DE4142558A1

DE4142558A1 - Reagenzgemisch zur bestimmung von harnsaeure oder anderen h(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)(pfeil hoch)0(pfeil hoch)(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-liefernden oxidase-reaktionssystemen

Info

Publication number: DE4142558A1
Application number: DE19914142558
Authority: DE
Inventors: Peter Dr Berlin; Dagmar Breitfeld; Klaus Dr Kirschke; Maria Dr Schulze; Christa Dr Scholz; Friedrich Priem
Original assignee: INST MOLEKULARBIOLOGIE AK
Current assignee: BERLIN, PETER, DR., 52428 JUELICH, DE
Priority date: 1991-12-21
Filing date: 1991-12-21
Publication date: 1993-09-16

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagenzgemisch zur enzymatischen Bestimmung von Harnsäure und von anderen H₂O₂-liefernden Oxidase-Reaktionssystemen, insbesondere im Blutserum. Sie wird als chromogenes Testsystem in photometrischen Analysenautomaten oder im manuellen photometrischen Küvettentest auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik angewendet. Darüber hinaus findet die Erfindung auch überall dort Anwendung, wo, wie z. B. bei der Lebensmittelanalytik, H₂O₂-liefernder Oxidase-Reaktionssysteme nachzuweisen sind.

Harnsäure und zahlreiche andere Analyte auf den verschiedensten Gebieten lassen sich durch ein H₂O₂-lieferndes Oxidase-Reaktionssystem in Kombination mit einer H₂O₂-Indikatorreaktion direkt (Analyt=Oxidasesubstrat) oder nach Vorreaktion zu einem Oxidasesubstrat nach folgendem allgemeinen Reaktionsschema photometrisch bestimmen:

Das spektrale Signal, das ausgehend von den zahlreich bekannten H₂O₂-Indikatorsystemen bei unterschiedlichen Wellenlängen im sichtbaren Spektralbereich liegen kann, wird als Änderung der Lichtabsorption und/oder Lichtemission des Reaktionsgemisches vermessen und mit der Analyt-Konzentration in Beziehung gesetzt.

Die große strukturelle Vielfalt der Chemie der H₂O₂-Indikatorreaktionen und die zahlreich aufgefundenen Oxidasespezies haben zu einem enormen Umfang der Verfahrensbeispiele auf diesem Gebiet geführt. Wählt man den Indikatorreaktionstyp als ordnendes Prinzip, so lassen sich die Verfahrensbeispiele in folgende Gruppen gliedern:

Anwendung

- nicht-katalysierter
- Katalase-katalysierter
- Schwermetallionen-katalysierter und
- Peroxidase-katalysierter

H₂O₂-Indikatorsysteme. Dabei spielt der Peroxidase-katalysierte H₂O₂-Nachweis hinsichtlich des Umfangs der Verfahrensbeispiele und der Anwendungsbreite eine besondere Rolle. Hervorzuheben sind folgende Reaktionstypen:

1. Redox-Reaktion:

2. Oxidative Kupplungsreaktion:

2.1 EMERSON-TRINDERS-Reaktionstyp ("4-AAP-Systeme")

2.2 FARBFOTOGRAFIE-Reaktionstyp ("p-PDA-Systeme")

2.3 "MBTH-Systeme"

Praktische Bedeutung erlangten insbesondere in der medizinischen Diagnostik

- der Indikatortyp 2.1 in Form von Küvetten-Testsystemen und als Film-Teststreifen sowie
- der Indikatortyp 2.2 vor allem als Film-Teststreifen jedoch kaum in Form eines Küvetten-Testsystems.

Die Ursache für die bisher eingeschränkte Anwendungsmöglichkeit der "p-PDA-Systeme" in Küvettentests liegt in ihrer starken Autoxidationsneigung, die mit den bekannten Reagenzlösungen bereits ohne Analyt zur Farbstoffbildung führt und eine Endpunkt-Messung bisher unmöglich machte. Das Autoxidationsproblem wird auch nach EP 2 43 126, das die Anwendung von p-Phenylendiamin-/Naphtholderivaten als H₂O₂-Indikatorsystem beschreibt, nicht gelöst.

Ein Nachteil der "4-AAP-Systeme" ist, daß es bei ihren Absorptionsmaxima zwischen 480 und 560 nm zu spektralen Interferenzen durch Serumbestandteile (z. B. Bilirubin) kommt, die ebenfalls in diesem Wellenlängenbereich Licht absorbieren und so zu fehlerhaften Meßwerten führen können. Als weiterer Mangel der 4-AAP-Systeme wird eine häufig geringe Farbstoffstabilität angeführt (vgl. DD 2 32 558). In dem zitierten DD-Ausschließungspatent wird zwar dieser Mangel vermieden, jedoch läßt die Empfindlichkeitsgrenze die Bestimmung von Analyten wie Harnsäure oder Creatinin im µMol/l-Konzentrationsbereich (im Serum) als kritisch erscheinen. In einer anderen Schrift (DE 34 46 637) wird zwar eine Empfindlichkeitssteigerung beschrieben, jedoch bleiben auch dort die oben angeführten Mängel bestehen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein in seinen Gebrauchswerteigenschaften verbessertes Reagenzgemisch zu entwickeln, das bei der Uricase-katalysierten Bestimmung von Harnsäure im Humanserum anwendbar ist und auch die Bestimmung anderer H₂O₂-liefernder Oxidase-Reaktionssysteme gestattet.

Die Aufgabe wird mit Anspruch 1 und 10 erfindungsgemäß gelöst. Die Ansprüche 2 bis 9 sind Vorzugsvarianten. Überraschenderweise werden die Mängel der bisher bekannt gewordenen Verfahrensbeispiele vermieden, wenn beispielsweise die Harnsäure-Bestimmung in Humanseren unter Anwendung der erfindungsgemäßen Reagenzgemisch-Zusammensetzung mit 15 bis 50 µMol/l, vorzugsweise 30 µMol/l, N-Butyl-N-(4-sulfo-butyl)-p-phenylendiamin erfolgt. Der zeitliche Reaktionsverlauf bei optimaler N-Butyl-N-(4-sulfo-butyl)-p-phenylendiamin-Konzentration von 30 µMol/l im Vergleich zu einer höheren Konzentration und zu einem strukturell andersartigen p-Phenylendiaminderivat im Reagenzgemisch wird in Darstellung 1 gezeigt. Bemerkenswerterweise liegt das N-Butyl-N-(4-sulfo-butyl)-p-phenylendiamin unter den erfindungsgemäßen Konzentrationsbedingungen, abweichend von den bisher bekannten Verfahren, gegenüber der Analytkonzentration im Meßansatz in einem scheinbar nur minimalen Konzentrationsüberschuß vor. Überraschend gestattet das erfindungsgemäße Reagenzgemisch, Harnsäure selbst bei hoch pathologischen Konzentrationen bis zu 900 µMol/l im Humanserum richtig zu bestimmen, wie der Vergleich mit Werten, die mittels unabhängiger Referenzmethode bestimmt wurden, zeigt (vgl. unter Ausführungsbeispiele bzw. Darstellung 2).

Als H-Donatorverbindung wird ein Naphtholderivat der allgemeinen Formel I in Konzentrationen zwischen 0,5 und 2,0 mMol/l im Reagenzgemisch eingesetzt. Dabei erweist sich das 1-Hydroxy-4,7-disulfo-naphthalen-2-carbonsäure (5-hydroxy-3-azapentyl)amid (Formel I (d), X=Y=SO₃H) auf Grund seiner guten Wasserlöslichkeit und bezüglich Absorptionsmaximum bzw. Absorptionskoeffizienten des gebildeten Farbstoffs als besonders vorteilhaft. Alle anderen Naphtholderivate der allgemeinen Formel I, die nur eine Sulfogruppierung oder als Substituent "X"=H, Cl, Br, SCN oder S-CH₂COOCH₃ enthalten, sind in Wasser mehr oder weniger gut löslich und liegen im Gemisch mit einem Lösungsvermittler im Reagenzgemisch vor. Als Lösungsvermittler dienen übliche mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie z. B. DMF, Glykole, z. B. Ethylenglykol, Glykolether oder Polyethylenglykolether, z. B. Ethylenglykolmonomethylether, Diethylenglykoldimethylether bzw. Polyethylenglykolether 400. Weiterhin erweisen sich auch bekannte Naphtholderivate, die anders als in Formel I strukturiert sind, oder andere für die oxidative Kupplungsreaktion mit p-Phenylendiaminderivaten üblicherweise geeignete Verbindungen, z. B. Phenole, oder Kupplerverbindungen aus der Farbfotografie als prinzipiell geeignet. Das Reagenzgemisch enthält in Konzentrationen von 1 bis 5 U/ml eine Peroxidase, vorzugsweise eine durch Brenzcatechin-disulfonsäuredichlorid "vernetzte" Peroxidase, hergestellt nach DD 2 70 722. Die vernetzte Peroxidase führt vergleichsweise zu unmodifizierter Peroxidase zu einer scheinbar höheren Farbausbeute, was sich in ca. 20% höheren Extinktionswerten ausdrückt. Weiterhin enthält das Reagenzgemisch mindestens eine H₂O₂-liefernde Oxidase und gegebenenfalls Enzymkatalysatoren, die in einer Vorreaktion die Umsetzung des Analyten zu einem Oxidasesubstrat katalysieren. Die Oxidase- bzw. Enzym-Konzentrationen im Reagenzgemisch werden ausgehend von den Enzym-spezifischen reaktionskinetischen Parametern in bekannter Weise nach höchster Farbstoffbildungsgeschwindigkeit und nach höchster Farbausbeute optimiert. Beispielsweise liegt im Falle eines Harnsäure-Testansatzes eine, vorzugsweise nach Verfahren DD 2 46 746 mikrobiell gewonnene, Uricase in Konzentrationen zwischen 0,3 und 1,5 U/ml Reagenzgemisch vor. Uricasespezies anderer Herkunft sind ebenfalls einsetzbar. Hinsichtlich des Reaktionsmilieus werden Pufferionen-Zusammensetzungen mit pH-Werten zwischen 7 und 9 angewendet. Zur Harnsäure-Bestimmung erweist sich eine 100 mmolare K-Phosphat-Pufferlösung bei pH 8 sowohl für die Farbstoffbildung als auch bezüglich der Stabilität der Reagenzlösung 2 (vgl. Ausführungsbeispiele) bei einer Standzeit <4 Wochen (bei +4 bis +6°C) als besonders vorteilhaft. Bei Creatinin- bzw. Cholesterin-Testansätzen werden 100 mmolare K-Phosphat-Pufferlösungen mit pH-Werten zwischen 7 und 8 eingesetzt, wobei die Creatinin-Bestimmung vorzugsweise bei pH 7,6 erfolgt. Weiterhin enthält das Reagenzgemisch 0,2 bis 1 Gew.-% eines Salzes der Cholsäure und zu 0,2 bis 2 Gew.-% eines bekannten Fettalkoholpolyethylenglykolethers, wobei sich als Vorzugsvariante Gehalte von 0,25 Gew.-% Na-Cholat und 0,35 Gew.-% Isotridecylpolyethylenglykolether als vorteilhaft erweisen. Als Fettalkoholpolyethylenglykolether ist auch ein Dodecylpolyethylenglykolether ("Thesit") geeignet, jedoch scheint die störende Hydroperoxidbildung bei Thesit leichter zu erfolgen als vergleichsweise zu dem in der Vorzugsvariante angewendeten Detergenz. Von den bekannten Stabilisierungsmitteln erweist sich EDTA-Na-Salz in einer Konzentration von 100 bis 400 µMol/l, vorzugsweise 250 µMol/l, im Reagenzgemisch als besonders vorteilhaft.

Die Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzgemisches erfolgt im Falle der Harnsäure-Bestimmung nach der Vorzugsvariante (vgl. Ausführungsbeispiel 1) bei wahlweiser Variationsmöglichkeit des photometrischen Verfahrens, z. B. im Analysenautomaten, im Halbmikro-Küvettentest oder in Form eines Mikrotiterplatten-Testes mittels Mehrkanalphotometer.

Dabei wird eine Reagenzlösung 1 (RG 1), bestehend aus N-Butyl-N-(4-sulfo-butyl)-p-phenylendiamin, Na-Cholat, Detergenz und EDTA-Na-Salz in bidest. Wasser und eine Reagenzlösung 2 (RG 2), bestehend aus einem Naphtholderivat, einer Uricase und einer Peroxidase in 100 mmolarer K-Phosphat-Pufferlösung (pH 8) angewendet (vgl. Ausführungsbeispiel 1). Aber auch eine RG 1, die das p-Phenylendiaminderivat, das Naphtholderivat, das Detergenz, Na-Cholat und EDTA-Na-Salz bei einem pH-Wert zwischen 3,5 und 4 enthält, ist einsetzbar. In diesem Falle besteht die RG 2 aus Uricase und Peroxidase in Pufferlösung bei pH 8 bis 9.

Der Testansatz erfolgt nach dem Meßregiem des jeweiligen Analysenautomaten und üblicherweise in Zwei-Reagenzvolumen-Schritten, z. B. wie 250 µl RG 1, 15 µl Serumprobe und 150 µl RG 2.

Im Falle des manuellen Küvettentestes oder bei Einsatz als Mikrotiterplatten-Test werden die Testansätze z. B. gemäß Ausführungsbeispiel 1 in der Pipettierschrittfolge RG 1, RG 2 und Serumprobe bei bekannter Anwendung eines Leerwertes und eines Standardwertes durchgeführt. Der Harnsäure-Standard liegt im Konzentrationsbereich 350 bis 450 µMol/l. Die Harnsäure-Testansätze erfolgen z. B. nach der Vorzugsvariante bei einer Meßwellenlänge zwischen 690 und 710 nm bei Anwendung des Endpunkt-Meßprinzips.

Bei Einsatz anderer Naphtholderivate der Formel I können die Absorptionsmaxima der entsprechenden Farbstoffe zwischen 640 und 725 nm variieren. Die Testansätze sind hinsichtlich der Reagenzvolumen-Schritte, gegebenenfalls bei Variation der Reagenzienkonzentrationen, modifiziert anwendbar, wobei insbesondere geringe RG-2-Volumentoleranzen auch ohne Konzentrationsänderungen möglich sind. Bei längeren RG-2-Standzeiten (<4 Wochen bei +4 bis +6°C) sind insbesondere höhere Uricase- bzw. Peroxidase-Konzentrationen von Vorteil. Der Einsatz der Erfindung bei anderen H₂O₂-liefernden Oxidase-Reaktionssystemen erfolgt, gegebenenfalls unter Anwendung Enzym-katalysierter Vorreaktionen (vgl. Creatinin- bzw. Cholesterin-Testansätze, Ausführungsbeispiele 3 bzw. 4) unter Verwendung der RG 1 Vorzugsvariante aus Beispiel 1 und einer in seiner Enzym-Zusammensetzung und gegebenenfalls des pH modifizierten RG 2.

Bei Analytstoffen, die in mmolaren Konzentrationen im Analysengut vorkommen, werden auch Reagenzlösungen 1 (RG 1) mit 0,5 bis 1,0 mMol/l 4-Aminoantipyrin anstelle eines p-Phenylendiaminderivates eingesetzt (vgl. Beispiel 4). Dabei bleibt die Reagenzlösung 2 unverändert, wie bei Anwendung p-Phenylendiaminderivat-haltiger RG 1, jedoch liegt die Meßwellenlänge bei 490 bis 520 nm (vgl. Beispiel 4).

Ausführungsbeispiele

Referenzmethode zur Bestimmung von Harnsäure in Humanseren: Siehe bei P. H. DUNCAN, N. GOCHMAN, T. COOPER, E. SMITH und D. BAYSE, Clin. Chem. 28/2, 284-290 (1982): "A Candidate Reference Method for Uric Acid in Serum. I. Optimation and Evaluation".

Vergleichsmethode: HiCo Harnsäure PAP (UA), Firma BOEHRINGER-MANNHEIM GmbH, Analysenautomat HITACHI 717.

Die Automaten-Testansätze mit dem erfindungsgemäßen Reagenzgemisch erfolgten ebenfalls mittels Analysenautomat HITACHI 717.

Beispiel 1 Harnsäure-Testsystem für Analysenautomaten oder für den manuellen Halbmikro-Küvettentest

Reagenzlösung 1 (RG 1)

Reagenzlösung 2 (RG 2)

Manueller Küvetten-Testansatz bei 25°C oder 37°C

(Halbmikro-Maßstab bei max. Füllvolumen=ca. 500 µl, d=10 mm)

Beispiel 2 Harnsäure-Bestimmung mittels Mehrkanalphotometer (Mikrotiterplatten-Test) und Analysenautomat

Mikrotiterplatten-Testansatz

Konzentrationen im Meßansatz:

AC60:
31,3 µMol/l
Naphtholderivat:	578 µMol/l
POD:	1,6 U/ml
UO:	0,3 U/ml
Na-Cholat:	0,25%ig
Detergenz:	0,31%ig
EDTA-NA-Salz	269 µMol/l

HS-Konzentration=E_P×F
E_P=Extinktion_P-LW
F=HS-Standard-Konz./E_S
E_S=Extinktion_S-LW

Beispiel 3 Creatinin-Testsystem für Analysenautomaten oder für den manuellen Halbmikro-Küvettentest

Manueller Küvetten-Testansatz bei 25°C oder 37°C

(Halbmikro-Maßstab bei max. Füllvolumen=ca. 500 µl, d=10 mm)

Meßwellenlänge: 700 nm, Meßwerterfassung innerhalb 5 bis 30 Min.
Meßverfahren: "Zweipunkt", Extinktion (t₁)-Extinktion (t₂)=ΔE
t₁, t₂=Zeit 1, Zeit 2 (in Min.) nach Reaktionsstart
ΔE/Min.=ΔE/(t₂-t₁)

Beispiel 4 Cholesterin-Testsystem für Analysenautomaten oder für den manuellen Halbmikro-Küvettentest

(Meßwerterfassung innerhalb 60 Min., Berechnung der Cholesterin-Konzentration nach Cholesterin-Standard-Bezugsmethode analog Harnsäure-Beispiel 1 bzw. 2)

Claims

1. Reagenzgemisch, bestehend aus einem p-Phenylendiaminderivat oder 4-Aminoantipyrin, einer H-Donatorverbindung, einer Peroxidase, einer Uricase oder einer anderen H₂O₂-liefernden Oxidase, einem Detergenz oder einer anderen mit Wasser mischbaren Verbindung, einer Stabilisatorverbindung, und einer Pufferlösung, zur photometrischen Bestimmung von Harnsäure oder anderen H₂O₂-liefernden Oxidase-Reaktionssystemen, gekennzeichnet dadurch, daß es 15 bis 50 µMol/l N-Butyl-N-(4-sulfo-butyl)-p-phenylendiamin als p-Phenylendiaminderivat, ein Naphtholderivat der allgemeinen Formel I R¹=(CH₂)₂-OH (a), (CH₂)₂-NH₂ (b), (CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-NH₂ (c), (CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-OH (d), (CH₂)₃-NH-(CH₂)₃-NH₂ (e), (CH₂)₃-NH-(CH₂)₃-OH (f);
X=H, Cl, Br, SCN, SO₃H, S-CH₂-COOCH₃;
Y=H, SO₃Hals H-Donatorverbindung, eine chemisch modifizierte Peroxidase, eine Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 7 und 9, 0,2 bis 1% eines Salzes der Cholsäure, 0,2 bis 2% eines Fettalkoholpolyethylenglykolethers als Detergenz und 100 bis 400 µMol/l EDTA-Na-Salz als Stabilisatorverbindung enthält.

2. Reagenzgemisch nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß es 30 µMol/l, N-Butyl-N-(4-sulfo-butyl)-p-phenylendiamin enthält.

3. Reagenzgemisch nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Naphtholderivat 1-Hydroxy-4,7-disulfo-naphthalen-2-carbonsäure (5-hydroxy-3-azapentyl)amid ist.

4. Reagenzgemisch nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die chemisch modifizierte Peroxidase eine durch Brenzcatechin-3,5-disulfonsäuredichlorid vernetzte Peroxidase ist.

5. Reagenzgemisch nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Pufferlösung eine 100 mmolare K-Phosphat-Pufferlösung mit pH 8 ist.

6. Reagenzgemisch nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß es 0,25% eines Salzes der Cholsäure und 0,35% eines Fettalkoholpolyethylenglykolethers als Detergenz enthält.

7. Reagenzgemisch nach Anspruch 1 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß der Fettalkoholpolyethylenglykolether Isotridecylpolyethylenglykolether ist.

8. Reagenzgemisch nach Anspruch 1 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß der Fettalkoholpolyethylenglykolether Dodecylpolyethylenglykolether ist.

9. Reagenzgemisch nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß es 250 µMol/l EDTA-Na-Salz als Stabilisatorverbindung enthält.

10. Verwendung des Reagenzgemisches gemäß Anspruch 1 bis 9, zur photometrischen Bestimmung von Harnsäure, Creatinin und Cholesterin in Körperflüssigkeiten und von anderen H₂O₂-liefernden Oxidasereaktionssystemen.