B的底物并记录由蛋白酶组织蛋白酶B催化的底物蛋白水解反应。
本发明中，术语生物样品中组织蛋白酶B的“潜在可用活性”指可用的组织蛋白酶B活性，如果出现样品中存在的组织蛋白酶B活性形式，组织蛋白酶B的短暂失活形式如组织蛋白原B和组织蛋白酶B的可逆抑制形式转变成活性形式。
测定生物样品中组织蛋白酶B潜在可用活性的本发明方法是基于以下事实：生物样品中的所有组织蛋白酶B活性形式以及能被激活的形式，即组织蛋白酶B活性形式、由蛋白酶抑制剂可逆抑制的组织蛋白酶B形式、和生物学前体组织蛋白原B，首先转变成活性形式，然后进行对组织蛋白酶B特异的酶促反应，底物特异于组织蛋白酶B。
因此，本发明方法的第一步骤a)中，组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式。这优选酶促进行，其中使样品接触第一酶（蛋白水解酶），所述第一酶具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的功能。或者，样品中的组织蛋白原还能通过降低pH值来转变成组织蛋白酶B活性形式。如此，通常生理pH值范围为6-8的样品必须设置成3.5-5.5范围的较低pH值，优选4.0-5.0范围，特别优选约4.5，其中组织蛋白原B的前区域被切割。
在前面发明方法的一个优选实施方式中，第一酶（蛋白水解酶）具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的功能并与样品接触，所述第一酶是缺乏降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性的水解酶，优选胃蛋白酶或组织蛋白酶D或组织蛋白酶C或嗜热菌蛋白酶或链霉蛋白酶，特别优选胃蛋白酶或组织蛋白酶D。在此实施方式中，所用的第二酶（抑制剂结合酶）不同于所述第一酶（蛋白水解酶），因为上面提及的水解酶通常不具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能。胃蛋白酶特定优选为第一酶。尽管前面列举的水解酶能蛋白水解切割组织蛋白原B的前区域并因此将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B，产物组织蛋白酶B不进一步由胃蛋白酶或组织蛋白酶D显著消化。
在此方法的第一变体中，第一酶（蛋白水解酶）是没有降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性的水解酶，但具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的功能，所用的第二酶（抑制剂结合酶）是木瓜蛋白酶，具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中木瓜蛋白酶降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性在样品中于反应时间后失活或木瓜蛋白酶从样品中移出并由某一酶替代，所述某一酶没有降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性但具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B。
在所述方法的第二变体中，所述第一酶（蛋白水解酶）是没有降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性的水解酶，但具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的功能，所用的第二酶（抑制剂结合酶）是改性的木瓜蛋白酶，具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，但缺乏通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的功能和降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性，其中缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可如下制备：
a)木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内半胱氨酸的SH-基团的化学修饰，优选通过木瓜蛋白酶与甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、对汞苯甲酸盐或AgNO3反应或通过添加N-取代马来酰亚胺，或通过
b)由另一氨基酸在木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内的半胱氨酸进行定点突变。
本发明的“改性”木瓜蛋白酶中，关闭降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性，然而其仍具有结合半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白酶抑制剂的木瓜蛋白酶固有高亲和性。
缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可化学制备，其还能用于原位修饰样品中的木瓜蛋白酶从而当其蛋白水解活性已将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B时，仅在反应时间后关闭其针对组织蛋白酶B的蛋白酶活性。使木瓜蛋白酶的蛋白酶活性失活的优选化学方法是氧化木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内半胱氨酸的SH-基团。在本发明的一个特别优选实施方式中，此SH-基团氧化通过木瓜蛋白酶与甲基甲硫磺酸酯(MMTS)反应来进行。或者，木瓜蛋白酶的蛋白酶活性灭活通过用重金属化合物如对汞苯甲酸盐或AgNO3掩蔽SH-基团或添加N-取代马来酰亚胺到SH-基团来完成。
在本发明的替代实施方式中，蛋白酶活性失活的改性木瓜蛋白酶能由另一氨基酸通过交换或定点突变木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内的半胱氨酸来制备。克隆这种交换或生成半胱氨酸残基定点突变的遗传工程改造方法以及随后通过体外或体内表达然后分离或纯化来生成木瓜蛋白酶突变体为本领域技术人员已知。
在本发明的替代实施方式中，所用的第一酶（蛋白水解酶）和第二酶（抑制剂结合酶）是相同的酶，即木瓜蛋白酶，所述酶具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式以及结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能并且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中木瓜蛋白酶降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性在反应时间后失活或木瓜蛋白酶从样品中移出并由某一酶替代，所述某一酶没有降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性但具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B。
木瓜蛋白酶能消化样品中游离的组织蛋白酶B，并因而样品中失去活性组织蛋白酶B。假定在最优反应条件下，活性木瓜蛋白酶在约5分钟中降解约4-5%组织蛋白酶B。对于胃蛋白酶或组织蛋白酶D并非如此。由木瓜蛋白酶降解组织蛋白酶B可对测量结果产生负影响，因为记录了比生物样品中实际可得的量更少的活性组织蛋白酶B量。因此，木瓜蛋白酶必须在反应时间后从样品中移出或其针对组织蛋白酶B降解的蛋白酶活性必须失活。用于本发明方法此目的的实施方式描述于下。
在本发明方法的一个优选实施方式中，木瓜蛋白酶用作第一和第二酶或仅作为第二酶（抑制剂结合酶），样品中的木瓜蛋白酶在反应时间后转化成改性木瓜蛋白酶，所述改性木瓜蛋白酶就组织蛋白酶B降解而言具有失活的蛋白酶活性，其中蛋白酶活性失活的改性木瓜蛋白酶可通过化学修饰木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内半胱氨酸SH-基团来制备，优选通过木瓜蛋白酶与甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、对汞苯甲酸盐或AgNO3反应或通过添加N-取代马来酰亚胺。
此方式中，木瓜蛋白酶保持其撤出或结合蛋白酶抑制剂的功能，但释放其蛋白酶活性，从而在灭活木瓜蛋白酶后，即将木瓜蛋白酶转变成其改性形式后，反应批次可进一步加工且其时程至少在涉及蛋白降解组织蛋白酶B方面没有变得关键。
在本发明方法的替代优选实施方式中，木瓜蛋白酶用作第一和第二酶或仅作为第二酶（抑制剂结合酶），样品中的木瓜蛋白酶在反应时间后从样品中移出并由改性木瓜蛋白酶替代，所述改性木瓜蛋白酶缺乏降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性，但具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可如下制备
a)木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内半胱氨酸SH-基团的化学修饰，优选通过木瓜蛋白酶与甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、对汞苯甲酸盐或AgNO3反应或通过添加N-取代马来酰亚胺，或通过
b)由另一氨基酸在木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内的半胱氨酸进行定点突变。
为了以简单方式从样品中移出木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶优选结合刚性载体，然后先与流体样品接触且在反应时间后从样品中移出。所述流体样品还可通过与木瓜蛋白酶结合的刚性载体，从而使样品接触木瓜蛋白酶。
5分钟内，约4-5%的游离组织蛋白酶B由充分完整的木瓜蛋白酶消化，在一个本发明方法前述变体的实施方式中，首先使木瓜蛋白酶接触样品一段反应时间且随后转移到改性木瓜蛋白酶或从样品中移出，灭活或移除蛋白酶活性在5分钟的去抑制步骤b)反应时间后进行，特别优选3分钟的反应时间后，尤其优选1分钟的反应时间后。灭活或移除活性完整木瓜蛋白酶进行越快，组织蛋白酶B降解越小且所测组织蛋白酶B活性相较生物样品中组织蛋白酶B实际潜在可用活性的偏差越小。
本发明方法宜在作为生物样品的血液、血浆、血清或组织匀浆中进行。由于某些血液组分的固有荧光，特别优选使用血清作为生物样品。本发明方法还可用组织匀浆进行，然而这需要来自患者的活检以及手术干预和将组织加工成流体样品。因此，血清和血浆相对血液和组织匀浆特别优选。
本发明将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B后以及从样品中移出组织蛋白酶B的游离抑制剂和通过对蛋白酶抑制剂亲和性高于组织蛋白酶B的酶来撤出蛋白酶抑制剂而去抑制组织蛋白酶B后，通过将样品接触组织蛋白酶B的底物和记录通过蛋白酶组织蛋白酶B的底物蛋白水解反应来测定样品中活性组织蛋白酶B的活性。对于此目的，可使用一些组织蛋白酶B的底物。特别优选组织蛋白酶B的底物，包括二或寡肽序列和荧光团，所述荧光团能通过蛋白酶组织蛋白酶B的底物蛋白水解反应而从寡肽序列中切割，其中特定优选的荧光团是7-氨基-4-(三氟甲基)香豆素(AFC)或7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)，AFC尤其优选。荧光团AFC或AMC经C末端结合二或寡肽序列。在蛋白水解反应中，所述荧光团从二或寡肽序列中切割。从半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B中特异性识别并且切割的二肽序列示例是Arg-Arg。因此，例如，Z-Arg-Arg-AFC适合作为底物，其中Z是保护基团，优选乙酸酯基团或羧基苄基基团。
组织蛋白酶B的底物优选具有以下特征性特性：包括二或寡肽序列和荧光团的未切割底物所具有的最大荧光发射波长显著不同于所述荧光团的最大荧光发射波长，其在蛋白水解反应中由蛋白酶切割，至少20nm，优选至少40nm或更多。如果非切割底物和切割荧光团的荧光发射波长或最大荧光发射波长相同或彼此接近，则记录测量中非切割底物的固有荧光以及切割荧光团的荧光发射。具有相同荧光发射波长的这类底物和荧光团为本领域熟知。在这类底物情况中，尽管有一致的荧光发射波长，如果荧光团的荧光发射强度在同一或相似波长相较非切割底物显著更高，则测量可行。在此情况中，信号增加是相较无酶负对照的酶活性量度。然而，这种底物的缺点是仅能在强酶活性情况下测量结果并因而具有很明显的荧光发射增加，因为信号在酶活性小的情况下通常太弱且不与非切割底物的固有荧光充分区分。信号在噪音中丧失或至少不以显著方式与其相区分。
所述底物和经切割荧光团间的荧光发射检测波长位移具有特定优势，即在此波长基本只记录从底物中切割的荧光团并因此仅酶反应实际发生。经切割荧光团发射波长与所述底物荧光波长间的距离越大，蛋白酶活性测定可越灵敏。
在底物有二肽Arg-Arg和共价结合所述二肽C末端的荧光团的情况中，荧光发射在蓝色波长区（ca.460nm），而AFC荧光团本身具有黄-绿荧光（ca.505nm）。此情况确保非切割底物和在酶反应中切割的纯荧光团之间有足够的波长距离。使用AFC荧光团与AMC荧光团相比特别优选，因为由二肽Arg-Arg和AMC荧光团组成的底物与游离AMC荧光团的荧光发射都在蓝色波长区（ca.460nm）。此情况中非切割底物和经切割荧光团间的区分仅能通过信号强度而非发射波长。
在本发明方法中，可使生物样品以不同方式接触酶，所述酶对蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B且具有移出样品中游离的组织蛋白酶B抑制剂并使其退出组织蛋白酶B抑制形式的功能。在本发明方法的一个实施方式中，所述酶以游离形式加入，宜溶于缓冲溶液。所述酶在样品中分散并会结合蛋白酶抑制剂，因而还使该抑制剂离开样品中的组织蛋白酶B。为了在本方法后续步骤中测量组织蛋白酶B的浓度或活性，所述酶可保留在样品中，只要它不干扰蛋白酶组织蛋白酶B与底物的特异性蛋白水解反应和随后记录。此变体具有特定优势：组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B和组织蛋白酶B去抑制可以简单方式在单一反应容器中进行，例如在用于随后测量后续酶检测荧光的比色皿中。
在本发明方法的一个替代实施方式中，所述酶对蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B且具有就组织蛋白酶B而言移出样品中的游离抑制剂并撤出组织蛋白酶B抑制形式的蛋白酶抑制剂的功能，所述酶共价结合或以吸附方式结合刚性载体，优选结合纤维素，特别优选共价结合纤维素，其中共价结合可以化学或光化学方式实现。
使用结合有对蛋白酶抑制剂有高亲和性的酶的刚性载体具有以下优势：该酶与结合其的样品中蛋白酶抑制剂在活性测量期间不保留在样品中且因此不引起任何干扰。所述载体可具有任何形状。例如，所述载体形状可为结合酶的箔或条，其通过浸渍与样品接触。反应时间后，所述载体从样品中移出且随后进行活性组织蛋白酶B测定。浸渍到样品中可一次或数次进行，从而尽可能定量地撤出蛋白酶抑制剂。
所述载体能可以另一形状提供，所述形状能使流体样品与结合酶的载体表面紧密接触。例如，所述载体的形状可为薄管或毛细管，其内表面结合酶且样品通过其。此外，所述载体的形状可为颗粒、珠等，其内表面结合酶。通过将颗粒材料浸渍到流体样品中且若需要通过移动样品中的颗粒，使酶与样品紧密接触并随后通过离心、沉淀、过滤或简单抽吸流体样品去除来分离。如上所述，在本发明方法的一个特别优选实施方式中，将样品接触能通过蛋白水解消化使组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的第一酶的步骤a)用胃蛋白酶或组织蛋白酶B作为第一酶来进行。有利地，此步骤a)在4-40°C范围的温度进行，优选20-40°C，pH值范围为3.5-5.5，优选4.0-5.0范围，特别优选约4.5。胃蛋白酶在酸性pH范围内具有其最高蛋白水解活性且在高于6的pH值基本失活。因此，宜将生物样品分别设置成前述范围中的pH值或缓冲样品，从而提供胃蛋白酶或组织蛋白酶B1的最优蛋白水解消化。
在本发明方法的另一个实施方式中，将样品接触对蛋白酶抑制剂亲和性高于组织蛋白酶B和能移出样品中游离抑制剂并使蛋白酶抑制剂退出组织蛋白酶B抑制形式的第二酶的步骤b)在4-40°C范围的温度进行，优选20-40°C，pH值范围为2-7，优选4.5-6。
如果第二酶在与其用于切割组织蛋白原B的前述步骤a)相同的条件下行使其去抑制功能，则涉及温度和pH值的反应条件可维持。若通过第二酶去抑制的最优效果需要温度和/或pH值变化，则反应条件需改变。趋向更佳和对第二酶优化值的pH值变化可通过添加合适酸或碱或合适缓冲液来实现。
本发明还包括测定样品中组织蛋白酶B前体形式，即组织蛋白原B的方法，其中
i)用第一部分的生物样品，组织蛋白酶B潜在可用活性的第一测定根据本文所述和要求权利的方法进行，其中所述方法步骤a)中，样品内存在的组织蛋白原B还转变成组织蛋白酶B活性形式，
ii)用第二部分的生物样品，组织蛋白酶B潜在可用活性的第二测定根据本文所述和要求权利的方法进行，其中所述方法步骤a)的第二测定没有进行，样品中存在的组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，
iii)来自样品中组织蛋白原B的组织蛋白酶B潜在可用活性计算为第一测定i)与第二测定ii)间的差异值。
此方式计算的差异值对应于潜在组织蛋白酶B活性，其可通过将样品中存在的组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B而从组织蛋白原B获得。
本发明通过下列实施例和优选实施方式来进一步解释。
1)样品的制备和供应
1.a)血液根据标准方法凝固，离心后获得血清，所述血清进行分配并装入EP管且在液氮温度保存直到完成实验。
1.b)组织匀浆根据标准方法获自组织样品，然后分配，装入EP管且在液氮温度保存直到完成测量。
2)样品中的组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式
2.a)通过与胃蛋白酶反应：
由于组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的最优pH值是4.5，下列实验在此pH值下进行。为此，0.2ml血清样品用乙酸盐缓冲液（pH=4.5）1:1稀释，其中猪胃蛋白酶已溶解。此溶液在30°C孵育20分钟。然后就酶检测而言，溶液的pH值通过磷酸盐缓冲液设为6。
2.b)通过与组织蛋白酶D反应：
对于此转变，0.2ml血清样品也用乙酸盐缓冲液1:1稀释至pH=4.5，其中人组织蛋白酶D已溶解。此溶液随后在37°C孵育4小时。然后就酶检测而言，溶液的pH值通过磷酸盐缓冲液设为6。
2.c)通过降低pH值：
0.2ml血清样品用乙酸盐缓冲液1:1稀释至pH=4.5且随后30°C孵育40分钟。然后就酶检测而言，溶液的pH值通过磷酸盐缓冲液设为6。
3)如何制备蛋白水解功能失活的“改性”木瓜蛋白酶
3.a)预处理固定的木瓜蛋白酶
市售可得的木瓜蛋白酶琼脂糖悬于50%甘油、含0.05%Na-N3的乙酸钠缓冲液（0.1M,pH=4.5）。因此，此溶液首先相对磷酸盐缓冲液pH=6交换。使用每次酶检测50μl木瓜蛋白酶-琼脂糖凝胶（=100μl悬液）。这对应于5.5·10-10Mol木瓜蛋白酶。因此，对于32次测定，使用3.2ml悬液。相对磷酸盐缓冲液交换通过添加缓冲液、重悬浮、离心和弃上清的4重顺序来进行。
共价结合纤维素的木瓜蛋白酶在直径110mm的滤纸上可得，其可分成32个相同部分，其中各部分具有与50μl木瓜蛋白酶-琼脂糖凝胶大致相同的木瓜蛋白酶部分。
3.b)固定的木瓜蛋白酶与甲基甲硫磺酸酯（MMTS）反应：
对于如上所述获得的木瓜蛋白酶-琼脂糖凝胶，添加含5mM MMTS的磷酸盐缓冲液（pH=6）溶液且随后重悬浮。为了进一步应用，离心该凝胶和弃上清。
共价结合木瓜蛋白酶的纤维素滤器浸渍到含5mM MMTS的磷酸盐缓冲溶液（pH=6），然后移出并分成各部分用于进一步应用。
3.c)固定的木瓜蛋白酶与对汞苯甲酸盐反应：
对于如上所述获得的木瓜蛋白酶-琼脂糖凝胶，添加含0.02μMol对汞苯甲酸盐的磷酸盐缓冲溶液（pH=6）并重悬浮。为了进一步应用，离心该凝胶和弃上清。为移出过量试剂，添加磷酸盐缓冲液（pH=6）、重悬浮、离心和弃上清的循环应用4次。
共价结合木瓜蛋白酶的纤维素滤器浸渍到含2mM对汞苯甲酸盐的磷酸盐缓冲溶液（pH=6），然后移出并分成各部分用于进一步应用。
3.d)固定的木瓜蛋白酶与N-乙基马来酰亚胺反应
对于如上所述获得的木瓜蛋白酶-琼脂糖凝胶，添加含2mM N-乙基马来酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液（pH=6）并重悬浮。为了进一步应用，离心该凝胶和弃上清。为移出过量试剂，添加磷酸盐缓冲液（pH=6）、重悬浮、离心和弃上清的循环应用4次。
共价结合木瓜蛋白酶的纤维素滤器浸渍到含2mM N-乙基马来酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液（pH=6），然后移出并分成各部分用于进一步应用。
4)从样品中移出游离抑制剂和去抑制组织蛋白酶B
4.a)将样品接触固定的改性木瓜蛋白酶：
固定于琼脂糖凝胶的改性木瓜蛋白酶如下使用：对于用磷酸盐缓冲液（pH=6）1:1稀释且其中组织蛋白原B已转变成组织蛋白酶B的160μl血清样品，在EP管中加入50μl改性木瓜蛋白酶-琼脂糖凝胶，然后凝胶重悬浮且反应容器在完全去抑制后于10000rpm离心。从上清转移110μl到0.5ml反应容器以酶促测定组织蛋白酶B活性。
或者，共价结合纤维的改性木瓜蛋白酶如下使用：
用磷酸盐缓冲液（pH=6）1:1稀释且其中组织蛋白原B已转变成组织蛋白酶B的160μl血清样品在EP管中通过浸渍直至完全去抑制来接触一片共价结合约5,5·10-10Mol改性木瓜蛋白酶的纤维素。随后从溶液中移出纤维素部分。从去抑制血清样品中转移110μl到0.5ml反应容器以酶促测定组织蛋白酶B活性。
4.b)将样品接触固定的非改性木瓜蛋白酶和随后的改性木瓜蛋白酶
固定于琼脂糖凝胶的改性木瓜蛋白酶如下使用：对于用磷酸盐缓冲液（pH=6）1:1稀释且其中组织蛋白原B已转变成组织蛋白酶B的160μl血清样品，在EP管中加入50μl木瓜蛋白酶-琼脂糖凝胶，然后凝胶重悬浮且反应容器在10000rpm离心30秒。上清转移到0.5ml反应容器并加入50μl改性木瓜蛋白酶。凝胶重悬浮且反应容器在完全去抑制后于10000rpm离心。从上清转移110μl到0.5ml反应容器以酶促测定组织蛋白酶B活性。
或者，共价结合纤维的非改性木瓜蛋白酶如下使用：
用磷酸盐缓冲液（pH=6）1:1稀释且其中组织蛋白原B已转变成组织蛋白酶B的160μl血清样品在EP管中通过浸渍来接触一片共价结合约5,5·10-10Mol木瓜蛋白酶的纤维素，然后从溶液中移出纤维素片。此溶液中，共价结合约5.5·10-10Mol改性木瓜蛋白酶的另一纤维素片进行浸渍且在完全去抑制后移出。然后，将110μl样品转移到0.5ml反应容器以酶促测定组织蛋白酶B活性。
5)通过固定的木瓜蛋白酶将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B，同时移出 游离抑制剂库且随后通过固定的改性木瓜蛋白酶去抑制组织蛋白酶B
固定于琼脂糖凝胶的木瓜蛋白酶如下使用：
对于用磷酸盐缓冲液（pH=6）1:1稀释的160μl血清样品，在EP管中加入50μl木瓜蛋白酶-琼脂糖凝胶，然后凝胶重悬浮且反应容器在10000rpm离心30秒。上清转移到0.5ml反应容器并加入50μl改性木瓜蛋白酶，凝胶重悬浮且反应容器在完全去抑制后于10000rpm离心。将110μl上清转移到0.5ml反应容器以酶促测定组织蛋白酶B活性。
或者，加入50μl木瓜蛋白酶-琼脂糖凝胶和重悬浮后，向悬液中加入5mMMMTS且反应容器在完全去抑制后于10000rpm离心。将110μl上清转移到0.5ml反应容器以酶促测定组织蛋白酶B活性。
共价结合纤维素的非改性木瓜蛋白酶如下使用：
用磷酸盐缓冲液（pH=6）1:1稀释的160μl血清样品在EP管中通过浸渍来接触一片共价结合约5,5·10-10Mol木瓜蛋白酶的纤维素，然后从溶液中移出纤维素片。此样品中，一片共价结合约5,5·10-10Mol改性木瓜蛋白酶的纤维素进行浸渍且在完全去抑制后移出。然后，将110μl样品转移到0.5ml反应容器以酶促测定组织蛋白酶B活性。
或者，在第一次浸渍共价结合木瓜蛋白酶的纤维素片后，向血清中加入5mM MMTS且纤维素片在去抑制完成后从样品中移出。然后，将110μl样品转移到0.5ml反应容器以酶促测定组织蛋白酶B活性。
6)测量样品中的组织蛋白酶B活性
对于如所述处理的110μl血清样品，在0.5ml反应容器中加入110μl底物溶液（70μM Z-Arg-Arg-AFC），其pH值由磷酸盐缓冲液设为pH=6且包含5mM EDTA和10mM DTE。混合后，样品在37°C孵育120分钟。随后反应容器用冰冷却，离心一小段时间以使反应容器帽上冷凝的水回到溶液中然后记录荧光发射，用荧光读取仪在微量滴定板上或用荧光计在比色皿中记录。激发波长在约400nm，合适的检测波长在约505nm。
在加入人工半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂E64和组织蛋白酶B特异性抑制剂CA-074到酶检测后，测量信号与检测信号相同，后者是在撤出抑制剂前进行酶检测时获得的。因此，有证据显示撤出抑制剂后在酶检测中测量的值与释放的组织蛋白酶B有关。

Claims (14)

1.一种测定生物样品中组织蛋白酶B潜在可用活性的方法，包括组织蛋白酶B活性形式的活性，能从样品中存在的前体形式组织蛋白原B激活的组织蛋白酶B形式，和能被激活且在样品中由蛋白酶抑制剂抑制其活性的组织蛋白酶B形式，所述方法有下列步骤：
a)通过以下方式将所述样品中存在的组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式：
a.i)将所述样品接触第一酶（蛋白水解酶），所述酶的功能性是通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，或
a.ii)将pH值降低到某一值，在该处组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，
b)通过将所述样品接触第二酶（抑制剂结合酶）来耗尽所述样品中组织蛋白酶B的游离蛋白酶抑制剂或阻遏其抑制剂功能并从组织蛋白酶B受抑制形式中撤出蛋白酶抑制剂，所述第二酶能结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中
b.i)所述第一酶（蛋白水解酶）和所述第二酶（抑制剂结合酶）是相同的酶，前提是所述酶具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式以及结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对该蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，
或
b.ii)若使用，所用的第二酶（抑制剂结合酶）不同于所述第一酶（蛋白水解酶），
其中
-第二酶（抑制剂结合酶）是没有降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，或
-第二酶（抑制剂结合酶）是有降解组织蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，所述第二酶降解组织蛋白酶B的该蛋白水解活性在所述样品中于步骤b）的反应时间后失活，或所述第二酶从所述样品中移出并由某一酶替代，所述某一酶没有降解组织蛋白酶B的活性但能结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，
c)将所述样品接触组织蛋白酶B的底物并记录由蛋白酶组织蛋白酶B催化的底物蛋白水解反应。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的功能的所述第一酶（蛋白水解酶）是没有降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性的水解酶，优选胃蛋白酶或组织蛋白酶D或组织蛋白酶C或嗜热菌蛋白酶或链霉蛋白酶，特别优选胃蛋白酶或组织蛋白酶D，且所用的第二酶（抑制剂结合酶）不同于第一酶（蛋白水解酶）。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所用的第二酶（抑制剂结合酶）是木瓜蛋白酶，具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中木瓜蛋白酶降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性在所述样品中于反应时间后活化或木瓜蛋白酶从所述样品中移出并由某一酶替代，所述某一酶没有降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性但具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述使用的第一酶（蛋白水解酶）和第二酶（抑制剂结合酶）是相同的酶，即木瓜蛋白酶，其具有通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式以及结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能并且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中木瓜蛋白酶降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性在反应时间后活化或木瓜蛋白酶从所述样品中移出并由某一酶替代，所述某一酶没有降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性但具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述样品中的木瓜蛋白酶在反应时间后转化成改性木瓜蛋白酶，所述改性木瓜蛋白酶就组织蛋白酶B降解而言具有失活的蛋白酶活性，其中缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可通过化学修饰木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内半胱氨酸的SH-基团来制备，优选通过木瓜蛋白酶与甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、对汞苯甲酸盐或AgNO3反应或通过添加N-取代马来酰亚胺。
6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述样品中的木瓜蛋白酶在反应时间后移出并由改性木瓜蛋白酶替代，所述改性木瓜蛋白酶缺乏降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性，但具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，其中缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可如下制备：
a)木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内半胱氨酸的SH-基团的化学修饰，优选通过木瓜蛋白酶与甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、对汞苯甲酸盐或AgNO3反应或通过添加N-取代马来酰亚胺，或通过
b)由另一氨基酸在木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内的半胱氨酸进行定点突变。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述使用的第二酶（抑制剂结合酶）是改性的木瓜蛋白酶，具有结合组织蛋白酶B的蛋白酶抑制剂的功能且对所述蛋白酶抑制剂的亲和性高于组织蛋白酶B，但缺乏通过蛋白水解消化将组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的功能和缺乏降解组织蛋白酶B的蛋白酶活性，其中缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可如下制备
a)木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内半胱氨酸的SH-基团的化学修饰，优选通过木瓜蛋白酶与甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、对汞苯甲酸盐或AgNO3反应或通过添加N-取代马来酰亚胺，或通过
b)由另一氨基酸在木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心内的半胱氨酸进行定点突变。
8.如权利要求1、4或5中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二酶（抑制剂结合酶）就组织蛋白酶B而言的蛋白酶活性的灭活在5分钟的步骤b)反应时间后进行，优选3分钟的步骤b)反应时间后，尤其优选1分钟的步骤b)反应时间后。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品是血液、血浆、或血清或组织匀浆。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织蛋白酶B的底物包括二或寡肽序列和荧光团，所述荧光团能在底物蛋白水解反应期间由蛋白酶组织蛋白酶B从寡肽序列中切割，其中所述荧光团优选7-氨基-4-(三氟甲基)香豆素(AFC)或7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一酶（蛋白水解酶）优选木瓜蛋白酶，共价结合或以吸附方式结合载体，优选结合琼脂糖凝胶或纤维素，特别优选共价结合纤维素，尤其优选共价结合化学或光化学方式获得的纤维素。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述将样品接触能通过蛋白水解消化使组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式的第一酶（蛋白水解酶）的步骤a)在4-40°C范围的温度完成，优选20-40°C，pH值范围为1-6，优选2-5，特别优选4.5。
13.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述将样品接触第二酶（抑制剂结合酶）的步骤b)在4-40°C范围的温度完成，优选20-40°C，pH值范围为2-7，优选4.5-6。
14.一种测定样品中组织蛋白酶B前体形式组织蛋白原B的方法，其中
i)用生物样品的第一部分，根据前述权利要求之一进行组织蛋白酶B潜在可用活性的第一测定，
ii)用相同生物样品的第二部分，根据前述权利要求之一进行组织蛋白酶B潜在可用活性的第二测定，然而，其中所述方法步骤a)的第二测定没有进行，其中所述样品中存在的组织蛋白原B转变成组织蛋白酶B活性形式，
iii)来自样品中组织蛋白原B的组织蛋白酶B的潜在可用活性计算为第一测定i)与第二测定ii)间的差异值。
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