EP2588627A1 - Verfahren zur bestimmung der protease cathepsin b in einer biologischen probe - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der protease cathepsin b in einer biologischen probe

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EP2588627A1
EP2588627A1 EP11730629.0A EP11730629A EP2588627A1 EP 2588627 A1 EP2588627 A1 EP 2588627A1 EP 11730629 A EP11730629 A EP 11730629A EP 2588627 A1 EP2588627 A1 EP 2588627A1
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EP
European Patent Office
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cathepsin
enzyme
sample
papain
protease
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11730629.0A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hans Jörg MEIER
Hanns Jörg MAUK
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Papst Licensing GmbH and Co KG
Original Assignee
Papst Licensing GmbH and Co KG
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Publication date
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Publication of EP2588627A1 publication Critical patent/EP2588627A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the invention relates to a method for determining the potentially available activity of cathepsin B in a biological sample, including the activity of the active form of cathepsin B, the activatable form of cathepsin B from the pro-form pro-cathepsin B present in the sample and activatable form of cathepsin B which is inhibited in the sample by protease inhibitor in terms of its protease activity.
  • enzymatic tests and immunological tests for example ELISA
  • Permanently inactive enzymes such as denatured enzymes or fragments of enzymes, often do not play a decisive role, which is why they can not and often will not be taken into account when concentrating.
  • inactive enzymes such as enzymes inhibited by inhibitors, and enzyme inhibitors that are inhibited in their activity, or enzyme precursors, so-called proenzymes
  • proenzymes can play a decisive role in the causes of the disease, the effects of disease, and / or disease prognosis.
  • These forms of inactive enzymes can, under certain conditions, be converted to their active forms when their enzyme activity is required for biological processes. For example, the inhibitors are then inactivated by certain mechanisms or removed from the enzymes, or proenzymes are converted to their active forms.
  • the total concentrations of active and temporarily inactive enzymes in tissue or body fluids can be important indicators of certain diseases.
  • Enzymatic tests to determine the concentration of enzymes use the reactions performed or catalyzed by the active enzymes. However, if such enzyme which are present in a biological sample in the temporarily inhibited inactive form and / or as an inactive proenzyme, which for example frequently applies to proteases, these enzyme forms can not be detected in such tests because of their inactivity. Therefore, the enzyme activity measurable in a sample is often inconsistent with the actual enzyme activity available, because at least part of the enzyme activity is inhibited by inhibitors or present in the inactive form of the proenzymes.
  • cysteine protease cathepsin B is present in cancerous tissue samples from cancer patients in comparison to corresponding tissue samples from healthy volunteers. Cathepsin B is therefore considered as a diagnostic and prognostic factor in cancer. Part of the cathepsin B is present in a form inhibited by cystatins.
  • the cysteine protease inhibitors of interest belong to the superfamily of cystatins, whereby the cystatin A and the cystatin B from the family I are intracellularly effective, the cystatin C from the family II is extracellular, thus also in the blood serum, effective.
  • WO 97/00969 therefore proposes, for the enzymatic determination of the concentration of cathepsin B, to withdraw the cystatin inhibitors from the inhibited cathepsin B in tissue samples by affinity chromatography by passing a biological sample over an affinity chromatography column with papain covalently bound to Sepharose gel.
  • papain which is also a cysteine protease, has a higher binding affinity to cystatins than the cathepsins, which is why papain removes the inhibitor from cathepsin. Subsequently, the activity of inhibited cathepsin B is determined using its enzymatic activity.
  • the enzymes present in a sample are specifically detected by means of antibodies.
  • the immunological test is generally more sensitive than the enzymatic test, most of the time the antibodies do not distinguish between active enzyme and enzyme inhibited by inhibitors, so that these assays capture the total amount of active and inhibited enzyme.
  • proenzymes, permanently inactive enzymes and possibly also denatured enzymes can be detected in such immunological tests.
  • immunological tests which also detect permanently inactive forms of the enzymes, can be used to assess the causes of disease, disease effects and / or disease prognoses by enzymes desired validity of the test performed falsify and are only partially suitable for medical analysis and diagnostics.
  • immunological tests often require a lot of equipment and time, which is why they are expensive and can be performed in the medical field usually only in special laboratories.
  • the object of the present invention was therefore to provide a method for determining the protease cathepsin B, which is particularly important for the diagnosis of cancer, which is simpler and cheaper than known immunological methods and at the same time is suitable in a biological sample, in particular in blood, blood plasma or blood serum, active cathepsin B, reversible inactivated cathepsin B and procathepsin B inhibitors and to exclude errors by the detection of permanently inactive cathepsin B.
  • This object is achieved by a method for determining the potentially available activity of cathepsin B in a biological sample, including the activity of the active form of cathepsin B, the activatable form of cathepsin B from the present in the sample Proform Procathepsin B and the activatable form of cathepsin B, which is inhibited in the sample by protease inhibitor in terms of its protease activity, with the stages in which one a) Procathepsin B present in the sample is converted into the active form cathepsin B by ai) contacting the sample with a first enzyme (proteolysis enzyme) which has the functionality to convert procathepsin B into the active form cathepsin B by proteolytic digestion, or
  • the first enzyme used proteolysis enzyme
  • the second enzyme inhibitor binder enzyme
  • the second enzyme (inhibitor binder enzyme) used is different from the first enzyme (proteolysis enzyme), if used,
  • the second enzyme is an enzyme which does not possess protease activity for cathepsin B degradation, or
  • the second enzyme is an enzyme which has protease activity for cathepsin B degradation, and this protease activity of the second cathepsin B degradation enzyme is inactivated after a reaction time of step b) in the sample or the second Enzyme is removed from the sample and replaced with an enzyme which has no protease activity for the degradation of cathepsin B but the functionality to bind the protease inhibitor to cathepsin B and has a higher affinity for the protease inhibitor than cathepsin B itself, c) Contacting the sample with a substrate for cathepsin B and detecting the proteolytic conversion of the substrate by the protease cathepsin B.
  • the "potentially available activity" of cathepsin B in a biological sample refers to the activity of cathepsin B, which is available if, in addition to the present in the sample active form of cathepsin B also temporarily Inactive forms of cathepsin B, such as Procathepsin B and reversibly inhibited forms of Cathepsin B, converted into the active forms.
  • the method according to the invention for determining the potentially available activity of cathepsin B in a biological sample is based on the fact that all active and activatable forms of cathepsin B present in the biological sample, i. the active form of cathepsin B, protease inhibitor reversibly inhibited forms of cathepsin B and the biological precursor procathepsin B, are first converted to an active form and then cathepsin B specific enzymatic conversion of a cathepsin B specific substrate is performed.
  • Procathepsin B is converted into the active form cathepsin B.
  • This is preferably achieved enzymatically by contacting the sample with a first enzyme (proteolysis enzyme) having the functionality to convert procathepsin B into the active form cathepsin B by proteolytic digestion.
  • a first enzyme proteolysis enzyme
  • procathepsin in the sample can also be converted to the active form cathepsin B by lowering the pH.
  • the sample which usually has a physiological pH in the range of 6 to 8, to a lower pH in the range of 3.5 to 5.5, preferably in the range of 4.0 to 5.0, especially Preferably, adjust to about 4.5 at which the proregion of procathepsin B is cleaved off.
  • the first enzyme which has the functionality to convert procathepsin B into the active form cathepsin B by proteolytic digestion and which is contacted with the sample is a hydrolase without protease activity for the degradation of cathepsin B, preferably pepsin or cathepsin D or cathepsin C or thermolysin or pronase, more preferably pepsin or cathepsin D.
  • the second enzyme (inhibitor binder enzyme) used is different from the first enzyme (proteolysis enzyme) since the abovementioned hydrolases generally do not have the functionality of binding the protease inhibitor for cathepsin B.
  • the first enzyme is pepsin.
  • the first enzyme proteolysis enzyme
  • the second enzyme inhibitor binder enzyme
  • papain which has the functional has the ability to bind the protease inhibitor for cathepsin B and has a higher affinity for the protease inhibitor than cathepsin B itself
  • the protease activity of the papain for the degradation of cathepsin B is inactivated after a reaction time in the sample or the papain is removed from the sample and is replaced by an enzyme which has no protease activity for cathepsin B degradation, but has the functionality to bind the protease inhibitor to cathepsin B, and has a higher affinity for the protease inhibitor than cathepsin B itself.
  • the first enzyme proteolysis enzyme
  • the second enzyme used inhibitor binder enzyme
  • modified papain which has the functionality to bind the protease inhibitor for cathepsin B and has a higher affinity for the protease inhibitor than cathepsin B itself, but which does not have the functionality Procathepsin B by proteolytic digestion in to convert the active form cathepsin B, and has no protease activity for the degradation of cathepsin B
  • the modified papain with inactive protease activity can be produced by
  • a) chemical modification of the SH group of the cysteine in the proteolytically active center of the papain preferably by reacting the papain with methyl methanethiosulfonate (MMTS), p-mercuribenzoate or AgN0 3 or by addition of N-substituted maleimide, or b) site-specific point mutation of the cysteine in the proteolytically active center of the papain by another amino acid.
  • MMTS methyl methanethiosulfonate
  • AgN0 3 p-mercuribenzoate
  • AgN0 3 N-substituted maleimide
  • the proteolytic activity for cathepsin B degradation is eliminated, but it still has the high affinity for papain binding of protease inhibitors of cystatins.
  • the modified papain with inactivated protease activity can be produced chemically, which is also suitable for modifying the papain in situ in the sample in order to eliminate its protease activity for cathepsin B only after a reaction time, if it has its proteolytic activity for the conversion of procathepsin B has performed in Cathepsin B.
  • a preferred chemical method for inactivating the protease activity of papain is the oxidation of the SH group of cysteine in the proteolytically active center of the papain. In a particularly preferred embodiment of the invention, this chemical oxidation of the SH group is carried out by reacting the papain with methyl methanethiosulfonate (MMTS).
  • the inactivation of the protease activity of papain may be achieved by sequestering the SH group with heavy metal compounds such as p-mercuric benzoate or AgNO 3 or by adding N-substituted maleimide to the SH group.
  • the modified papain with inactivated protease activity is prepared by exchange or site-specific point mutation of the cysteine in the proteolytically active center of papain by another amino acid.
  • the genetic engineering methods of cloning for such a replacement or production of a point mutation of the cysteine residue are familiar to the person skilled in the art, as well as the subsequent production of the papain mutant by expression in vitro or in vivo and subsequent isolation or purification.
  • the first enzyme (proteolysis enzyme) and the second enzyme (inhibitor binder enzyme) used are the same enzyme, namely papain, which has both the functionality, Procathepsin B by proteolytic digestion in the active form cathepsin B.
  • protease activity of the papain for the degradation of cathepsin B is inactivated after a reaction time in the sample or the papain is removed from the sample and is replaced by an enzyme which has no protease activity for the degradation of cathepsin B but has the functionality to bind the protease inhibitor for cathepsin B and has a higher affinity for the protease inhibitor than cathepsin B itself.
  • Papain is able to digest released Cathepsin B in the sample and thus withdraw the active Cathepsin B from the sample. It is believed that under optimal reaction conditions, active papain degrades about 4 to 5% of cathepsin B over a period of about five minutes. This does not occur with pepsin or cathepsin D. The degradation of cathepsin B by papain may be detrimental to the results, as less active cathepsin B is detected than was actually present in the biological sample. Papain must therefore be removed from the sample after a period of reaction or inactivated in terms of its protease activity for the degradation of cathepsin B. Embodiments of the method according to the invention for this purpose are described below.
  • the papain in the sample is transformed into a modified papain with inactivated protease activity for the degradation of Cathepsin B converted, wherein the modified papain with inactive protease activity can be produced by chemical modification of the SH group of cysteine in the proteolytically active center of papain, preferably by reacting the papain with methyl methanethiosulfonate (MMTS), p-mercuric benzoate or AgN0 3 or by addition of N-substituted maleimide.
  • MMTS methyl methanethiosulfonate
  • AgN0 3 p-mercuric benzoate
  • the papain retains its functionality for the withdrawal or binding of the protease inhibitor, but loses its protease activity, so that after inactivation of the papain, ie after its conversion into modified papain, the reaction mixture can be further processed without the temporal Course is at least critical in terms of the proteolytic degradation of cathepsin B.
  • the papain in the sample is removed from the sample after a reaction time and replaced by a modified papain which has no protease activity for the degradation of cathepsin B but the functionality to bind the protease inhibitor for cathepsin B and has a higher affinity for the protease inhibitor than cathepsin B itself, wherein the modified papain with inactive protease activity can be produced by
  • a) chemical modification of the SH group of the cysteine in the proteolytically active center of the papain preferably by reacting the papain with methyl methanethiosulfonate (MMTS), p-mercuribenzoate or AgN0 3 or by addition of N-substituted maleimide, or b) site-specific point mutation of the cysteine in the proteolytically active center of the papain by another amino acid.
  • MMTS methyl methanethiosulfonate
  • AgN0 3 p-mercuribenzoate
  • AgN0 3 N-substituted maleimide
  • the papain is preferably bound to a solid support which is first contacted with the liquid sample and removed from the sample after a reaction time.
  • the liquid sample may also be passed over the solid support with papain attached thereto to contact the sample with the papain.
  • the method according to the invention can advantageously be carried out in whole blood, blood plasma, blood serum or tissue homogenate as a biological sample. Particularly preferred is the use of blood serum as a biological sample because of the intrinsic fluorescence of certain components of the blood.
  • the method according to the invention can also be carried out in a tissue homogenate, but this requires in each case a tissue removal associated with a surgical procedure in the patient and the further processing of the tissue into a liquid sample. Blood serum and blood plasma are therefore particularly preferred over whole blood and tissue homogenate.
  • the determination of the activity of the active cathepsin B in the sample by contacting the sample with a substrate for Catsin B and detecting the proteolytic conversion of the substrate by the protease cathepsin B.
  • various substrates for cathepsin B can be used.
  • the substrate for cathepsin B particularly preferably comprises a di- or oligopeptide sequence and a fluorophore which can be split off from the oligopeptide sequence in the proteolytic conversion of the substrate by the protease cathepsin B, the fluorophore particularly preferably comprising 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (AFC) or 7- Amino-4-methylcoumarin (AMC), with AFC being most preferred.
  • AFC 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin
  • AMC 7- Amino-4-methylcoumarin
  • the fluorophore AFC or AMC is linked to the di- or oligopeptide sequence via the C-terminus. In the proteolytic reaction, the fluorophore is cleaved off the Dioder oligopeptide sequence.
  • Arg-Arg An example of a dipeptide sequence that is specifically recognized and cleaved by the cysteine protease cathepsin B is Arg-Arg.
  • the substrate thus suitable is, for example, Z-Arg-Arg-AFC, where Z represents a protective group, preferably an acetate group or a carboxybenzyl group.
  • the substrate for cathepsin B preferably has the property that the uncleaved substrate comprising the di- or oligopeptide sequence and the fluorophore has a maximum of the fluorescence emission wavelength, which is from the maximum of the fluorescence emission wavelength of the through Protease significantly different in the proteolytic reaction cleaved fluorophore, at least 20 nm, preferably at least 40 nm or more. If the wavelengths or the wavelength maxima of the fluorescence emission of the uncleaved substrate and of the cleaved fluorophore are the same or are close to one another, both the intrinsic fluorescence of the uncleaved substrate and the fluorescence emission of the cleaved fluorophore are detected during the measurement.
  • Such substrates and fluorophores having the same fluorescence emission wavelengths are known in the art. For these substrates, a measurement is consistent despite the matching fluorescence Emission wavelength possible if the intensity of the fluorescence emission of the fluorophore compared to that of the uncleaved substrate at the same or similar wavelength is significantly stronger. The amplification of the signal is then evaluated as a measure of enzyme activity as compared to an enzyme-free negative control.
  • a disadvantage of such substrates is that a significant result can be measured only at high enzymatic activity and thus a very significant increase in fluorescence emission, since the signal is often too weak at low enzymatic activity and not sufficiently strong from the basic fluorescence of the uncleaved substrate. The signal goes down in the background noise or at least does not stand out meaningfully.
  • a shift in the detection wavelength of the fluorescence emission between the substrate and the cleaved fluorophore has the particular advantage that essentially only the fluorophore cleaved from the substrate and thus only an enzymatic reaction actually taking place is detected at this wavelength.
  • the fluorescence emission is in the blue wavelength range (around 460 nm), whereas the pure fluorophore AFC shows a yellow-green fluorescence (around 505 nm). , This ensures a sufficient distance of the wavelengths between the uncleaved substrate and the cleaved by the enzymatic reaction pure fluorophore.
  • the use of the fluorophore AFC is particularly preferred over the fluorophore AMC because the fluorescence emission of the substrate consisting of the dipeptide Arg-Arg with the fluorophore AMC and the free fluorophore AMC are both in the blue wavelength range (around 460 nm). Discrimination between uncleaved substrate and cleaved fluorophore in this case is therefore only possible via the signal intensity, but not over the emission wavelength.
  • the biological sample may be removed in a variety of ways with the enzyme having a higher affinity for the protease inhibitor than cathepsin B itself and the functionality to remove the free inhibitor for cathepsin B present in the sample and the inhibited forms of cathepsin B to withdraw the protease inhibitor, are brought into contact.
  • the enzyme is added in free form, expediently in a buffered solution. The enzyme is distributed in the sample and binds the protease inhibitor per se and thus also withdraws the inhibitor from the cathepsin B present in the sample. For the measurement of the concentration or activity of cathepsin B in the subsequent process step, the enzyme in the sample can be loaded.
  • This variant has the particular advantage that the conversion of the procathepsin B into cathepsin B and the inhibition of the cathepsin B can be carried out in a simple manner in a single reaction vessel, for example in a cuvette for the subsequent fluorescence measurement of the subsequent enzyme assay.
  • the enzyme which has a higher affinity for the protease inhibitor than cathepsin B itself and has the functionality to remove the free inhibitor for cathepsin B present in the sample and the inhibited forms of cathepsin B den Protease inhibitor covalently or adsorptively to a solid support material, preferably to cellulose, particularly preferably covalently bonded to cellulose, wherein the covalent bond can be effected chemically or photochemically.
  • the use of a solid support material to which the enzyme with high affinity is bound to the protease inhibitor has the advantage that the enzyme with the protease inhibitor bound thereto from the sample for measuring the activity of cathepsin B does not remain in the sample, and thus also can not lead to disturbances.
  • the carrier material can have any shape.
  • the support material may be in the form of a sheet or strip of attached enzyme which is contacted with the sample by immersion. After a reaction time, the carrier material is removed from the sample again and then carried out the determination of the active cathepsin B.
  • the immersion in the sample can be carried out once or several times in order to remove the protease inhibitor as quantitatively as possible.
  • the carrier material can also be in other forms, which are suitable for close contacting of the liquid sample to the surface of the carrier material to which the enzyme is bound.
  • the support material may be in the form of thin tubes or capillaries, on the inner surface of which the enzyme is bound and through which the sample is passed.
  • the support material may further be in the form of particles, beads or the like, on the surface of which the enzyme is bound.
  • the step a) of contacting the sample with a first enzyme having the functionality, Procathepsin B by proteolytic digestion in the active Form to convert cathepsin B, with pepsin or cathepsin B as the first enzyme performed.
  • this step a) at a temperature in the range of 4 to 40 ° C, preferably 20 to 40 ° C and at a pH value in the range of 3.5 to 5.5, preferably in the range of 4.0 to 5.0, more preferably at about 4.5.
  • the enzyme pepsin has its highest proteolytic activity in the acidic pH range and is essentially inactive at a pH above 6.
  • the reaction conditions with respect to temperature and pH can be maintained. If a change in temperature and / or pH is required for an optimal effect of the second enzyme's inhibition, a change in reaction conditions is necessary. A change in the pH to a value which is better or optimal for the second enzyme can be varied by adding an appropriate acid or base or a corresponding buffer.
  • the invention also includes a method for the determination of the present in the sample proform of cathepsin B procathepsin B, in which
  • a second part of the same biological sample is subjected to a second determination of the potential available activity of cathepsin B according to the process described and claimed herein, but for the second determination, the process step a) is not carried out; Transferred sample Procathepsin B into the active form cathepsin B, (iii) the potential activity of cathepsin B potentially available from procathepsin B in the sample as the difference between the first (i) and second (ii) determinations.
  • the difference value thus obtained corresponds to the potential cathepsin B activity which would be obtained from the procathepsin B contained in the sample by conversion into cathepsin B.
  • Tissue homogenate is obtained from tissue samples by standard methods, portioned, filled into Eppendorf tubes and stored at the temperature of the liquid nitrogen until the measurement.
  • Papain covalently coupled to cellulose is present on filter paper with a diameter of 110 mm. This can be divided into 32 equal segments, each containing approximately the same amount of papain as 50 ⁇ papain agarose gel. Reaction of immobilized papain with methylmethanethiosulphonate (MMTS):
  • the suspension is supplemented with 5 mM MMTS and the reaction vessel, after complete inhibition, at 10,000 ⁇ M. centrifuged. From the supernatant 1 10 ⁇ are removed and transferred to a prepared 0.5 ml reaction vessel for the enzymatic determination of the activity of cathepsin B.
  • the serum sample is spiked with 5 mM MMTS and after completion of the inhibition, the cellulase piece is removed from the sample. Then 110 ⁇ of the serum sample are removed and transferred to a prepared 0.5 ml reaction vessel for the enzymatic determination of the activity of cathepsin B. Measurement of the activity of cathepsin B in the sample
  • the measurement signal is the same as the measurement signal obtained when the enzyme assay is used for inhibitor withdrawal. This proves that the value measured in the enzyme assay after inhibitor withdrawal is attributable to the released cathepsin B.

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung der potentiell verfügbaren Aktivität von Cathepsin B in einer biologischen Probe, einschließlich der Aktivität der aktiven Form von Cathepsin B, der aktivierbaren Form von Cathepsin B aus der in der Probe vorhandenen Proform Procathepsin B und der aktivierbaren Form von Cathepsin B, welche in der Probe durch Proteaseinhibitor hinsichtlich seiner Proteaseaktivität inhibiert vorliegt, wobei man in der Probe vorhandenes Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B überführt, in der Probe vorhandenen freien Proteaseinhibitor für Cathepsin B aus der Probe abreichert oder seine Inhibitorfunktion unterbindet und der inhibierten Form von Cathepsin B den Proteaseinhibitor entzieht und anschließend die Aktivität des in der Probe enthaltenen aktiven Cathepsin B bestimmt.

Description

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER PROTEASE CATHEPSIN B
IN EINER BIOLOGISCHEN PROBE
Gegenstand der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der potentiell verfügbaren Aktivität von Ca- thepsin B in einer biologischen Probe, einschließlich der Aktivität der aktiven Form von Cathepsin B, der aktivierbaren Form von Cathepsin B aus der in der Probe vorhandenen Proform Pro- cathepsin B und der aktivierbaren Form von Cathepsin B, welche in der Probe durch Proteasein- hibitor hinsichtlich seiner Proteaseaktivität inhibiert vorliegt.
Hintergrund der Erfindung
Zur Bestimmung der Konzentration von Enzymen in Gewebeextrakten oder in Körperflüssigkei- ten, zum Beispiel im Blutserum, stehen enzymatische Tests und immunologische Tests, zum Beispiel ELISA, zur Verfügung. Für die medizinische Analyse und Diagnostik ist es häufig wichtig, die in einer Probe vorhandene Menge an intaktem und aktivem Enzym zu bestimmen, um Aussagen über Krankheitsursachen, Krankheitsauswirkungen und/oder Krankheitsprognosen treffen zu können. Dauerhaft inaktive Enzyme, wie beispielsweise denaturierte Enzyme oder Fragmente von Enzymen, spielen häufig keine entscheidende Rolle, weshalb sie bei der Konzentrationsbe- Stimmung unberücksichtigt bleiben können und häufig sogar sollen.
Andere Formen inaktiver Enzyme, wie beispielsweise durch Inhibitoren zeitweilig und reversibel in ihrer Aktivität gehemmte Enzyme oder Enzymvorläufer, sogenannte Proenzyme, können hingegen eine entscheidende Rolle bei Krankheitsursachen, Krankheitsauswirkungen und/oder Krankheitsprognosen spielen. Diese Formen inaktiver Enzyme können unter bestimmten Bedingungen in ihre aktiven Formen überführt werden, wenn ihre Enzymaktivität für biologische Vorgänge erforderlich ist. Es werden dann beispielsweise die Inhibitoren durch bestimmte Mechanismen inaktiviert oder von den Enzymen entfernt oder Proenzyme in ihre aktiven Formen überführt. Die Gesamtkonzentrationen aktiver und zeitweilig inaktiver Enzyme im Gewebe oder in Körperflüssigkeiten können wichtige Hinweise auf bestimmte Krankheiten darstellen.
Enzymatische Tests zur Bestimmung der Konzentration von Enzymen nutzen die von den aktiven Enzymen durchgeführten oder katalysierten Reaktionen. Sollen jedoch auch solche Enzymfor- men erfasst werden, die in einer biologischen Probe in der zeitweilig inhibierten inaktiven Form und/oder als inaktives Proenzym vorliegen, was beispielsweise häufig für Proteasen zutrifft, können diese Enzymformen in solchen Tests aufgrund ihrer Inaktivität nicht erfasst werden. Die in einer Probe meßbare Enzymaktivität stimmt daher häufig nicht mit der tatsächlich zur Verfügung stehenden Enzymaktivität überein, weil wenigstens ein Teil der Enzymaktivität durch Inhibitoren gehemmt ist oder in der inaktiven Form der Proenzyme vorliegt.
Es ist bekannt, dass in von Krebs befallenen Gewebeproben von Krebspatienten ein erhöhter Spiegel der lysosomalen Cysteinprotease Cathepsin B im Vergleich zu entsprechenden Gewe- beproben von gesunden Probanden vorliegt. Cathepsin B wird daher als diagnostischer und prognostischer Faktor im Krebsgeschehen angesehen. Dabei liegt ein Teil des Cathepsin B in einer durch Cystatine inhibierten Form vor. Die hier interessierenden Cysteinproteaseinhibitoren gehören der Superfamilie der Cystatine an, dabei sind das Cystatin A und das Cystatin B aus der Familie I intrazellulär wirksam, das Cystatin C aus der Familie II ist extrazellulär, also auch im Blutserum, wirksam.
Die WO 97/00969 schlägt daher zur enzymatischen Bestimmung der Konzentration von Cathepsin B vor, dem inhibierten Cathepsin B in Gewebeproben die Cystatininhibitoren affini- tätschromatographisch zu entziehen, indem man eine biologische Probe über eine Affini- tätschromatographiesäule mit kovalent an Sepharosegel gebundenem Papain laufen lässt. Papain, bei dem es sich ebenfalls um eine Cysteinprotease handelt, besitzt eine höhere Bindungsaffinität zu Cystatinen als die Cathepsine, weshalb das Papain dem Cathepsin den Inhibitor entzieht. Anschließend wird die Aktivität von deinhibiertem Cathepsin B unter Nutzung seiner enzymatischen Aktivität bestimmt.
Es wurde festgestellt, dass man, anders als in Gewebeproben, im Blutserum ohne Deinhibierung keine Aktivität von Cathepsin B messen kann. Es wird daher angenommen, dass im Blutserum das gesamte Cathepsin B in einer inaktiven Form vorliegt. Mit direktem ELISA durchgeführte Messungen haben gezeigt, dass im Blutserum von Prostatakrebspatienten der Summenwert aus Procathepsin B, der Proform von Cathepsin B, und dem Cathepsin B um etwa das 3-fache gegenüber dem Wert von gesunden Probanden erhöht ist, während gleichzeitig die Aktivität von Cathepsin B, das vor der Messung deinhibiert wurde, im Blutserum nur um etwa 30% gegenüber gesunden Probanden erhöht war. Und mit einem Sand- wich-ELISA wurde für den Summenwert der Konzentrationen von Cathepsin B und Procathepsin B im Blutserum von Coloncarcinompatienten eine etwa 5-fache Erhöhung gegenüber gesunden Probanden gemessen. Deshalb geht man davon aus, dass die Konzentration von Procathepsin B oder der Summenwert aus den Konzentrationen von Cathepsin B und Procathepsin B ein stärkerer Indikator für Krebskrankheiten ist als der Wert von Cathepsin B alleine.
In immunologischen Tests, wie dem ELISA, werden die in einer Probe vorhandenen Enzyme spezifisch mittels Antikörpern nachgewiesen. Der immunologische Test ist zwar in der Regel sensitiver als der enzymatische Test, jedoch unterscheiden die Antikörper meist nicht zwischen aktivem Enzym und durch Inhibitoren gehemmtem Enzym, so dass diese Tests die Gesamtmenge aus aktivem und gehemmtem Enzym erfassen. Je nach eingesetztem Antikörper können in solchen immunologischen Tests auch Proenzyme, dauerhaft inaktives Enzym und zu einem ge- wissen Anteil möglicherweise auch denaturiertes Enzym erfasst werden. Da es für die Beurteilung von Krankheitsursachen, Krankheitsauswirkungen und/oder Krankheitsprognosen durch Enzyme in der Regel auf die aktiven und aktivierbaren Enzyme ankommt, weil diese letztendlich biologische Vorgänge auslösen oder katalysieren, können solche immunologischen Tests, welche auch dauerhaft inaktive Formen der Enzyme erfassen, die gewünschte Aussagekraft des durchgeführten Tests verfälschen und sind für die medizinische Analytik und Diagnostik nur bedingt geeignet. Darüber hinaus erfordern immunologische Tests häufig einen hohen apparativen und zeitlichen Aufwand, weshalb sie kostenintensiv sind und im medizinischen Bereich in der Regel nur in speziellen Labors ausgeführt werden können.
Aufgabe der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, ein Verfahren zur Bestimmung der insbesondere für die Krebsdiagnostik bedeutenden Protease Cathepsin B bereitzustellen, wel- ches gegenüber bekannten immunologischen Verfahren einfacher und kostengünstiger ist und gleichzeitig geeignet ist, in einer biologischen Probe, insbesondere in Blut, Blutplasma oder Blutserum, aktives Cathepsin B, durch Inhibitoren reversibel inaktiviertes Cathepsin B und Procathepsin B zu bestimmen und Fehler durch die Erfassung von dauerhaft inaktivem Cathepsin B auszuschließen.
Beschreibung der Erfindung
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Bestimmung der potentiell verfügbaren Aktivi- tät von Cathepsin B in einer biologischen Probe, einschließlich der Aktivität der aktiven Form von Cathepsin B, der aktivierbaren Form von Cathepsin B aus der in der Probe vorhandenen Proform Procathepsin B und der aktivierbaren Form von Cathepsin B, welche in der Probe durch Protea- seinhibitor hinsichtlich seiner Proteaseaktivität inhibiert vorliegt, mit den Stufen, in denen man a) in der Probe vorhandenes Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B überführt durch a.i) Inkontaktbringen der Probe mit einem ersten Enzym (Proteolyse-Enzym), welches die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen, oder
a. ii) Absenken des pH-Wertes auf einen Wert, bei dem Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B überführt wird, b) in der Probe vorhandenen freien Proteaseinhibitor für Cathepsin B aus der Probe abreichert oder seine Inhibitorfunktion unterbindet und der inhibierten Form von Cathepsin B den Proteaseinhibitor entzieht durch Inkontaktbringen der Probe mit einem zweiten Enzym (Inhibitorbinder- Enzym), welches die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, wobei
b. i) das eingesetzte erste Enzym (Proteolyse-Enzym) und das zweite Enzym (Inhibitorbinder- Enzym) das gleiche Enzym sind mit der Maßgabe, dass das Enzym sowohl die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen als auch den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst,
oder
b.ii) das eingesetzte zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) von dem ersten Enzym (Proteolyse- Enzym), sofern eingesetzt, verschieden ist,
wobei
- das zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) ein Enzym ist, welches keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B besitzt, oder
- das zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) ein Enzym ist, welches Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B besitzt, und diese Proteaseaktivität des zweiten Enzyms für den Abbau von Cathepsin B nach einer Reaktionsdauer der Stufe b) in der Probe inaktiviert wird oder das zweite Enzym aus der Probe entfernt und durch ein Enzym ersetzt wird, welches keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B aber die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Ca- thepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, c) Inkontaktbringen der Probe mit einem Substrat für Cathepsin B und Erfassen der proteolytischen Umsetzung des Substrates durch die Protease Cathepsin B.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet die "potentiell verfügbare Aktivität" von Cathepsin B in einer biologischen Probe die Aktivität von Cathepsin B, die zur Verfügung steht, wenn man neben der in der Probe vorliegenden aktiven Form von Cathepsin B auch die zeitweilig inaktiven Formen von Cathepsin B, wie Procathepsin B und reversibel inhibierte Formen von Cathepsin B, in die aktiven Formen überführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der potentiell verfügbaren Aktivität von Ca- thepsin B in einer biologischen Probe beruht darauf, dass alle in der biologischen Probe vorliegenden aktiven und aktivierbaren Formen von Cathepsin B, d.h. die aktive Form von Cathepsin B, durch Proteaseinhibitor reversibel gehemmte Formen von Cathepsin B und die biologische Vorstufe Procathepsin B, zunächst in eine aktive Form überführt werden, und dann eine für Cathepsin B spezifische enzymatische Umsetzung eines für Cathepsin B spezifischen Substrates durchführt.
In einer ersten Stufe a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B überführt. Dies wird vorzugsweise enzymatisch erreicht, indem man die Probe mit einem ersten Enzym (Proteolyse-Enzym) in Kontakt bringt, welches die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen. Alternativ kann Procathepsin in der Probe auch durch Absenken des pH-Wertes in die aktive Form Cathepsin B überführt werden. Dafür ist die Probe, die üblicherweise einen physiologischen pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 hat, auf einen niedrigeren pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 5,5, vorzugsweise im Bereich von 4,0 bis 5,0, besonders bevorzugt etwa 4,5 einzustellen, bei der die Proregion von Procathepsin B abgespalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahrens ist das erste Enzym (Proteolyse-Enzym), welches die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen und welches mit der Probe in Kontakt gebracht wird, eine Hydrolase ohne Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B, vorzugsweise Pepsin oder Cathepsin D oder Cathepsin C oder Thermolysin oder Pronase, besonders bevorzugt Pepsin oder Cathepsin D. Bei dieser Ausführungsform ist das eingesetzte zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) von dem ersten Enzym (Proteolyse-Enzym) verschieden, da die vorgenannten Hydrolasen in der Regel nicht die Funktionalität besitzen, den Proteaseinhi- bitor für Cathepsin B zu binden. Besonders bevorzugt ist das erste Enzym Pepsin. Die vorgenannten Hydrolasen sind zwar geeignet, die Proregion von Procathepsin B proteolytisch abzuspalten und Procathepsin B so in Cathepsin B zu überführen, jedoch wird das Produkt Cathepsin B von Pepsin oder Cathepsin D nicht signifikant weiter verdaut. In einer ersten Variante dieses Verfahrens, bei dem das erste Enzym (Proteolyse-Enzym) eine Hydrolase ohne Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B ist, aber welches die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen, ist das eingesetzte zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) Papain, welches die Funktiona- lität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, wobei die Proteaseaktivität des Papains für den Abbau von Cathepsin B nach einer Reaktionsdauer in der Probe inaktiviert wird oder das Papain aus der Probe entfernt und durch ein Enzym ersetzt wird, welches keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B besitzt, aber die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden, und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst.
In einer zweiten Variante des Verfahrens, bei dem das erste Enzym (Proteolyse-Enzym) eine Hydrolase ohne Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B ist, aber welches die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen, ist das eingesetzte zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) modifiziertes Papain, welches die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, welches aber nicht die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen, und keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B besitzt, wobei das modifizierte Papain mit inaktiver Proteaseaktivität herstellbar ist durch
a) chemische Modifizierung der SH-Gruppe des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain, vorzugsweise durch Umsetzung des Papain mit Methylmethanthiosulfonat (MMTS), p- Mercuribenzoat oder AgN03 oder durch Addition von N-substituiertem Maleinimid, oder b) ortsspezifische Punktmutation des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain durch eine andere Aminosäure.
Bei dem erfindungsgemäß„modifizierten" Papain ist die proteolytische Aktivität für den Abbau von Cathepsin B ausgeschaltet, es besitzt jedoch nach wie vor die dem Papain eigene hohe Affinität für die Bindung der Proteaseinhibitoren der Cystatine.
Das modifizierte Papain mit inaktivierter Proteaseaktivität kann auf chemischem Wege hergestellt werden, was sich auch für die Modifizierung des Papains in situ in der Probe eignet, um dessen Proteaseaktivität für Cathepsin B erst nach einer Reaktionsdauer auszuschalten, wenn es seine proteolytische Aktivität für die Überführung von Procathepsin B in Cathepsin B ausgeführt hat. Ein bevorzugtes chemisches Verfahren zur Inaktivierung der Proteaseaktivität von Papain ist die Oxidation der SH-Gruppe des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt diese chemische Oxidation der SH- Gruppe durch Umsetzung des Papain mit Methylmethanthiosulfonat (MMTS). Alternativ kann die Inaktivierung der Proteaseaktivität von Papain durch Maskierung der SH-Gruppe mit Schwermetallverbindungen wie p-Mercuribenzoat oder AgN03 oder durch Addition von N-substituiertem Maleinimid an die SH-Gruppe erreicht werden. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung wird das modifizierte Papain mit inaktivierter Proteaseaktivität durch Austausch bzw. ortsspezifische Punktmutation des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain durch eine andere Aminosäure hergestellt. Die gentechnisch anzuwendenden Verfahren der Klonierung für einen solchen Austausch bzw. Herstellung einer Punktmutation des Cystein-Restes sind dem Fachmann auf dem Gebiet geläufig, wie auch die anschließende Produktion der Papain-Mutante durch Expression in vitro oder in vivo und anschließende Isolierung bzw. Aufreinigung. In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind das eingesetzte erste Enzym (Proteolyse-Enzym) und das zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) das gleiche Enzym, nämlich Papain, welches sowohl die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen als auch den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, wobei die Proteaseaktivität des Papains für den Abbau von Cathepsin B nach einer Reaktionsdauer in der Probe inaktiviert wird oder das Papain aus der Probe entfernt und durch ein Enzym ersetzt wird, welches keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B besitzt, aber die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst.
Papain kann freigesetztes Cathepsin B in der Probe verdauen und der Probe damit aktives Cathepsin B entziehen. Es wird davon ausgegangen, dass aktives Papain unter optimalen Reaktionsbedingungen in einem Zeitraum von etwa fünf Minuten etwa 4 bis 5 % des Cathepsin B abbaut. Dies tritt bei Pepsin oder Cathepsin D nicht auf. Der Abbau von Cathepsin B durch Papain kann mit Nachteil zu einer Verfälschung der Ergebnisse führen, da weniger aktives Cathepsin B bestimmt wird, als tatsächlich in der biologischen Probe vorhanden war. Papain muss daher nach einer Reaktionsdauer aus der Probe entfernt oder hinsichtlich seiner Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B inaktiviert werden. Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens hierfür werden nachfolgend beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem Papain als erstes und zweites Enzym oder nur als das zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) eingesetzt wird, wird nach einer Reaktionsdauer das Papain in der Probe in ein modifiziertes Papain mit inaktivierter Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B überführt, wobei das modifizierte Papain mit inaktiver Proteaseaktivität herstellbar ist durch chemische Modifizierung der SH- Gruppe des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain, vorzugsweise durch Umsetzung des Papain mit Methylmethanthiosulfonat (MMTS), p-Mercuribenzoat oder AgN03 oder durch Addition von N-substituiertem Maleinimid. Das Papain behält dabei seine Funktionalität für den Entzug bzw. die Bindung des Proteaseinhi- bitors bei, verliert jedoch seine Proteaseaktivität, sodass nach der Inaktivierung des Papain, d.h. nach seiner Überführung in modifiziertes Papain, der Reaktionsansatz weiter verarbeitet werden kann, ohne dass der zeitliche Verlauf zumindest hinsichtlich des proteolytischen Abbaus von Cathepsin B kritisch ist.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem Papain als erstes und zweites Enzym oder nur als das zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) eingesetzt wird, wird nach einer Reaktionsdauer das Papain in der Probe aus der Probe entfernt und durch ein modifiziertes Papain ersetzt, welches keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B aber die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, wobei das modifizierte Papain mit inaktiver Proteaseaktivität herstellbar ist durch
a) chemische Modifizierung der SH-Gruppe des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain, vorzugsweise durch Umsetzung des Papain mit Methylmethanthiosulfonat (MMTS), p- Mercuribenzoat oder AgN03 oder durch Addition von N-substituiertem Maleinimid, oder b) ortsspezifische Punktmutation des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain durch eine andere Aminosäure.
Um das Entfernen des Papain aus der Probe einfach ausführen zu können, ist das Papain vorzugsweise an einen festen Träger gebunden, der zunächst mit der flüssigen Probe in Kontakt gebracht und nach einer Reaktionsdauer von der Probe entfernt wird. Die flüssige Probe kann auch über den festen Träger mit daran gebundenem Papain geführt werden, um die Probe mit dem Papain in Kontakt zu bringen.
Da innerhalb von fünf Minuten etwa 4 bis 5 % freies Cathepsin B durch vollständig intaktes Papain verdaut werden, erfolgt in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens der vorgenannten Varianten, bei der zunächst intaktes Papain für eine Reaktionsdauer mit der Probe in Kontakt gebracht und dann in modifiziertes Papain überführt oder aus der Probe entfernt wird, die Inaktivierung oder Entfernung der Proteaseaktivität nach einer Reaktionsdauer der Deinhibie- rungsstufe b) von fünf Minuten, besonders bevorzugt nach einer Reaktionsdauer von drei Minuten, ganz besonders bevorzugt nach einer Reaktionsdauer von einer Minute. Je schneller das Inaktivieren oder Entfernen des aktiven intakten Papains erfolgt, desto geringer ist der Abbau von Cathepsin B und damit die Abweichung der gemessenen Aktivität von Cathepsin B gegenüber der tatsächlichen potentiell verfügbaren Aktivität von Cathepsin B in der biologischen Probe. Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit Vorteil in Vollblut, Blutplasma, Blutserum oder einem Gewebehomogenat als biologische Probe durchgeführt werden. Besonders bevorzugt ist wegen der Eigenfluoreszenz bestimmter Bestandteile des Bluts die Verwendung von Blutserum als biologische Probe. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in einem Gewebehomogenat durchgeführt werden, allerdings erfordert dieses jeweils eine mit einem chirurgischen Eingriff verbundene Gewebeentnahme bei dem Patienten und die Weiterverarbeitung des Gewebes zu einer flüssigen Probe. Blutserum und Blutplasma sind daher gegenüber Vollblut und Gewebehomogenat besonders bevorzugt. Nach der erfindungsgemäßen Überführung von Procathepsin B in Cathepsin B und nach der Entfernung von freiem Inhibitor für Cathepsin B aus der Probe und der Deinhibierung von Cathepsin B durch Entzug des Proteaseinhibitors mittels eines Enzyms, welches eine höhere Affinität für den Proteaseinhibitor besitzt als das Cathepsin B selbst, erfolgt die Bestimmung der Aktivität des aktiven Cathepsin B in der Probe durch Inkontaktbringen der Probe mit einem Substrat für Ca- thepsin B und Erfassen der proteolytischen Umsetzung des Substrates durch die Protease Cathepsin B. Hierfür können verschiedene Substrate für Cathepsin B eingesetzt werden. Besonders bevorzugt umfasst das Substrat für Cathepsin B eine Di- oder Oligopeptidsequenz und ein bei der proteolytischen Umsetzung des Substrates durch die Protease Cathepsin B von der Oligopeptidsequenz abspaltbares Fluorophor, wobei das Fluorophor besonders bevorzugt 7-Amino-4- trifluormethylcumarin (AFC) oder 7-Amino-4-methylcumarin (AMC) ist, wobei AFC ganz besonders bevorzugt ist. Das Fluorophor AFC oder AMC ist über den C-Terminus mit der Di- oder Oligopeptidsequenz verbunden. Bei der proteolytischen Reaktion wird das Fluorophor von der Dioder Oligopeptidsequenz abgespalten. Ein Beispiel für eine Dipeptidsequenz, welche von der Cysteinprotease Cathepsin B spezifisch erkannt und gespalten wird, ist Arg-Arg. Als Substrat eignet sich somit zum Beispiel Z-Arg-Arg-AFC, wobei Z eine Schutzgruppe darstellt, vorzugsweise eine Acetatgruppe oder eine Carboxybenzylgruppe.
Das Substrat für Cathepsin B besitzt vorzugsweise die Eigenschaft, dass das ungespaltene Substrat, welches die Di- oder Oligopeptidsequenz und das Fluorophor umfasst, ein Maximum der Fluoreszenz-Emissions-Wellenlänge besitzt, das sich von dem Maximum der Fluoreszenz- Emissions-Wellenlänge des durch die Protease bei der proteolytischen Reaktion abgespaltenen Fluorophors deutlich unterscheidet, wenigstens um 20 nm, vorzugsweise wenigstens um 40 nm oder mehr. Sind die Wellenlängen bzw. die Wellenlängenmaxima der Fluoreszenz-Emission des ungespaltenen Substrats und des abgespaltenen Fluorophors gleich oder liegen sie eng beiein- ander, so werden bei der Messung sowohl die Eigenfluoreszenz des ungespaltenen Substrats als auch die Fluoreszenz-Emission des abgespaltenen Fluorophors erfasst. Solche Substrate und Fluorophore mit gleichen Fluoreszenz-Emissions-Wellenlängen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Bei diesen Substraten ist eine Messung trotz der übereinstimmenden Fluoreszenz- Emissions-Wellenlänge möglich, wenn die Intensität der Fluoreszenz-Emission des Fluorophors gegenüber derjenigen des ungespaltenen Substrats bei gleicher oder ähnlicher Wellenlänge deutlich stärker ist. Die Verstärkung des Signals wird dann im Vergleich zu einer enzymfreien Negativkontrolle als ein Maß für die Enzymaktivität ausgewertet. Ein Nachteil solcher Substrate besteht jedoch darin, dass ein signifikantes Ergebnis erst bei starker enzymatischer Aktivität und somit einer sehr deutlichen Erhöhung der Fluoreszenz-Emission gemessen werden kann, da das Signal bei geringer enzymatischer Aktivität häufig zu schwach ist und sich nicht ausreichend stark von der Grundfluoreszenz des ungespaltenen Substrats unterscheidet. Das Signal geht im Hintergrundrauschen unter oder hebt sich zumindest nicht aussagekräftig davon ab.
Eine Verschiebung der Detektionswellenlänge der Fluoreszenz-Emission zwischen dem Substrat und dem abgespaltenen Fluorophor hat den besonderen Vorteil, dass bei dieser Wellenlänge im Wesentlichen nur das von dem Substrat abgespaltene Fluorophor und damit nur eine tatsächlich stattgefundene enzymatische Reaktion erfasst wird. Je weiter die Emissionswellenlänge des ab- gespaltenen Fluorophors von der Fluoreszenz-Wellenlänge des Substrats entfernt ist, desto empfindlicher kann die Bestimmung der Proteaseaktivität sein.
Für das Substrat aus dem Dipeptid Arg-Arg mit dem an dessen C-Terminus kovalent gebundenen Fluorophor AFC liegt die Fluoreszenz-Emission im blauen Wellenlängenbereich (um 460 nm), wogegen das reine Fluorophor AFC eine gelb-grüne Fluoreszenz zeigt (um 505 nm). Dies gewährleistet einen ausreichenden Abstand der Wellenlängen zwischen dem ungespaltenen Substrat und dem durch die enzymatische Reaktion abgespaltenen reinen Fluorophor. Die Verwendung des Fluorophors AFC ist gegenüber dem Fluorophor AMC besonders bevorzugt, da die Fluoreszenz-Emission des aus dem Dipeptid Arg-Arg mit dem Fluorophor AMC bestehenden Substrats und des freien Fluorophors AMC beide im blauen Wellenlängenbereich (um 460 nm) liegen. Eine Diskriminierung zwischen ungespaltenem Substrat und gespaltenem Fluorophor ist in diesem Fall daher nur über die Signalintensität möglich, nicht jedoch über die Emissionswellenlänge. In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die biologische Probe auf verschiedene Weisen mit dem Enzym, das eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst und die Funktionalität besitzt, den in der Probe vorliegenden freien Inihitor für Cathepsin B zu entfernen und den inhibierten Formen von Cathepsin B den Proteaseinhibitor zu entziehen, in Kontakt gebracht werden. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Enzym in freier Form, zweckmäßigerweise in einer gepufferten Lösung, zugegeben. Das Enzym verteilt sich in der Probe und bindet den Proteaseinhibitor an sich und entzieht den Inhibitor somit auch dem in der Probe befindlichen Cathepsin B. Für die Messung der Konzentration bzw. Aktivität des Cathepsin B in der anschließenden Verfahrensstufe kann das Enzym in der Probe belas- sen werden, sofern es die spezifische proteolytische Umsetzung des Substrates durch die Protease Cathepsin B und die anschließende Messung nicht stört. Diese Variante hat den besonderen Vorteil, dass die Überführung des Procathepsin B in Cathepsin B und die Deinhibierung des Cathepsin B auf einfache Weise in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt werden können, beispielsweise in einer Küvette für die anschließende Fluoreszenzmessung des anschließenden Enzymassay.
In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Enzym, welches eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst und die Funkti- onalität besitzt, den in der Probe vorliegenden freien Inhibitor für Cathepsin B zu entfernen und den inhibierten Formen von Cathepsin B den Proteaseinhibitor zu entziehen, kovalent oder ad- sorptiv an ein festes Trägermaterial, vorzugsweise an Zellulose, besonders bevorzugt kovalent an Zellulose gebunden, wobei die kovalente Bindung chemisch oder photochemisch erfolgen kann.
Die Verwendung eines festen Trägermaterials, an dem das Enzym mit der hohen Affinität zu dem Proteaseinhibitor gebunden ist, hat den Vorteil, dass das Enzym mit dem aus der Probe daran gebundenen Proteaseinhibitor für die Messung der Aktivität des Cathepsin B nicht in der Probe verbleibt und somit auch nicht zu Störungen führen kann. Das Trägermaterial kann jede Form haben. Beispielsweise kann das Trägermaterial in der Form einer Folie oder eines Streifens mit darauf gebundenem Enzym vorliegen, die/der mit der Probe durch Eintauchen in Kontakt gebracht wird. Nach einer Reaktionsdauer wird das Trägermaterial wieder aus der Probe entfernt und anschließend die Bestimmung des aktiven Cathepsin B durchgeführt. Das Eintauchen in die Probe kann einmal oder mehrfach durchgeführt werden, um den Proteaseinhibitor möglichst quantitativ zu entziehen.
Das Trägermaterial kann aber auch in anderen Formen vorliegen, welche sich für ein enges In- kontaktbringen der flüssigen Probe der Oberfläche des Trägermaterials, an welche das Enzym gebunden ist, eignen. Beispielsweise kann das Trägermaterial die Form von dünnen Schläuchen oder Kapillaren haben, auf deren innerer Oberfläche das Enzym gebunden ist und durch welche die Probe hindurchgeleitet wird. Das Trägermaterial kann weiterhin in der Form von Partikeln, Kügelchen oder Ähnlichem vorliegen, auf deren Oberfläche das Enzym gebunden ist. Durch Einbringen des partikulären Materials in die flüssige Probe und gegebenenfalls Bewegen der Partikel in der Probe wird das Enzym mit der Probe in innigen Kontakt gebracht und anschließend durch Zentrifugation, Absetzen lassen, Filtration oder einfaches Abpipettieren der flüssigen Probe abgetrennt. Wie oben beschrieben, wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die Stufe a) des Inkontaktbringens der Probe mit einem ersten Enzym, welches die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen, mit Pepsin oder Cathepsin B als erstes Enzym durchgeführt. Zweckmäßigerweise wird diese Stufe a) bei einer Temperatur im Bereich von 4 bis 40 °C, vorzugsweise 20 bis 40 °C und bei einem pH-Wert Wert im Bereich von 3,5 bis 5,5, vorzugsweise im Bereich von 4,0 bis 5,0, besonders bevorzugt bei etwa 4,5 durchgeführt. Das Enzym Pepsin be- sitzt im sauren pH-Wert-Bereich seine höchste proteolytische Aktivität und ist bei einem pH-Wert über 6 im Wesentlichen inaktiv. Es ist daher zweckmäßig, die biologische Probe auf einen pH- Wert in dem vorgenannten Bereich einzustellen bzw. zu puffern, um einen optimalen proteolytischen Verdau durch Pepsin oder Cathepsin B zu gewährleisten. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die nachfolgende Stufe b) des Inkontaktbringens der Probe mit einem zweiten Enzym, welches eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst und die Funktionalität besitzt, den in der Probe vorliegenden freien Inhibitor zu entfernen und den inhibierten Formen von Cathepsin B den Proteaseinhibitor zu entziehen, bei einer Temperatur im Bereich von 4 bis 40 °C, vorzugsweise 20 bis 40 °C und bei einem pH-Wert im Bereich von 2 bis 7, bevorzugt zwischen 4,5 und 6 durchgeführt wird.
Wenn das zweite Enzym unter den gleichen Bedingungen seine deinhibierende Funktionalität ausübt wie sie in der vorgenannten Stufe a) der Spaltung von Procathepsin B angewendet wer- den, können die Reaktionsbedingungen hinsichtlich Temperatur und pH-Wert beibehalten werden. Falls eine Änderung der Temperatur und/oder des pH-Wertes für eine optimale Wirkung der Deinhibierung durch das zweite Enzym erforderlich ist, so ist eine Änderung der Reaktionsbedingungen notwendig. Eine Veränderung des pH-Wertes auf einen für das zweite Enzym besseren oder optimalen Wert lässt sich durch Zugabe geeigneter Säure oder Base oder eines entspre- chenden Puffers variieren.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Bestimmung der in der Probe vorhandenen Proform von Cathepsin B Procathepsin B, bei dem man
i) mit einem ersten Teil einer biologischen Probe eine erste Bestimmung der potentiell verfügba- ren Aktivität von Cathepsin B gemäß dem hierin beschriebenen und beanspruchten Verfahren durchführt, bei dem man auch in der Verfahrensstufe a) in der Probe vorhandenes Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B überführt,
ii) mit einem zweiten Teil der gleichen biologischen Probe eine zweite Bestimmung der potentiell verfügbaren Aktivität von Cathepsin B gemäß dem hierin beschriebenen und beanspruchten Ver- fahren durchführt, wobei man jedoch für die zweite Bestimmung die Verfahrensstufe a) nicht durchführt, bei der man in der Probe vorhandenes Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B überführt, iii) die aus Procathepsin B in der Probe potentiell verfügbare Aktivität von Cathepsin B als Differenzwert zwischen der ersten Bestimmung i) und der zweiten Bestimmung ii) ermittelt.
Der so ermittelte Differenzwert entspricht der potentiellen Cathepsin B-Aktivität, die man aus dem in der Probe enthaltenen Procathepsin B durch Umwandlung in Cathepsin B erhalten würde.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und bevorzugten Ausführungsformen weiter erläutert.
1) Probenpräparation und Probenbereitstellunq
1.a) Vollblut wird nach Standardverfahren zur Gerinnung gebracht und daraus nach Zentrifu- gation das Blutserum gewonnen. Dieses wird portioniert, in Eppendorfgefäße abgefüllt und bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs bis zur Versuchsdurchführung gelagert.
1. b) Gewebehomogenat wird aus Gewebeproben nach Standardverfahren gewonnen, portioniert, in Eppendorfgefäße abgefüllt und bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs bis zur Vermessung gelagert.
2) Überführen von Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B in der Probe
2. a) Durch Inkontaktbringen mit Pepsin:
Da der optimale pH-Wert für die Überführung von Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B bei 4,5 liegt, werden die folgenden Versuche bei diesem pH-Wert durchgeführt. Hierzu werden 0,2 ml der Serumprobe mit Acetatpuffer (pH=4,5) 1 :1 verdünnt, in dem das Pepsin (vom Schwein) bereits gelöst ist. Die Inkubation dieser Lösung erfolgt bei 30 °C über zwanzig Minuten. Danach wird die Lösung für den Enzymassay mit Phospatpuffer wieder auf pH=6 eingestellt.
2.b) Durch Inkontaktbringen mit Cathepsin D:
Auch für diese Überführung werden 0,2 ml der Serumprobe mit Acetatpuffer auf pH=4,5 1 :1 verdünnt, in dem das humane Cathepsin D bereits gelöst ist. Die Inkubation dieser Lösung erfolgt bei 37 °C für vier Stunden. Danach wird die Lösung für den Enzymassay mit Phosphatpuffer auf pH=6 eingestellt.
2.c) Durch Absenken des pH-Wertes: Eine Serumprobe von 0,2 ml wird mit Acetpuffer 1 :1 verdünnt und damit der pH-Wert auf 4,5 gebracht und bei 30 °C vierzig Minuten inkubiert. Danach wird die Lösung für den En- zymassay mit Phosphatpuffer auf pH=6 eingestellt. Herstellung von "modifiziertem" Papain mit inaktivierter Protelovsefunktion Vorbehandlung des immobilisierten Papain:
Handelsüblich erhältliche Papain-Agarose ist in 50 % Glycerin enthaltendem, wässrigem Na-Acetat-Puffer (0,1 M, pH=4,5 0,05 % Na-N3) suspendiert. Diese Lösung wird zuerst gegen Phospatpuffer pH=6 ausgetauscht. Pro Enzymassay werden 50 μΙ Papain- Agarosegel (= 100 μΙ Suspension) eingesetzt. Dies entspricht 5,5*10"10 Mol Papain. Für 32 Bestimmungen werden dementsprechend 3,2 ml Suspension eingesetzt. Der Austausch durch Phosphatpuffer geschieht durch eine viermalige Folge von Pufferzugabe, Resuspension, Zentrifugation und Abnahme des Überstandes, der verworfen wird.
An Zellulose kovalent gekoppeltes Papain liegt auf Filterpapier mit einem Durchmesser von 110 mm vor. Dieses kann in 32 gleich große Segmente geteilt werden, wobei jedes Segment ungefähr denselben Anteil an Papain enthält wie 50 μΙ Papain-Agarosegel. Umsetzung des immobilisierten Papain mit Methylmethanthiosulfonat (MMTS):
Das Papain-Agarosegel, das man in der oben beschriebenen Weise erhält, wird mit einer Phospatpufferlösung (pH=6), die 5mM MMTS enthält, versetzt und resuspendiert. Für die weitere Verwendung wird dieses Gel zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Der Zellulosefilter, an dem das Papain kovalent gebunden ist, wird in eine Phosphatpufferlösung (pH=6), die 5mM MMTS enthält, getaucht und danach zum Einsatz wieder herausgezogen und in Segmente geteilt. Umsetzung des immobilisierten Papain mit p-Mercuribenzoat:
Das Papain-Agarosegel, das man in der oben beschriebenen Weise erhält, wird mit einer Phospatpufferlösung (pH=6), die 0,02 μΜοΙ p-Mercuribenzoat enthält, versetzt und resuspendiert. Für die weitere Verwendung wird dieses Gel zentrifugiert und der Überstand verworfen und anschließend zur Entfernung des Reagenzüberschusses nochmals mit Phosphatpuffer (pH=6) viermal versetzt, resuspendiert, abzentrifugiert und der Überstand verworfen.
Der Zellulosefilter, an dem das Papain kovalent gebunden ist, wird in eine Phosphatpuf- ferlösung (pH=6), die 2 mM p-Mercuribenzoat enthält, getaucht und danach zum Einsatz wieder herausgezogen und in Segmente geteilt. Umsetzung des immobilisierten Papain mit N-Ethylmaleinimid Das Papain-Agarosegel, das man in der oben beschriebenen Weise erhält, wird mit einer
Phospatpufferlösung (pH=6), die 2mM N-Ethylmaleinimd enthält, versetzt und resuspendiert. Für die weitere Verwendung wird dieses Gel zentrifugiert und der Überstand verworfen und anschließend zur Entfernung des Reagenzüberschusses nochmals mit Phosphatpuffer (pH=6) viermal versetzt, resuspendiert, abzentrifugiert und der Überstand ver- worfen.
Der Zellulosefilter, an dem das Papain kovalent gebunden ist, wird in eine Phosphatpufferlösung (pH=6), die 2mM N-Ethylmaleinimd enthält, getaucht und danach zum Einsatz wieder herausgezogen und in Segmente geteilt. Entfernung des freien Inhibitors aus der Probe und Deinhibierunq von Cathepsin B Inkontaktbringen der Probe mit immobilisiertem modifiziertem Papain: Mit auf Agarosegel immobilisiertem modifizierten Papain wird folgendermaßen verfahren:
Zu 160 μΙ einer mit Phospatpuffer (pH=6) 1 :1 verdünnten Serumprobe, in der bereits das Procathepsin B in Cathepsin B umgewandelt ist, werden 50 μΙ des modifizierten Papain- Agarosegel in einem Eppendorfgefäß gegeben, das Gel wird resuspendiert und das Reaktionsgefäß nach vollständiger Deinhibierung bei 10000 U.p.M. zentrifugiert. Von dem Überstand werden 110 μΙ entnommen und in ein vorbereitetes 0,5 ml Reaktionsgefäß überführt für die enzymatische Bestimmung der Aktivität von Cathepsin B.
Alternativ wird mit an Zellulose kovalent gebundenem modifiziertem Papain wie folgt verfahren:
160 μΙ einer mit Phospatpuffer (pH=6) 1 :1 verdünnte Serumprobe, in der bereits das Procathepsin B in Cathepsin B umgewandelt ist, wird in einem Eppendorfgefäß mit einem Zellulosestück mit etwa 5,5·10"10 Mol kovalent gebundenem modifiziertem Papain bis zur vollständigen Deinhibierung durch Eintauchen in Kontakt gebracht. Danach wird das Zel- lulosestück wieder aus der Lösung entfernt. Von der deinhibierten Serumprobe werden 1 0 μΙ entnommen und in ein vorbereitetes 0,5 ml Reaktionsgefäß überführt für die enzy- matische Bestimmung der Aktivität von Cathepsin B. 4.b) Inkontaktbringen der Probe mit immobilisiertem nicht modifiziertem Papain und anschließend mit modifiziertem Papain
Mit auf Agarosegel immobilisiertem Papain wird folgendermaßen verfahren:
Zu 160 μΙ einer mit Phospatpuffer (pH=6) 1 :1 verdünnten Serumprobe, in der bereits das Procathepsin B in Cathepsin B umgewandelt ist, werden in einem Eppendorfgefäß 50 μΙ des Papain-Agarosegel gegeben, das Gel wird resuspendiert und das Reaktionsgefäß danach bei 10000 U.p.M. 30 sek zentrifugiert. Der Überstand wird entnommen und in ein vorbereitetes 0,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Dazu werden 50 μΙ des modifizierten Papain-Agarosegel gegeben, das Gel wird resuspendiert und das Reaktionsgefäß nach voll- ständiger Deinhibierung bei 10000 U.p.M. zentrifugiert. Von dem Überstand werden 110 μΙ entnommen und in ein vorbereitetes 0,5 ml Reaktionsgefäß überführt für die enzymati- sche Bestimmung der Aktivität von Cathepsin B.
Alternativ wird mit an Zellulose kovalent gebundenem nicht modifiziertem Papain wie folgt verfahren:
160 μΙ einer mit Phospatpuffer (pH 6) 1 :1 verdünnten Serumprobe, in der bereits das Procathepsin B in Cathepsin B umgewandelt ist, wird in einem Eppendorfgefäß mit einem Zellulosestück mit etwa 5,5·10"10 Mol kovalent gebundenem Papain durch Eintauchen in Kontakt gebracht und danach wird das Zellulosestück wieder aus der Lösung entfernt. In diese Probe wird nun ein weiteres Zellulosestück mit etwa 5,5·10"10 Mol kovalent gebundenem modifiziertem Papain eingetaucht und nach vollständiger Deinhibierung wieder herausgezogen. Dann werden 110 μΙ Probe entnommen und in ein vorbereitetes 0,5 ml Reaktionsgefäß überführt für die enzymatische Bestimmung der Aktivität von Cathepsin B. 5) Überführung von Procathepsin B in Cathepsin B durch immobilisiertes Papain, gleichzeitige Entfernung des Pools an freien Inhibitoren und anschließende Deinhibierung von Cathepsin B mit immobilisiertem modifiziertem Papain
Mit auf Agarosegel immobilisiertem Papain wird folgendermaßen verfahren:
Zu 160 μΙ einer mit Phospatpuffer (pH=6) 1 :1 verdünnten Serumprobe werden in einem
Eppendorfgefäß 50 μΙ des Papain-Agarosegel gegeben, das Gel wird resuspendiert und das Reaktionsgefäß danach bei 10000 U.p.M. 30 sek zentrifugiert. Der Überstand wird entnommen und in ein vorbereitetes 0,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Dazu werden nun 50 μΙ des modifizierten Papain-Agarosegel gegeben, das Gel wird resuspendiert und das Reaktionsgefäß nach vollständiger Deinhibierung bei 10000 U.p.M. zentrifugiert. Von dem Überstand werden 110 μΙ entnommen und in ein vorbereitetes 0,5 ml Reaktionsgefäß überführt für die enzymatische Bestimmung der Aktivität von Cathepsin B.
Alternativ dazu wird nach Zugabe von 50 μΙ des Papain-Agarosegel und Resuspension die Suspension mit 5mM MMTS versetzt und das Reaktionsgefäß nach vollständiger Deinhibierung bei 10000 U.p.M. zentrifugiert. Von dem Überstand werden 1 10 μΙ entnommen und in ein vorbereitetes 0,5 ml Reaktionsgefäß überführt für die enzymatische Bestimmung der Aktivität von Cathepsin B.
Mit an Zellulose kovalent gebundenem nicht modifiziertem Papain wird wie folgt verfahren:
160 μΙ einer mit Phospatpuffer (pH=6) 1 :1 verdünnten Serumprobe werden in einem Eppendorfgefäß mit einem Zellulosestück mit etwa 5,5*10"10 Mol kovalent gebundenem Papain durch Eintauchen in Kontakt gebracht. Danach wird das Zellulosestück wieder aus der Lösung entfernt. In diese Probe wird nun ein Zellulosestück mit etwa 5,5·10"10 Mol kovalent gebundenem modifiziertem Papain eingetaucht und nach vollständiger Deinhibierung wieder herausgezogen. Dann werden 110 μΙ entnommen und in ein vorbereitetes 0,5 ml Reaktionsgefäß überführt für die enzymatische Bestimmung der Aktivität von Cathepsin B.
Alternativ dazu wird nach dem ersten Eintauchen des Zellulosestücks mit kovalent gebundenem Papain die Serumprobe mit 5 mM MMTS versetzt und nach Abschluss der Deinhibierung das Zellulosestück aus der Probe entfernt. Dann werden 110 μΙ der Serumprobe entnommen und in ein vorbereitetes 0,5 ml Reaktionsgefäß überführt für die enzymatische Bestimmung der Aktivität von Cathepsin B. Messung der Aktivität des Cathepsin B in der Probe
Zu 110 μΙ der wie beschrieben behandelten Serumproben in 0,5 ml-Reaktionsgefäßen werden 1 10 μΙ Substratlösung (70 μΜ Z-Arg-Arg-AFC) gegeben, die mit Phospatpuffer auf pH=6 eingestellt ist und 5mM EDTA und 10 mM DTE enthält. Nach Mischen werden diese Proben für 120 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend werden die Reaktionsgefäße auf Eis abgekühlt, zur Rückführung von am Deckel des Reaktionsgefäßes kondensierten Wassers kurz zentrifugiert und anschließend die Fluoreszenzemission gemessen, entweder auf Mikrotiterplatte im Fluoreszenzreader oder in der Küvette im Fluorimeter. Die An- regungswellenlänge liegt in der Nähe von 400 nm, eine geeignete Detektionswellenlänge liegt bei ca. 505 nm.
Das Messsignal ist bei Zugabe des für Cysteinproteasen spezifischen artifiziellen Inhibi- tors E 64 und des für Cathepsin B spezifischen Inhibitors CA-074 zum Enzymassay gleich wie das Messsignal, das man erhält, wenn man den Enzymassay vor Inhibitorentzug durchführt. Damit ist der Nachweis erbracht, dass der im Enzymassay nach Inhibitorentzug gemessene Wert dem freigesetzten Cathepsin B zuzuordnen ist.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
Verfahren zur Bestimmung der potentiell verfügbaren Aktivität von Cathepsin B in einer biologischen Probe, einschließlich der Aktivität der aktiven Form von Cathepsin B, der aktivierbaren Form von Cathepsin B aus der in der Probe vorhandenen Proform Procathepsin B und der aktivierbaren Form von Cathepsin B, welche in der Probe durch Proteaseinhibitor hinsichtlich seiner Proteaseaktivität inhibiert vorliegt, mit den Stufen, in denen man a) in der Probe vorhandenes Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B überführt durch
a.i) Inkontaktbringen der Probe mit einem ersten Enzym (Proteolyse-Enzym), welches die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen, oder
a. ii) Absenken des pH-Wertes auf einen Wert, bei dem Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B überführt wird, b) in der Probe vorhandenen freien Proteaseinhibitor für Cathepsin B aus der Probe abreichert oder seine Inhibitorfunktion unterbindet und der inhibierten Form von Cathepsin B den Proteaseinhibitor entzieht durch Inkontaktbringen der Probe mit einem zweiten Enzym (Inhibitorbinder-Enzym), welches die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, wobei
b. i) das eingesetzte erste Enzym (Proteolyse-Enzym) und das zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) das gleiche Enzym sind mit der Maßgabe, dass das Enzym sowohl die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen als auch den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst,
oder
b.ii) das eingesetzte zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) von dem ersten Enzym (Proteolyse-Enzym), sofern eingesetzt, verschieden ist,
wobei
- das zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) ein Enzym ist, welches keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B besitzt, oder
- das zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) ein Enzym ist, welches Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B besitzt, und diese Proteaseaktivität des zweiten Enzyms für den Abbau von Cathepsin B nach einer Reaktionsdauer der Stufe b) in der Probe inaktiviert wird oder das zweite Enzym aus der Probe entfernt und durch ein Enzym ersetzt wird, welches keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B aber die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, c) Inkontaktbringen der Probe mit einem Substrat für Cathepsin B und Erfassen der proteolytischen Umsetzung des Substrates durch die Protease Cathepsin B.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das erste Enzym (Proteolyse- Enzym), welches die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen, eine Hydrolase ohne Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B ist, vorzugsweise Pepsin oder Cathepsin D oder Cathepsin C oder Thermolysin oder Pronase, besonders bevorzugt Pepsin oder Cathepsin D, und das eingesetzte zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) von dem ersten Enzym (Proteolyse- Enzym) verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) Papain ist, welches die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, wobei die Proteaseaktivität des Papains für den Abbau von Cathepsin B nach einer Reaktionsdauer in der Probe inaktiviert wird oder das Papain aus der Probe entfernt und durch ein Enzym ersetzt wird, welches keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B aber die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte erste Enzym (Proteolyse-Enzym) und das zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) das gleiche Enzym Papain ist, welches sowohl die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen als auch den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, wobei die Proteaseaktivität des Papains für den Abbau von Cathepsin B nach einer Reaktionsdauer in der Probe inaktiviert wird oder das Papain aus der Probe entfernt und durch ein Enzym ersetzt wird, welches keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B besitzt, aber die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass man nach einer Reaktionsdauer das Papain in der Probe in ein modifiziertes Papain mit inaktivierter Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B überführt, wobei das modifizierte Papain mit inaktiver Proteaseaktivität herstellbar ist durch
chemische Modifizierung der SH-Gruppe des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain, vorzugsweise durch Umsetzung des Papain mit Methylmethanthiosulfonat (MMTS), p-Mercuribenzoat oder AgN03 oder durch Addition von N-substituiertem Malei- nimid.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass man nach einer Reaktionsdauer das Papain in der Probe aus der Probe entfernt und durch ein modifiziertes Papain ersetzt, welches keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B aber die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, wobei das modifizierte Papain mit inaktiver Proteaseaktivität herstellbar ist durch
a) chemische Modifizierung der SH-Gruppe des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain, vorzugsweise durch Umsetzung des Papain mit Methylmethanthiosulfonat (MMTS), p-Mercuribenzoat oder AgN03 oder durch Addition von N-substituiertem Malei- nimid, oder
b) ortsspezifische Punktmutation des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain durch eine andere Aminosäure.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte zweite Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) modifiziertes Papain ist, welches die Funktionalität besitzt, den Proteaseinhibitor für Cathepsin B zu binden und eine höhere Affinität zu dem Proteaseinhibitor besitzt als Cathepsin B selbst, welches aber nicht die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen, und keine Proteaseaktivität für den Abbau von Cathepsin B besitzt, wobei das modifizierte Papain mit inaktiver Proteaseaktivität herstellbar ist durch
a) chemische Modifizierung der SH-Gruppe des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain, vorzugsweise durch Umsetzung des Papain mit Methylmethanthiosulfonat (MMTS), p-Mercuribenzoat oder AgN03 oder durch Addition von N-substituiertem Malei- nimid, oder
b) ortsspezifische Punktmutation des Cystein im proteolytisch aktiven Zentrum des Papain durch eine andere Aminosäure.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 , 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die In- aktivierung der Proteaseaktivität des zweiten Enzyms (Inhibitorbinder-Enzym) für Ca- thepsin B nach einer Reaktionsdauer der Stufe b) von 5 min, vorzugsweise nach einer Reaktionsdauer der Stufe b) von 3 min, besonders bevorzugt nach einer Reaktionsdauer der Stufe b) von 1 min durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe Vollblut, Blutplasma, Blutserum oder ein Gewebehomogenat ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat für Cathepsin B eine Di- oder Oligopeptidsequenz und ein bei der proteolytischen Umsetzung des Substrates durch die Protease Cathepsin B von der Oligopeptidsequenz abspaltbares Fluorophor umfasst, wobei das Fluorophor vorzugsweise 7-Amino- 4-trifluormethylcumarin (AFC) oder 7-Amino-4-methylcumarin (AMC) ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Enzym (Proteolyse-Enzym), vorzugsweise Papain, kovalent oder adsorptiv an ein Trägermaterial, vorzugsweise an Agarose-Gel oder Zellulose, besonders bevorzugt kovalent an Zellulose, ganz besonders bevorzugt chemisch oder photochemisch kovalent an Zellulose gebunden ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufe a) des Inkontaktbringens der Probe mit einem ersten Enzym (Proteolyse- Enzym), welches die Funktionalität besitzt, Procathepsin B durch proteolytischen Verdau in die aktive Form Cathepsin B zu überführen, bei einer Temperatur im Bereich von 4 bis 40 °C, vorzugsweise 20 bis 40 °C und bei einem pH-Wert im Bereich von 1 bis 6, vorzugsweise 2 bis 5, besonders bevorzugt bei 4,5 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufe b) des Inkontaktbringens der Probe mit einem zweiten Enzym (Inhibitorbinder-Enzym) bei einer Temperatur im Bereich von 4 bis 40 °C, vorzugsweise 20 bis 40 °C und bei einem pH-Wert im Bereich von 2 bis 7, bevorzugt zwischen 4,5 und 6 durchgeführt wird.
Verfahren zur Bestimmung der in der Probe vorhandenen Proform von Cathepsin B Procathepsin B, dadurch gekennzeichnet, dass man
i) mit einem ersten Teil einer biologischen Probe eine erste Bestimmung der potentiell verfügbaren Aktivität von Cathepsin B gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche durchführt,
ii) mit einem zweiten Teil der gleichen biologischen Probe eine zweite Bestimmung der potentiell verfügbaren Aktivität von Cathepsin B gemäß einem der vorangegangenen An- Sprüche durchführt, wobei man jedoch für die zweite Bestimmung die Verfahrensstufe a) nicht durchführt, bei der man in der Probe vorhandenes Procathepsin B in die aktive Form Cathepsin B überführt,
iii) die aus Procathepsin B in der Probe potentiell verfügbare Aktivität von Cathepsin B als Differenzwert zwischen der ersten Bestimmung i) und der zweiten Bestimmung ii) ermittelt.
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