DE69722923T2

DE69722923T2 - Verfahren zur messung von bilirubin

Info

Publication number: DE69722923T2
Application number: DE69722923T
Authority: DE
Inventors: Z. Cecilia SCHULTZ; S. Fredrick YEIN
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2017-04-05
Also published as: EP0891554B1; AU2440897A; US5863746A; WO1997038317A1; DE69722923D1; ATE243321T1; EP0891554A1; US5783407A

Description

Hintergrund
Diagnostische Tests spielen eine wesentliche Rolle im Nachweis und bei der Diagnose von Erkrankungen. Die Entwicklung diagnostischer Testtechnologie hat die präzise Messung von winzigen Mengen eines Analyten in Serum-, Plasma-, Speichel-, zerebraler Spinalflüssigkeit-, Fruchtwasser- und Urinproben möglich gemacht. Anwendungen solcher Tests schließen das Messen von Arzneimittelkonzentrationen, welche Patienten zur Behandlung von Erkrankungen verabreicht wurden, und das Nachweisen von Blutbestandteilen, welche aus Erkrankungen, einschließlich Krebs, resultieren, ein. Deshalb haben ihre Anwendungen in den Bereichen von Biologie und Medizin sie als diagnostische Werkzeuge immer wichtiger und vielseitiger gemacht.
Jedoch gibt es Komplikationen bei den Testanwendungen. Die Empfindlichkeit und Genauigkeit dieser Tests sind durch die Instabilität des interessierenden Analyten aufgrund der Testbedingungen häufig beschränkt. Solche Beschränkungen können sowohl Nachweis und Messung des interessierenden Analyten unzuverlässig machen als auch die Empfindlichkeit des Tests erniedrigen.
Die Auswirkungen dieser Beschränkungen können verheerend sein, da ihre Gegenwart im Test unpräzise Ergebnisse verursachen könnten, welche zu einer Fehldiagnose und möglicherweise zu ungeeigneter Behandlung führen.
Bei gewissen Lebererkrankungen wie Hepatitis, Leberzirrhose oder Verschlußikterus wird angenommen, daß dikonjugierte Bilirubinspezies in frühen Stadien der Erkrankung ansteigen.
Bilirubin ist ein typisches Stoffwechselprodukt von Hämoglobin, welches ein Sauerstoffträger im Blut ist. Die Bestimmung der Bilirubinmenge in einer Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, ist wichtig für den Hämolysenachweis und zur Überprüfung der Leberfunktion. Ein Symptom für überschüssiges Bilirubin im Blut ist Gelbsucht. Die Bestimmung des Bilirubingehalts im Blut ist ein wichtiger Punkt in klinischen chemischen Tests geworden.
Bilirubin ist ein gelber Farbstoff, welcher selbst ein Absorptionsmaximum bei 435 nm oder 465 nm und einen molekularen Absorptionskoeffizienten von etwa 5 × 10⁴ C₃₃H₃₆O₆N₄ aufweist.
Bilirubin kann durch Untersuchen der Dichte von grüner Farbe, welche gebildet wird wenn Bilirubin durch ein Oxidationsmittel in Biliverdin oxidiert wird, und durch genaue Kenntnis, wie diese Dichte zum Bilirubingehalt proportional ist, nachgewiesen werden. Dieses Verfahren ist mit qualitativen Tests verbunden. Die Nachteile bei diesem Verfahren sind, daß es schwierig sein kann, die Menge von Bilirubin in einer Probe zu quantifizieren. Ein Reagens und ein Verfahren zur Bestimmung von Bilirubin ist in WO 86/00933 beschrieben und umfaßt Bilirubinoxidase aus Myrothecium Spezies, einen Puffer und ein grenzflächenaktives Mittel. Ein Füllstoff, welcher Mannitol, Sorbit oder Polyethylenglykol 400 oder jeder andere Füllstoff sein kann, wird in einer die Bilirubinoxidase enthaltenden Zusammensetzung verwendet, um die Gebrauchsfreundlichkeit des Enzyms zu fördern.
Zahlreiche kolorimetrische Verfahren zur Bestimmung der Bilirubinkonzentration sind vorgeschlagen worden. In einem Verfahren wird Bilirubin mit einem Diazoniumsalz, wie Diazosulfanilsäure, gekuppelt, und die Menge des erhaltenen Farbstoffs wird in einem Spektralphotometer gemessen, um den Bilirubingehalt zu berechnen. Da jedoch der Bilirubingehalt im Blutserum eines gesunden Patienten sehr klein ist, kann es schwierig sein, die genaue Bestimmung der Bilirubinkonzentration unter Verwendung dieses Verfahrens zu erreichen. Bilirubin wird aus einer wäßrigen Lösung mit einem hydrophoben, organischen Lösungsmittel extrahiert. Ein Nachteil bei diesem Verfahren ist, daß es Zeit dauern kann das Bilirubin aus der wäßrigen Lösung zu extrahieren, und es große Probenmengen erfordern kann, welche schwierig zu kon zentrieren sein kann, was zu einer niedrigen Extraktionsgewinnung führen kann. Ein weiterer mit diesem Verfahren verbundener Nachteil ist, daß dieses Verfahren für die Messung der konjugierten Spezies von Bilirubin nicht spezifisch sein kann.
Aus den vorstehenden Gründen gibt es einen Bedarf für einen empfindlichen, spezifischen Test, der genau die Gegenwart eines Analyten, der eine Autoxidation eingeht, in einer Probe bestimmen kann. Des weiteren wäre es vorteilhaft, einen Test zu haben, der befähigt wäre, die vorstehenden Kriterien zu erfüllen und noch die Standardisierung des Tests durch Vermeiden von Autoxidation beibehalten kann.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test, der diese Bedürfnisse erfüllt. Der Test wird verwendet, um einen Analyten, der eine Autoxidation eingeht, in einer Probe nachzuweisen. Der Test umfaßt die Schritte des Bildens eines Reaktionsgemischs durch das Kombinieren (i) einer den Analyten enthaltenden Probe und (ii) eines Stabilisators, der die Geschwindigkeit der radikalisch vermittelten Autoxidation des Analyten reduziert, in einem wäßrigen Medium. Das Reaktionsgemisch wird dann für eine Zeitdauer inkubiert, und die Geschwindigkeit der Autoxidation kann nachgewiesen werden.
Wenn die ermittelte Geschwindigkeit der Autoxidation im wesentlichen Null ist, kann eine ausreichende Menge eines Enzyms, welches die Oxidation des Analyten katalysiert, zum Reaktionsgemisch zugegeben werden. In der Gegenwart des Stabilisators kann der Analyt zu einer Produktspezies oxidiert werden. Die Produktspezies, der Analyt oder beide können nachgewiesen werden.
Dieser Test kann in Testproben wie Serum, Plasma, Speichel, pleuraler oder zerebraler Spinalflüssigkeit, Fruchtwasser, Urin, Fäkalien, Schleim, Zellextrakten, Gewebeextrakten und Eiter ausgeführt werden.
Der Stabilisator kann ein Radikalfänger wie Mannitol, Inositol, Tocopherol, Superoxiddismutase, Katalase, Glutathion, Glutathionperoxidase, 2-Mercaptoethanol, N-2- Mercaptopropenylglycin, Dimethylharnstoff, Dimethylthio-harnstoft, butyliertes Hydroxytoluol, butyliertes Hydroxyanisol, die 21-Aminosteroide, Deferoxamin, Allopurinol, Dimethylsulfoxid und Coenzym Q sein.
Die Konzentration des Fängers liegt im Bereich von etwa 5 mM bis etwa 150 mM. Vorzugsweise ist die Konzentration des Fängers von etwa 30 mM bis etwa 100 mM.
Vorzugsweise ist der Radikalfänger Mannitol. Wenn der Radikalfänger Mannitol ist, ist die Konzentration von Mannitol vorzugsweise 50 mM.
Das wäßrige Medium umfaßt eine gepufferte, wäßrige Lösung mit einem pH, welcher im wesentlichen ein Medium zum Erhalten einer ausreichend hohen Reaktionsgeschwindigkeit für das Enzym bereitstellen kann, wobei das Enzym im wesentlichen hohe Spezifität gegenüber dem interessierenden Analyten aufweist. Vorzugsweise ist die gepufferte, wäßrige Lösung befähigt, den pH bei einem alkalischen pH zu halten. Besonders bevorzugt ist die gepufferte, wäßrige Lösung Glycinpuffer.
Das Reaktionsgemisch kann weiter Chelatoren zur Entfernung unerwünschter Metallionen aus dem Medium umfassen. Die Chelatoren können aus der Gruppe, bestehend aus Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylenglykolbis(beta-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetat und 2,2-Bis(hydroxyethyl)-2,2',2''-nitrolotriethanol, ausgewählt sein.
Der Analyt kann aus der Gruppe, bestehend aus Bilirubin, Glucose, Cholesterol, neutralen Fetten, freien Fettsäuren, Phospholipiden und Harnsäuren, ausgewählt sein. Vorzugsweise ist der Analyt Bilirubin.
Das Enzym kann aus der Gruppe, bestehend aus Bilirubinoxidase, Glucoseoxidase, Cholesteroloxidase, Uricase, Acylcoenzym-A-Oxidase, Cholinoxidase und Glycerol-3-phosphatoxidase, ausgewählt sein. Vorzugsweise ist der Analyt Bilirubin und die Produktspezies Biliverdin.
Der Test kann verwendet werden, um in einer Testprobe einen Analyten, wie Biliru bin, der eine Autoxidation eingeht, nachzuweisen. Der Test umfaßt die Schritte des Bildens eines Reaktionsgemischs durch das Kombinieren (i) einer Bilirubinenthaltenden Probe und (ii) Mannitol als einen Stabilisator, der die Geschwindigkeit der radikalisch vermittelten Autoxidation von Bilirubin reduziert, in einem wäßrigen Medium. Das Reaktionsgemisch wird dann für eine Zeitdauer inkubiert, und die Geschwindigkeit der Autoxidation kann ermittelt werden.
Wenn die ermittelte Geschwindigkeit der Autoxidation im wesentlichen Null ist, kann eine ausreichende Menge Bilirubinoxidase zugegeben werden, welche die Oxidation des Bilirubins katalysiert, so daß in der Gegenwart von Mannitol Bilirubin zu Biliverdin als das Produkt oxidiert werden kann. Biliverdin, Bilirubin oder beide können nachgewiesen werden.
Beschreibung der Zeichnungen
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden im Hinblick auf die folgende Beschreibung und beigefügten Ansprüche und begleitenden Zeichnungen besser verstanden werden, wobei:
1 ein Schaubild ist, welches eine typische Reaktionskurve zum Testen von Bilirubin unter Verwendung des Bilirubinoxidase-Verfahrens auf einem Synchron-CX5-Analysator zeigt.
Beschreibung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Test zum Nachweis eines interessierenden Analyten, der eine Autoxidation eingeht, in einer Testprobe bereitgestellt. Ein solcher Test umfaßt die Schritte des Bildens eines Reaktionsgemisches, des Inkubierens des Reaktionsgemisches, des Zugebens einer ausreichenden Menge von Enzym zum Reaktionsgemisch und des Bestimmens der Produktspezies, der Gegenwart des Analyten oder von beiden in der Testprobe.
1. Bilden des Reaktionsgemisches
Das Reaktionsgemisch wird durch das Kombinieren (i) einer den Analyten enthaltenden Probe und (ii) eines Stabilisators, der die Geschwindigkeit der radikalisch vermittelten Autoxidation des Analyten reduziert, in einem wäßrigen Medium gebildet.
A. Das wäßrige Medium
Das wäßrige Medium kann jede geeignete Flüssigkeit, wie Wasser, sein, die befähigt ist, als ein Lösungsmittel für sämtliche Komponenten des Reaktionsgemischs bei ihren gewünschten Konzentrationen zu wirken. Normalerweise umfaßt das wäßrige Medium eine gepufferte, wäßrige Lösung mit einem pH, der im wesentlichen ein Medium bereitstellen kann, um eine ausreichend hohe maximale Reaktionsgeschwindigkeit für das Enzym bereitzustellen, wobei das Enzym im wesentlichen hohe Spezifität gegenüber dem interessierenden Analyten aufweist. Wenn Bilirubinoxidase das verwendete Enzym ist, um die Oxidation von konjugiertem Bilirubin zu messen, liegt die gepufferte, wäßrige Lösung vorzugsweise zwischen etwa pH 8 und etwa pH 10.
Besonders kann durch das Messen von Bilirubin bei niedrigen pHs im Diazoverfahren Hämoglobin schnell in Eisen(III)-häm umgewandelt werden, was in einer hohen Ausbeute von H₂O₂ resultieren kann, welches mit dem Test interferieren kann. Zusätzlich messen enzymatische Verfahren bei saurem pH alle direkt reagierende Bilirubine, während bei pH 10 nur konjugierte Bilirubine gemessen werden. Die Messung von konjugierten Bilirubinen kann in der Differentialdiagnose von Gelbsucht nützlicher sein als die Messung von direktem Bilirubin. Normalerweise kann der Puffer ein Puffer wie TRIS sein. Besonders bevorzugt ist die gepufferte, wäßrige Lösung Glycinpuffer, da Glycinpuffer eine stabile, starke Pufferkapazität bei einer Reaktion mit pH 10 bereitstellen kann, was ein Medium zur Erhaltung einer ausreichend hohen maximalen Reaktionsgeschwindigkeit für Bilirubinoxidase (BOX) bereitstellen kann, wobei Bilirubinoxidase im wesentlichen hohe Spezifität gegenüber Bilirubin aufweist. In alkalischem Puffer mit einem pH um 10 kann Bilirubinoxidase das konjugierte Bilirubin (Bc, Mono- und Diglucuronide) spezifisch zu Biliverdin oxidieren. Die se Oxidationsreaktion kann bei einer Wellenlänge von 460 nm aufgezeichnet werden. Normalerweise ist der resultierende Abfall in der Extinktion linear mit der Konzentration von Bc in der Testprobe verbunden.
Vorzugsweise umfaßt das Reaktionsgemisch einen Glycinpuffer, welcher eine niedrige Extinktion bei den typischen Meßwellenlängen von etwa 300 nm bis etwa 700 nm, welche normalerweise in Tests zur Messung der katalytischen Aktivität verwendet werden, aufweist.
Zusätzlich kann das Testmedium Reagenzien einschließen, die nicht mit dem Oxidationsprozeß des Analyten interferieren, wie grenzflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 und Tween-20.
1. Die Testprobe
Die Testprobe enthält vorzugsweise einen interessierenden Analyten, der eine Autoxidation eingeht. Die Testprobe kann jede biologische Flüssigkeit, einschließlich Serum, Plasma, Speichel, pleuraler oder zerebraler Spinalflüssigkeit, Fruchtwasser, Urin, Fäkalien, Schleim, Zeltextrakten, Gewebeextrakten und Eiter, sein.
Der interessierende Analyt ist eine Substanz, von der angenommen wird, in der Testprobe vorzuliegen und deren Vorhandensein oder Konzentration zu bestimmen ist. Der interessierende Analyt ist am meisten bevorzugt ein Material, das eine Autoxidation eingeht und ist normalerweise Bilirubin, Glucose, Cholesterol, neutrale Fette, freie Fettsäuren, Phospholipide und Harnsäuren. Besonders bevorzugt ist der Analyt Bilirubin und dieses Bilirubin liegt in seinem konjugierten Zustand vor. Bilirubin liegt von Natur aus in biologischen Flüssigkeiten nicht im freien Zustand vor, sondern liegt in der Form von entweder konjugiertem Bilirubin (Bilirubin kombiniert mit Glucuronsäure, Schwefelsäure, Salzsäure oder ähnlichem) oder nicht-konjugiertem Bilirubin (Bilirubin kombiniert mit Albumin) vor. Es wird angenommen, daß konjugiertes Bilirubin in Fällen von Leberzellläsion, Leber-Gelbsucht und posthepatischer Gelbsucht ansteigt, wohingegen nicht-konjugiertes Bilirubin in den Fällen von Leberfunktionsstörungen ansteigt. Das Messen des konjugierten Zustands von Bilirubin kann ein empfindlicher, spezifischer Indikator für eine Lebererkrankung sein, im Vergleich zum Messen von direktem Bilirubin.
2. Stabilisator
Der im wäßrigen Medium vorhandene Stabilisator kann jede Substanz sein, die befähigt ist, die Geschwindigkeit der radikalisch vermittelten Autoxidation des Analyten zu reduzieren. Weiter kann der Stabilisator befähigt sein, die Geschwindigkeit der radikal vermittelten Autoxidation jeder anderen Substanz, die im wäßrigen Medium vorhanden ist und mit dem Test interferieren könnte, zu reduzieren. Eine Vielzahl von Radikalfängern wie z. B. Mannitol, Inositol, Tocopherol, Superoxiddismutase, Katalase, Glutathion, Glutathionperoxidase, 2-Mercaptoethanol, N-2-Mercaptopropenylglycin, Dimethylharnstoff, Dimethylthioharnstoff, butyliertes Hydroxytoluol, butyliertes Hydroxyanisol, die 21-Aminosteroide, Deferoxamin, Allopurinol, Dimethylsulfoxid und Coenzym Q können als der Stabilisator verwendet werden. Vorzugsweise ist der Radikalfänger Mannitol.
Der Radikalfänger-Stabilisator kann im wäßrigen Medium in einer Konzentration von etwa 5 mM (Millimol pro Liter) bis etwa 150 mM verwendet werden. Weniger als etwa 5 mM des Radikalfängers im wäßrigen Medium können nicht genügend Radikalfänger bereitstellen, um eine signifikante Menge des Analyten, der eine Autoxidation eingeht, zu stabilisieren. Mehr als etwa 150 mM des Radikalfängers im wäßrigen Medium können schwierig zu lösen sein. Vorzugsweise wird der Stabilisator in einer Konzentration von etwa 30 mM bis etwa 100 mM verwendet, was ein wirksamer Stabilisatorkonzentrationsbereich sein kann. Wenn Mannitol als der Stabilisator verwendet wird, ist die Konzentration von Mannitol besonders bevorzugt 50 mM.
Normalerweise wird der Test verwendet, um den interessierenden Analyten durch ein spektralphotometrisches Lichtabsorptionsverfahren zu messen. Wenn ein spektralphotometrisches Testverfahren verwendet wird, ist es wichtig, daß der Fänger gegenüber Licht bei der Wellenlängenmessung im wesentlichen transparent ist, um nicht mit den Lichtabsorptionsmessungen, welche verwendet werden, um die katalytische Aktivität des Tests zu bestimmen, zu interferieren.
3. Chelatoren
Das Bilden des Reaktionsgemischs kann weiter die Zugabe von Chelatoren zur Entfernung von unerwünschten Metallionen aus dem Reaktionsgemisch einschließen, wie Fe⁺², welches, wenn es vorhanden ist, die katalytische Aktivität des Enzyms beeinflussen kann. Die Autoxidation des interessierenden Analyten kann durch die Anwesenheit von Übergangsmetallionen wie Fe⁺² und Cu⁺² erhöht sein. Die Autoxidation kann durch eine Sauerstoffradikal-Propagation vermittelt werden. Metallionchelatoren können die Autoxidation des Analyten und den Extinktionsdrift („absorbance drift") der Blindprobe („sample blanking") verringern.
Die Menge von zu einem Test zugegebenen Chelatoren hängt vom fraglichen Test ab. Diese Menge kann für jeden Test durch Bestimmung, welche Metallionen im Test vorhanden sind, bestimmt werden. Normalerweise ist die zum Reaktionsgemisch zugegebene Chelatormenge eine Menge, die im wesentlichen unerwünschte Metallionen aus dem Reaktionsgemisch entfernen kann und nicht mit dem Test interferiert.
Vorzugsweise können Chelatoren wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ethylenglykolbis(beta-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetat (EGTA) und 2,2-Bis(hydroxyethyl)-2,2',2''-nitrolotriethanol (BHN) verwendet werden, um mehrwertige Kationen wie Fe+² aus dem Reaktionsgemisch zu entfernen.
Wenn das Reaktionsgemisch keine Eisenionen enthält, ist der Bedarf für einen Chelator im Reaktionsgemisch wesentlich reduziert. Eine Einschränkung bezüglich der Menge der verwendeten Chelatoren besteht darin zu vermeiden, daß eine solche Menge an Chelator vorhanden ist, daß die Chelatbildung von überschüssigen Mengen von verwendbaren bzw. anwendbaren, im Reaktionsgemisch vorhandenen Metallionen auftreten kann.
Wenn der interessierende Analyt Bilirubin ist, kann ein Chelator wie EDTA, EGTA oder BHN zum Reaktionsgemisch zugegeben werden. Der Chelator wird vorzugs weise in einer Konzentration von etwa 0,025 mMol/l bis etwa 4 mMol/l verwendet. Weniger als etwa 0,025 mMol/l Chelator im Reaktionsgemisch stellen nicht genug Chelator bereit, um eine wesentliche Menge von unerwünschten Metallionen, welche im Reaktionsgemisch vorhanden sein können, zu entfernen. Mehr als etwa 4 mMol/l Chelator können in der Chelatbildung von überschüssigen Mengen von anwendbaren Metallionen resultieren. Besonders bevorzugt ist der Chelator im Reaktionsgemisch in einer Konzentration von etwa 0,5 mMol/l bis etwa 2 mMol/l vorhanden.
II. Inkubieren des Reaktionsgemischs und Ermitteln der Geschwindigkeit der Autoxidation
Im Inkubationsschritt inkubiert das Reaktionsgemisch für eine Zeitdauer, und die Geschwindigkeit der Autoxidation des Analyten wird ermittelt. Normalerweise wird dies spektralphotometrisch gemacht.
III. Zugabe zum Reaktionsgemisch
Wenn die Geschwindigkeit der Autoxidation des Analyten im wesentlichen Null ist, wird eine ausreichende Menge eines Enzyms, welches die Oxidation des Analyten katalysiert, zugegeben. In der Gegenwart des Stabilisators wird der Analyt zu einer Produktspezies oxidiert.
1. Enzym
Häufig können herkömmliche Verfahren zur quantitative Bestimmung von interessierenden Analyten in biologischen Flüssigkeiten oxidierende Enzyme verwenden.
Normalerweise kann das Enzym jedes Enzym sein, das befähigt ist, einen interessierenden Analyten zu oxidieren. Vorzugsweise ist das Enzym aus der Gruppe, bestehend aus Bilirubinoxidase, Glucoseoxidase, Cholesteroloxidase, Uricase, Acylcoenzym-A-Oxidase, Cholinoxidase und Glycerol-3-phosphatoxidase, ausgewählt.
Besonders bevorzugt ist das Enzym Bilirubinoxidase (BOX) und ist aus der Gruppe, bestehend aus Myrothecium sp. Bilirubinoxidase und Coprinus sp. Bilirubinoxidase, ausgewählt. Die Bilirubinoxidase kann verwendet werden, um Bilirubin durch das Oxidieren von Bilirubin zu Biliverdin zu messen. Das Enzym kann durch eine Nicht-Bildung von Wasserstoffperoxid im Verlauf der Oxidation charakterisiert werden. Die enzymologischen Eigenschaften der Bilirubinoxidase schließen ein: BOX ist zwischen pH 9,2 bis 9,7 für 5 Tage bei 4°C stabil und weist einen pH-Bereich von 6–10 auf. BOX kann durch Fe+² und KCN (Kaliumthiocyanat) inhibiert werden und teilweise durch Natriumazid, Thioharnstoff oder Natriumchlorid inhibiert werden.
BOX kann die Oxidation von Bilirubin in Biliverdin durch molekularen Sauerstoff ohne die Bildung von Wasserstoffperoxid katalysieren. Bilirubin + ½ O₂ → Bliverdin + H₂O
Die Oxidationsgeschwindigkeiten für verschiedene Bilirubinfraktionen können vom pH des Reaktionsgemischs und von der Gegenwart von grenzflächenaktiven Mitteln abhängen. Konjugierte Bilirubine können schnell über einen großen Bereich von pHs oxidiert werden, wobei Maxima nahe den pH-Werten 4,5 und 10,0 gezeigt werden. Bei niedrigem pH (3,7 bis 4,5) kann BOX Bilirubinkonjugate und am meisten Delta-Bilirubin zu Biliverdin oxidieren. Unkonjugiertes Bilirubin wird nicht oxidiert. Bei pH 10 kann BOX Bilirubinkonjugate zu Biliverdin oxidieren, aber nicht das unkonjugierte- oder Delta-Bilirubin. Bei jedem pH kann die Reaktion in der Abwesenheit von grenzflächenaktiven Mitteln fortgeführt werden, und der Abfall in der Extinktion nahe 460 nm kann zu der Konzentration von direktem Bilirubin proportional sein.
Die Enzymmenge, welche für die Bestimmung von Bilirubin verwendet wird, ist vorzugsweise derart, daß die Konzentration von Bilirubin im Reaktionsgemisch gleich 0,003 bis etwa 0,40 U/ml Bilirubinoxidase ist. Die Einheit der Bilirubinoxidaseaktivität ist wie folgt definiert: fünf mg Bilirubinkristalle werden in 250 ml einer 0,2 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,4), welche 1 mM EDTA enthält, gelöst. Ein 2-ml Anteil der resultierenden Lösung wird mit 0,2 ml Enzymlösung gemischt. Das Gemisch wird bei 37°C inkubiert, und dann sein Extinktionsabfall bei 440 nm gemessen. Dann wird die Enzymmenge, welche 1 Mikromol Bilirubin pro Minute oxidiert, als ein Unit definiert.
IV. Nachweisen der Produktspezies, des Analyten oder von beiden
Im Nachweisschritt können die Produktspezies, der Analyt oder beide gemessen werden. Normalerweise wird der Test unter Verwendung eines Spektralphotometers ausgeführt, um die Änderung in der Lichtabsorption zu messen. Normalerweise wird eine Wellenlänge von weniger als etwa 600 bis 700 nm (Nanometer), wie 460 Nanometer, verwendet, um spektralphotometrisch das Licht zu messen. Vorzugsweise wird die Oxidationsreaktion bei einer Wellenlänge von 460 nm gemessen, und zwar aufgrund der spezifischen Oxidation von konjugiertem Bilirubin durch Bilirubinoxidase, was in einem Abfall der Absorption resultiert.
V. Testkit
Formulierungen zur Verwendung in Tests, um den interessierenden Analyten nachzuweisen, können als Testkits zusammengefügt sein. Diese Testkits können ein übliches Sortiment von stabilen Testkomponenten bereitstellen. Jedoch wird die Enzym-enthaltende Komponente für die Zugabe zu den anderen Komponenten erst bereitgestellt, wenn die Geschwindigkeit der Autoxidation im wesentlichen Null ist.
Im Interesse der Klarheit ist das folgende Beispiel beabsichtigt, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, aber keinesfalls zu beschränken.
Beispiel (voraussichtlich)
Die Tests können unter Verwendung eines SYNCHRON klinischen Chemie-Analyseautomat (CX4, CX5, CX4CE, CX5CE, CX7 und LX), Beckman Instruments, Inc. (Fullerton, California) durchgeführt werden.
Die optischen Extinktions-Meßwerte des Reaktionsgemischs können bei 465 nm unter Verwendung eines DU^®-7600 Spektralphotometers (Beckman Instruments) gemessen werden.
Die Bilirubinquantifizierung kann durch das Bilirubinoxidaseverfahren (BOX) durchgeführt werden.

Der Glycinpuffer kann hergestellt werden, um das Folgende zu enthalten:

Komponente A:	Reaktionspuffer
	0,1 Glycin (Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), P/N G-7126)
	0,05 M Mannitol (Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), P/N M-9647)
	0,005 M EDTA (Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), P/N E-9884)
Komponente C: (Startreagenz)	Bilirubinoxidase (BOX)
	75 U/ml BOX (Beckman Dri-Stat, P/N 683802)
	0,01 M Glycin (Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), P/N G-7126)
	0,05 Mannitol (Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), P/N M-9647)

Konzentrationsbereich von Mannitol: 5–100 mM. Allgemeine Testverfahren (SYNCHRON CX4/5/7 Analyseautomat):(siehe Figur 1)

–320 Sekunden	Reaktionspuffer (A) Injektion 220 μl
0 Sekunden	Probeninjektion, 7 μl
16 Sekunden	BOX Startreagenz (C), 14 μl (äquivalent zu 1 U pro Test)
Leerfenster bzw. Leerwert	250–300 Sekunden
Reaktionsfenster	336–366 Sekunden

Der Zeitpunkt der Probenzugabe wird als „null Sekunden" der gesamten Testzeitskala gesetzt. Die Zeit vor der Probenzugabe wird als –320 Sekunden gemäß 1 gekennzeichnet.

1. In einer Küvette, Puffer zugeben und bei 37°C für –320 Sekunden inkubieren, um die Temperatur der Lösung zu äquilibrieren.
2. Probe zugeben und für eine Zeitdauer (30–90 Sekunden) inkubieren und den Proben-Nullwert bzw. Leerwert der Extinktionsänderung während dieser Zeitdauer berechnen.
3. Bilirubinoxidase-Enzymlösung (BOX) zugeben, um die enzymatische Reaktion für Sekunden auszuführen.
4. Probenreaktionswert durch die Extinktionsänderung während dieser Zeitdauer berechnen.
5. Nettoreaktionsgeschwindigkeit = Probenreaktion – Probennullwert
6. Algorithmus: Da die Bilirubinkonzentration in der Probe proportional zu ihrer Nettoreaktionsgeschwindigkeit ist, kann eine lineare Eichkurve mit zwei Eichwerten von bekannten Bilirubinkonzentrationen konstruiert werden, und die Bilirubinkonzentration in der Probe kann aus der Gleichung (Y = ax + b) der Eichkurve berechnet werden.

Die folgenden Ergebnisse zeigen die Verhinderung der Bilirubin-Autoxidation durch 50 mM Mannitol im Glycinpuffer (0,1 M, pH 10,5).
Die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung haben viele Vorteile. Die Vorteile schließen das Zurverfügungstellen eines Test ein, welcher einen zu interessierenden Analyten, der eine Autoxidation eingeht, in einer Testprobe nachweisen kann. Insbesondere kann dieser Test bezüglich der Messung der BOX katalysierten Bilirubinoxidation einen genauen und exakten chemischen Reaktionstest mit einer kurzen Reaktionszeit (ungefähr fünf Minuten) bereitstellen, und des weiteren erlaubt dieser Test auf Analyseautomaten mit wahlfreiem Zugriff anwendbarer zu sein, ohne den Instrumentendurchlauf zu beeinflussen.
Obwohl die vorliegende Erfindung in wichtigen Details bezüglich bestimmter bevorzugter Ausführungsformen beschrieben worden ist, sind andere Ausführungsformen möglich. Deshalb sollte der Geist und der Umfang der beigefügten Ansprüche nicht auf die in der Beschreibung enthaltenen bevorzugten Ausführungsformen beschränkt werden.

Claims

Test zum Nachweis eines interessierenden Analyten, der eine Autoxidation eingeht, in einer Testprobe, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt a) das Bilden eines Reaktionsgemisches durch das Kombinieren (i) einer den Analyten enthaltenden Probe und (ii) eines Stabilisators, der die Geschwindigkeit der radikalisch vermittelten Autoxidation des Analyten reduziert, in einem wäßrigen Medium, b) das Inkubieren des Reaktionsgemisches und das Ermitteln der Geschwindigkeit der Autoxidation, c) wenn die ermittelte Geschwindigkeit der Autoxidation im wesentlichen Null ist, das Zugeben einer ausreichenden Menge eines Enzyms, welches die Oxidation des Analyten katalysiert, zu dem Gemisch, so daß in der Gegenwart des Stabilisators der Analyt zu einer Produktspezies oxidiert wird, und d) das Bestimmen des Analyten.
Test nach Anspruch 1, wobei die Testprobe aus der Gruppe, bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, pleuraler oder zerebraler Spinalflüssigkeit, Fruchtwasser, Urin, Fäkalien, Schleim, Zeltextrakten, Gewebeextrakten und Eiter, ausgewählt ist.
Test nach Anspruch 1, wobei der Stabilisator ein Radikalfänger ist.
Test nach Anspruch 3, wobei der Radikalfänger aus der Gruppe, bestehend aus Mannitol, Inositol, Tocopherol, Superoxiddismutase, Katalase, Glutathion, Glutathionperoxidase, 2-Mercaptoethanol, N-2-Mercaptopropenylglycin, Dimethylharnstoff, Dimethylthioharnstoff, butyliertem Hydroxytoluol, butyliertem Hydroxyanisol, den 21-Aminosteroiden, Deferoxamin, Allopurinol, Dimethylsulfoxid und Coenzym Q, ausgewählt ist.
Test nach Anspruch 4, wobei der Radikalfänger Mannitol ist.
Test nach Anspruch 4, wobei die Konzentration des Fängers von etwa 5 mM bis etwa 150 mM ist.
Test nach Anspruch 4, wobei die Konzentration des Fängers von etwa 30 mM bis etwa 100 mM ist.
Test nach Anspruch 5, wobei die Konzentration von Mannitol 50 mM ist.
Test nach Anspruch 1, wobei das wäßrige Medium eine gepufferte, wäßrige Lösung mit einem pH umfaßt, welcher im wesentlichen ein Medium zum Erhalten einer ausreichend hohen maximalen Reaktionsgeschwindigkeit für das Enzym bereitstellen kann, wobei das Enzym im wesentlichen hohe Spezifität gegenüber dem interessierenden Analyten aufweist.
Test nach Anspruch 1, wobei das Reaktionsgemisch weiter Chelatoren zur Entfernung unerwünschter Metallionen aus dem Medium umfaßt.
Test nach Anspruch 10, wobei die Chelatoren aus der Gruppe, bestehend aus Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylenglycolbis(beta-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetat und 2,2-Bis(hydroxyethyl)-2,2',2''-nitrolotriethanol, ausgewählt sind.
Test nach Anspruch 1, wobei der Analyt aus der Gruppe, bestehend aus Bilirubin, Glucose, Cholesterol, neutralen Fetten, freien Fettsäuren, Phospholipiden und Harnsäuren, ausgewählt ist.
Test nach Anspruch 12, wobei der Analyt Bilirubin ist.
Test nach Anspruch 13, wobei das Bilirubin konjugiert ist.
Test nach Anspruch 1, wobei das Enzym aus der Gruppe, bestehend aus Bilirubinoxidase, Glucoseoxidase, Cholesteroloxidase, Uricase, Acylcoenzym-A-Oxidase, Cholinoxidase und Glycerol-3-phosphatoxidase, ausgewählt ist.
Test nach Anspruch 1, wobei das Enzym Bilirubinoxidase ist und aus der Gruppe, bestehend aus Myrothecium sp. Bilirubinoxidase und Coprinus sp. Bilirubinoxidase, ausgewählt ist.
Test nach Anspruch 1, wobei der Analyt Bilirubin ist und die Produktspezies Biliverdin ist.
Test nach Anspruch 1, wobei der Bestimmungsschritt die Messung der Lichtabsorption des Gemisches umfaßt.
Test nach Anspruch 18, wobei die Lichtabsorption des Gemisches im sichtbaren Bereich ist.
Test zum Nachweis von Bilirubin, das eine Autoxidation eingeht, in einer Testprobe, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) das Bilden eines Reaktionsgemisches durch das Kombinieren (i) einer Bilirubin enthaltenden Probe und (ii) Mannitol als einen Stabilisator, der die Geschwindigkeit der radikalisch vermittelten Autoxidation des Bilirubins reduziert, in einem wäßrigen Medium, b) das Inkubieren des Reaktionsgemisches und das Ermitteln der Geschwindigkeit der Autoxidation, c) wenn die ermittelte Geschwindigkeit der Autoxidation im wesentlichen Null ist, das Zugeben einer ausreichenden Menge Bilirubinoxidase als ein Enzym, welches die Oxidation des Bilirubins katalysiert, zu dem Gemisch, so daß in der Gegenwart von Mannitol Bilirubin zu Biliverdin als die Produktspezies oxidiert wird, und d) das Bestimmen von Biliverdin, Bilirubin oder beidem.
Test nach Anspruch 20, wobei das wäßrige Medium eine gepufterte, wäßrige Lösung mit einen pH umfaßt, welcher im wesentlichen ein Medium zum Erhalten einer ausreichend hohen maximalen Reaktionsgeschwindigkeit für das Enzym bereitstellen kann, wobei das Enyzm im wesentlichen hohe Spezifität gegenüber dem interessierenden Analyten aufweist.
Test nach Anspruch 21, wobei die gepufferte, wäßrige Lösung befähigt ist, das Medium bei einem alkalischen pH beizubehalten.
Test nach Anspruch 22, wobei die gepufferte, wäßrige Lösung befähigt ist, das Medium von pH 8 bis pH 10 beizubehalten.
Test nach Anspruch 23, wobei die gepufterte, wäßrige Lösung befähigt ist, das Medium bei pH 10 beizubehalten.
Test nach Anspruch 21, wobei die gepufferte, wäßrige Lösung Glycinpuffer ist.
Testkit zum Nachweis eines Analyten, der eine erste Autoxidation in einem wäßrigen Medium und eine zweite, katalysierte Enzymoxidation in eine Produktspezies eingeht, in einer Testprobe, wobei der Kit umfaßt: (a) ein wäßriges Medium, (b) einen Stabilisator, der befähigt ist, als ein Radikalfänger für den Analyten, wenn dieser in dem wäßrigen Medium ist, zu wirken, und getrennt (c) ein Enzym, das nach Zugabe befähigt ist, nach der ersten Autoxidation die zweite Oxidation des Analyten in eine Produktspezies zu katalysieren.
Testkit nach Anspruch 26, wobei die Testprobe aus der Gruppe, bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, pleuraler oder zerebraler Spinalflüssigkeit, Fruchtwasser, Urin, Fäkalien, Schleim, Zeltextrakten, Gewebeextrakten und Eiter, ausgewählt ist.
Testkit nach Anspruch 26, wobei der Stabilisator, der befähigt ist, als ein Radikalfänger zu wirken, aus der Gruppe, bestehend aus Mannitol, Inositol, Tocopherol, Superoxiddismutase, Katalase, Glutathion, Glutathionperoxidase, 2-Mercaptoethanol, N-2-Mercaptopropenylglycin, Dimethylharnstoff, Dimethylthioharnstoff, butyliertem Hydroxytoluol, butyliertem Hydroxyanisol, den 21-Aminosteroiden, Deferoxamin, Allopurinol, Dimethylsulfoxid und Coenzym Q, ausgewählt ist.
Testkit nach Anspruch 28, wobei der Stabilisator, der befähigt ist, als ein Radikalfänger zu wirken, Mannitol ist.
Testkit nach Anspruch 28, wobei die Konzentration des Fängers von 5 mM bis 150 mM ist.
Testkit nach Anspruch 28, wobei die Konzentration des Fängers von 30 mM bis 100 mM ist.
Testkit nach Anspruch 28, wobei die Konzentration von Mannitol 50 mM ist.
Testkit nach Anspruch 26, wobei das wäßrige Medium eine gepufferte, wäßrige Lösung mit einem pH umfaßt, welcher im wesentlichen ein Medium zum Erhalten einer ausreichend hohen maximalen Reaktionsgeschwindigkeit für das Enzym bereitstellen kann, wobei das Enzym im wesentlichen hohe Spezifität gegenüber dem interessierenden Analyten aufweist.
Testkit nach Anspruch 26, wobei der Analyt aus der Gruppe, bestehend aus Bilirubin, Glucose, Cholesterol, neutralen Fetten, freien Fettsäuren, Phospholipiden und Harnsäuren, ausgewählt ist.
Testkit nach Anspruch 34, wobei der Analyt Bilirubin ist.
Testkit nach Anspruch 35, wobei das Bilirubin konjugiert ist.
Testkit nach Anspruch 26, wobei das Enzym aus der Gruppe, bestehend aus Bilirubinoxidase, Glucoseoxidase, Cholesteroloxidase, Uricase, Acylcoenzym-A-Oxidase, Cholinoxidase und Glycerol-3-phosphatoxidase, ausgewählt ist.
Testkit nach Anspruch 26, wobei das Enzym Bilirubinoxidase ist und aus der Gruppe, bestehend aus Myrothecium sp. Bilirubinoxidase und Coprinus sp. Bilirubinoxidase, ausgewählt ist.
Testkit nach Anspruch 26, wobei der Analyt Bilirubin ist und die Produktspezies Biliverdin ist.