DE1598133C3 - - Google Patents
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Description
R1-C-(N)n-N=C,
X R,
(D
'5
verwendet, in der bedeutet R1 eine Aminogruppe,
gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierte aliphatische, aromatische oder heterocyclische
Reste, oder die Gruppe
30
C-(N)n-N=C
X R,
R2 Wasserstoff, gegebenenfalls ein- oder mehrfach
substituierte aliphatische, aromatische oder heterocyclische Reste, R3 Wasserstoff, eine Alkyl- oder
gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierte Phenylgruppe, R4 eine Amino-, Hydroxy- oder
Alkoxygruppe, R5 und R6 Wasserstoff, Amino-,
Hydroxy-, Alkoxy- oder Alkylgruppen, X Sauerstoff, Schwefel oder eine gegebenenfalls mit R1 substituierte
Iminogruppe, η die Zahlen 0 oder 1, wobei X zusammen mit R1 oder R1 zusammen mit
R2 oder R1 zusammen mit R3 einen gegebenenfalls
substituierten Ring bilden können.
2. Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung
von Hydroperoxid reagieren, enthaltend Peroxidase oder eine peroxidatisch wirksame Substanz
und ein Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen
Formel I gemäß Anspruch 1 enthalten sind.
3. Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen
Substanzen, enthaltend ein Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildende Substanzen und ein
Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel I
gemäß Anspruch 1 enthalten sind.
65 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden, bzw. von Substanzen,
die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen
Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase
bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung. Die Erfindung
betrifft ferner diagnostische Mittel zur Durchführung derartiger Verfahren.
Von besonderem diagnostischem Interesse ist der Nachweis von Glukose im Harn, Blut und Serum bei
Diabetes sowie der Nachweis von peroxidatisch wirkenden Substanzen, wie Hämoglobin im Harn und
Blut, und der Nachweis von Hydroperoxiden z. B. in der Milchwirtschaft, Kosmetik und Polymerchemie.
Es sind eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxid und Peroxidase als Katalysator
zu einem Farbstoff oxidiert werden (vgl. schweizerische Patentschrift 339 755 und britische Patentschrift
1035 911). Die Substanzen, die bevorzugt verwendet werden, sind z. B.: Benzidin, o-Dianisidin,
o-Tolidin, Guajakol usw. Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht sehr stabil und können nach den
neuesten Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so daß ihre Handhabung nicht ungefährlich erscheint.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Substanzen zu finden, die als Chromogene für ein
Verfahren der obengenannten Art geeignet und zugleich stabil und unschädlich sind.
Es wurde überraschenderweise eine Substanzgruppe gefunden, die zum Teil bessere Indikatoreigenschaften
als die bisher verwendeten Benzidinkörper zeigt, aber dabei absolut beständig ist und sich demzufolge
besonders gut dazu eignet, Wasserstoffperoxid und andere Hydroperoxide sowohl im optischen Test als
auch mit Hilfe von Reagenzpapieren zu bestimmen. Die Substanzen sind physiologisch unschädlich und
besitzen die allgemeine Formel I
R1-C-(N)n-N=C
X R7
in welcher bedeutet R1 eine Aminogruppe, gegebenenfalls
ein- oder mehrfach substituierte aliphatische, aromatische oder heterocyclische Reste, oder die
Gruppe
-C-(N)n-N=C
X R2
R2 Wasserstoff, gegebenenfalls ein- oder mehrfach
substituierte aliphatische, aromatische oder heterocyclische Reste, R3 Wasserstoff, eine Alkyl- oder
gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierte Phenylgruppe, R4 eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe,
R5 und R6 Wasserstoff, Amino-, Hydroxy-,
Alkoxy- oder Alkylgruppen, X Sauerstoff, Schwefel oder eine gegebenenfalls mit R1 substituierte Iminogruppe,
η die Zahlen 0 oder 1, wobei X zusammen mit R1 oder R1 zusammen mit R2 oder R1 zusammen
mit R3 einen gegebenenfalls substituierten Ring bilden können.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird somit dadurch gelöst, daß man in einem Verfahren der eingangs
genannten Art als Chromogene Substanzen der allgemeinen Formell verwendet. Die Bestimmung von
Hydroperoxiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen
geeignet, wie z. B. für die Bestimmung von Glukose, Galaktose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxiden,
Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie Enzymaktivitäten.
Bei der Bestimmung von Glukose beispielsweise wird diese von Glukoseoxidase zu Glukonsäure
oxidiert, wobei der Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert
dann mittels Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz den erfindungsgemäß verwendeten
Indikator zum entsprechenden Farbstoff. Weitere Beispiele für derartige analytisch brauchbare Enzymsysteme,
die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagieren, sind L-Aminosäureoxidase + L-Aminosäuren,
D-Aminosäureoxidase + D-Aminosäuren, Uricase + Harnsäure, Xanthinoxidase + Hypoxanthin
bzw. Xanthin, Glycinoxidase + Glycin, Monoaminooxidase + Monoamin (wie Adrenalin, Mescalin usw.),
Diaminoxidase + Diamine (wie Histamin), Luciferase + Luciferin, D-Asparaginsäureoxidase + D-Asparaginsäure,
Leber-Aldehydoxidase + Aldehyd, Galaktoseoxidase + Galaktose, Edsons Flavinenzym
+ Milchsäure.
Die Auswertung der Verfärbung erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im Spektralphotometer
oder bei Verwendung von Testpapierstreifen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben
bekannter Zusammensetzung bzw. Farbtafeln.
Das erfindungsgemäße Verfahren und zu seiner Durchführung geeignete diagnostische Mittel werden
an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
50
Beispiel 1
Nachweis von Peroxiden in Flüssigkeiten Beispiel 2
Nachweis von Glukose im Harn
Nachweis von Peroxiden in Flüssigkeiten Beispiel 2
Nachweis von Glukose im Harn
7,5 mg Peroxidase und 143 mg Glukoseoxidase werden in 100 ml eines 0,1-m Citrat- oder Phosphatpuffers
vom pH 5,6 gelöst. Mit dieser Lösung imprägniert man Filterpapier (2316 der Firma Schleicher &
Schüll). Danach werden 0,30 g 2,3-Dihydroxybenzal-(vanilloyl)-hydrazon
in 100 ml Alkohol gelöst und das Filterpapier noch einmal imprägniert. Beim Eintauchen
in glukosehaltigen Harn zeigt das Papier ab etwa 50mg-% eine Rosafärbung, die je nach
Intensität den Glukosegehalt angibt.
Beispiel 3
Nachweis von Glukose im Blut
Nachweis von Glukose im Blut
7,5 mg Peroxidase, 143 mg Glukoseoxidase und 200 mg alginsaures Natrium werden in 100 ml 0,4-m
Citrat- oder Phosphatpuffer von pH 5,6 gelöst. Mit dieser Lösung wird ein Filterpapier (23 S der Firma
Schleicher & Schüll) imprägniert. In einem zweiten Imprägniervorgang wird dasselbe Papier mit einer
Lösung von 0,316 g o-Vanillin-(vanilloyl)-hydrazon in 100 ml Alkohol getränkt. Danach wird das Papier
in einem dritten Imprägniervorgang mit einer Lösung von 3 g Paraffin in 100 ml Petroläther imprägniert.
Bringt man auf ein so hergestelltes Papier einen Tropfen Blut mit 50 mg-% Glukose, läßt 1 Minute
einwirken und wäscht das Blut mit Wasser ab, so zeigt das Papier eine deutlich violette Färbung. Die Farbintensität
hängt von der Glukosekonzentration im Blut ab.
Beispiel 4
Nachweis von Glukose in Flüssigkeiten
Nachweis von Glukose in Flüssigkeiten
Es werden Tabletten folgender Zusammensetzung gepreßt:
o-Vanillin-(vanilloyl)-hydrazon 0,002 g
Peroxidase 0,001 g-
Glucoseoxidase 0,002 g
sek. Natriumphosphat 0,0069 g
prim. Natriumphosphat 0,013 g
Eine solche Tablette wird in 5 ml Alkohol/Wasser (1: 1) gelöst, mit 0,2 ml der zu messenden Glukoselösung
versetzt, mit Alkohol auf 10 ml aufgefüllt und bei einer Wellenlänge von 520 nm colorimetrisch
gemessen. Aus der gemessenen Extinktion wird der Glukosegehalt auf Grund einer Eichkurve ermittelt.
7,5 mg Peroxidase werden in 100 ml eines 0,1-m Citrat- oder Phosphatpuffers von pH 5,6 gelöst und
damit ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) imprägniert. Danach werden
0,31 g o-Vanillin-(o-vanilloyl)-hydrazon in KX) ml Alkohol gelöst und das Filterpapier nochmals imprägniert.
Beim Eintauchen in Lösungen von Wasserstoffperoxid verschiedener Konzentrationen werden
die Papiere, entsprechend der Konzentration, verschieden stark violett gefärbt.
Beispiel 5
Nachweis von Glukose mit weiteren Indikatoren
Nachweis von Glukose mit weiteren Indikatoren
Je 1 mMol der in nachstehender Tabelle aufgeführten Indikatoren wird in 1 ml Methanol gelöst bzw.
suspendiert, mit 1 ml einer Lösung von 143 mg Glukoseoxidase, 7,5 mg Peroxidase in 100 ml Phosphat-
oder Citratpuffer (pH 5,6) sowie 1 ml einer Glukoselösung versetzt. Man erhält die in der Tabelle
anneführten Farbreaktionen:
/■
R1-C-(N)n-N=C R6
X R2 R3
Substanz
Nr.
R1
R4
Farbe des Reaktionsproduktes
5a
OH
OCH,
OH
OCH,
OH
OCH,
OH
OCH,
OH
OCH,
OCH3
OH
OH
CH
O=
OH
OCH,
OH
OCH,
OH
OC2H5
OH
OH
OH
OH
OCH3
OH
Braun
Violett
Braun
Gelblichbraun
Rotviolett
Rotbraun
Fortsetzung
Substanz
Nr.
Nr.
Farbe des Reaktionsproduktes
10
11
12
12a
OH
OCH,
OH
OCH1
OH
OCH3
OH
OCH,
OH
OCH,
OH
OCH,
OCH3
OH
O =
OH
OH OCH3
OH
CH,
NH,
CH,
OH
OCH3
NH2
OH OCH3
OH OCH3
OH
Rotviolett
Grau
Braunviolett
Braunviolett
Blauviolett
Braun
Violett
Rotbraun
409 682/51
Fortsetzung
Substanz Nr.
η | 1 | X | R2 | R3 |
1 | O | H | H | |
1 | O | H | H | |
1 | O | H | H | |
1 | O | H | H | |
1 | O | H | H | |
1 | O | H | H | |
1 | O | H | H | |
1 | O | H | H | |
O | H | H |
Farbe des Reaktionsproduktes
12b
CH2
NO,
OH
OH
OH
NH,
OCH3 OH
(V CH =N— NH-C-
OH
OCH,
OH
OCH,
OH
OCH,
OCH3
OH OCH3
OH
OCH3
OCH3
OH
OCH3
OCH3
OH
OCH3
OCH3
OH
OCH3
OCH3
OH
Blauviolett
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Blaßviolett
Rotviolett
Orange
Gelblichrot
11
Fortsetzung
12
Substanz
Nr.
R4
Farbe des Reaktionsproduktes
22
24
25
26 27 28 29
OCH3 OH
CH3-
CH3
CH3-N-CH2-CH,
NH,
NH,
NH,
CH3
OH
C—
OH
NH,
OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH
NH2
CH,
NH
■/■
OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH
Himbeerfarben
Blauviolett
Violett
Blauviolett
Braun
Dunkelkarmin
Rosa
Blau
Weinrot
13
Fortsetzung
14
Substanz Nr.
R5
R1,
Farbe des Reaktionsproduktes
33
34
35
36
37
38
39
40
CH3 OH
CH3 H,N—CH,-
CH,
CH,
CH,-
CH3-CH
3-CH2-
OCH3
HO
NH2
C/
/-ι
OH
OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH
Rosa
Orange
Rosa
Purpur
Dunkelrot
Blau
Graubraun
Rotviolett
Violett
15
Fortsetzung
Substanz Nr. R4
Farbe des Reaktionsproduktes
42
43
44 45 46
47 48 49
OH
OH
OH
OCH,
OCH3
OH
OH
OCH3 OCH3
OH OH I OH
N—CH,-
C2H5-O-C-
OCH,
OCH,
OCH,
OH
OCH,
OH
OCH,
OH
OCH,
OH
OCH,
OH
OCH^
OH
OCH3
OH
Graubraun
Violett
Violett
Rot
Rotviolett
Braun
Weinrot
Orange
409 682/51
17
Fortsetzung
18
Substanz Nr. |
R, | O Il H2N-C- |
η | X | R2 | R., | R* | Farbe des Reaktionsproduktes |
50 | 1 | O | H | H | OCH3 (X |
Purpur | ||
CH = N-NH-C=O ι |
I OH | |||||||
I OH (CHOH)2- OCH3 |
||||||||
51 | 1 | O | H | H | OCH3 (X I OH |
Rot A |
Substanz
Nr.
Nr.
X R,
Farbe des Reaktionsproduktes
30
31
32
52
53
N-
O O
HN
-N—
CH,
N-N
OH
J=N
Vn'
CH,
-N—
>— N-
OCH3 OH
OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH OCH3
OH
Violett
Lila
Blau
Blau
Violett
Fortsetzung
Substanz
Nr.
Nr.
R1-C-(N)n
X R,
X R,
Farbe des
Reaktionsproduktes
Reaktionsproduktes
54
55
N—
56
Beispiel 6
Nachweis von Blut im Urin
Nachweis von Blut im Urin
Ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 0,316 g o-Vanillin-(vanilloyl)-hydrazon
in 100 ml Methanol imprägniert.
500 ml Akazienpflanzenschleim, der durch Kochen von 200 g Akazien in 500 ml Wasser hergestellt wurde,
und 25 ml Cumolhydroperoxid werden zusammengegeben und 5 Minuten im Mixer heftig gerührt.
Weiter werden in 1,51 Wasser 163 g Natriumeitrat und 37 g Zitronensäure gelöst. In dem auf diese Weise
erhaltenen Citratpuffer werden 3,5 g Gelatine gelöst, worauf man die obengenannte Lösung zugibt. Die
OCH3
Hellblau
OCH,
OH
OCH,
OCH,
Hellblau
Hellblau
vereinigten Lösungen vermischt man mit 5 ml einer l%igen wäßrigen Emulsion einer peroxidhaltigen
Stärke und — nachdem wieder gut durchgemischt wurde — mit 50 ml Natriumlaurylsulfat und rührt
5 Minuten weiter. Die so erhaltene Emulsion wird dann 5 Minuten in einen Homogenisator mit
100 kg/cm2 Druck gegeben. Zu der homogenisierten Mischung gibt man 250 ml des wie oben hergestellten
Citratpuffers. Die mit dem Indikator imprägnierten Papiere werden in die erhaltene Emulsion getaucht
und 16 Stunden bei 5O0C in einem Umlufttrockenschrank getrocknet. Die so erhaltenen Testpapiere
ergeben beim Eintauchen in einen bluthaltigen Urin eine violette Farbreaktion.
Claims (1)
1. Verfahren zur Bestimmung von Hydröperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung
von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit
Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw.
den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Chromogene Substanzen der allgemeinen Formel I
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