DE69215797T2

DE69215797T2 - Verfahren zur Messung von NADH und NADPH

Info

Publication number: DE69215797T2
Application number: DE69215797T
Authority: DE
Inventors: Masayasu Kurono; Kiichi Sawai; Osamu Takehiro; Shizuo Uno
Original assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Current assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Priority date: 1991-09-06
Filing date: 1992-08-31
Publication date: 1997-05-07
Anticipated expiration: 2012-09-01
Also published as: JPH0564598A; EP0530732B1; ATE146224T1; DE69215797D1; EP0530732A1; ES2097843T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung von β- Nicotinamidadenindinucleotid in reduzierter Form (nachstehend als "NADH" bezeichnet) oder β-Nicotinamidadenindinucleotidphosphat in reduzierter Form (nachstehend als "NADPH" bezeichnet), im wesentlichen ein Verfahren zur Messung von Wasserstoffperoxid, das durch eine enzymatische Reaktion erzeugt wird, welches für klinische Überprüfungen zur quantitativen Messung verschiedener biochemischer Substanzen oder der Aktivität von Enzymen in einer Körperflüssigkeitsprobe, wie Urin, Serum oder dergleichen, verwendet werden kann.
Zur Zeit wird die Messung biochemischer Substanzen und der Aktivität von Enzymen unter Verwendung einer Körperflüssigkeit als Probe zur Untersuchung biochemischer Eigenschaften derselben, klinischen Überprüfungen und dergleichen durchgeführt. In der Hauptzahl der Fälle ist es jedoch schwierig, die Substanz direkt und quantitativ zu messen, und dann wird ein indirektes quantitatives Meßverfahren durchgeführt, wobei ein Enzym mit der Substanz umgesetzt wird und eine andere Substanz, die quantitativ durch die Enzymreaktion gebildet wird, gemessen wird.
Beispiele für Substanzen, die quantitativ durch die Enzymreaktion gebildet oder verbraucht werden, sind (1) Wasserstoffperoxid als Produkt einer Oxidasereaktion und (2) NADH und NADPH als Coenzyme, die mit einer Reaktion einer Dehydrogenase in Beziehung stehen. Wenn eine derartige Substanz mit hoher Genauigkeit gemessen werden kann, wird eine Messung einer Menge der speziellen biochemischen Substanz oder der Enzymaktivität mit hoher Genauigkeit als Zielobjekt möglich.
Als einfaches und relativ hochempfindliches Verfahren mittels der Messung von Wasserstoffperoxid, das durch die Reaktion der Oxidase in dem Fall (1) gebildet wird, wird ein derartiges Verfahren im allgemeinen mit 4-Aminoantipyrin (nachstehend als "4-AA" bezeichnet) und einem Phenoloder Anilin-Derivat in Gegenwart von Peroxidase als farbentwickelndem Reagenz einer oxidativen Kupplungsreaktion durchgeführt. Als Phenole können Phenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,4-Dibromphenol, 3,5-Dichlor-2- hydroxybenzolsulfonsäure und dergleichen erwähnt werden. Als Anilin- Derivate können N,N-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin, N-Ethyl-N-(2- hydroxyethyl)-m-toluidin, N-Ethyl-N-(3-methylphenyl)-N'- acetylethylendiamin, N,N-Dimethyl-m-anisidin, N-substituiertes Anilin auf Grund einer Alkylsulfonsäure oder Hydroxyalkylsulfonsäure und dergleichen erwähnt werden. Weiter kann 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) anstelle von 4-AA verwendet werden.
Während es mehrere Verfahren zur Messung von NADH und NADPH gibt, die durch die Reaktion der Dehydrogenase im Fall (2) gebildet werden, sind die folgenden im Hinblick auf Einfachheit und Preisgünstigkeit durchgeführt worden: (a) ein Verfahren, in dem die Absorbanz bei 340 nm einer Maximum-Absorptionswellenlänge von NADH und NADPH direkt gemessen wird; (b) ein Verfahren, in dem man in einer Probe Diaphorase auf NADH oder NADPH in Anwesenheit eines Tetrazohumsalzes einwirken läßt, um ein Diformazan zu bilden, das kolorimetrisch gemessen wird; und (c) ein Verfahren, in dem NADH oder NADPH speziell mit NAD(P)H-Oxidase oxidiert wird, wie in der folgenden Reaktionsformel gezeigt, um die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid zu messen.
Das Verfahren (a) ist nicht ausreichend empfindlich, wenn man es für die Messung von Spurenkomponenten in einer Körperflüssigkeitsprobe verwendet, da sowohl NADH als auch NADPH einen molekularen Extinktionskoeffizienten von nur etwa 6200 aufweisen. Das Verfahren (b) weist den Nachteil auf, daß das gebildete Formazan sich schlecht in Wasser löst, was eine Verunreinigung in Zellen verursacht.
Das Verfahren (c) kann unter Verwendung des farbentwickelnden Reagenz der oxidativen Kupplungsreaktion durchgeführt werden, beispielsweise wie in den japanischen Patenten Nr. Sho 63 (A.D. 1988) - 44882(B) und Hei 1 (A.D. 1989) - 257499(A) offenbart. Jedoch ist jedes dieser Verfahren, wie es in den japanischen Amtsblättern offenbart ist, in dem Fall nicht ausreichend, in dem NADH oder NADPH aus den unten aufgeführten Gründen mit hoher Genauigkeit gemessen. werden sollte.
Zum Messen des in einer Probe erzeugten Wasserstoffperoxids mit hoher Genauigkeit ist es vorzuziehen, gleichzeitig mit der Bildung von Wasserstoffperoxid durch die Einwirkung von NAD(P)H-Oxidase eine chromogene Reaktion durchzuführen, da Wasserstoffperoxid nicht sehr stabil ist. Ein derartiges Induktionsverf ahren ist besonders wirksam, wenn die Konzentration der zu messenden Substanz in der Probe gering ist. Jedoch machen die in den Amtsblättern veröffentlichten Verfahren keine Anwendung eines derartigen Induktionsverf ahrens möglich. Das heißt, gemäß den in den Amtsblättern gegebenen Veröffentlichungen werden 4-AA und Phenol oder ein Anilin-Derivat als das farbentwickelnde Reagenz der oxidativen Kupplungsreaktion verwendet, aber mit dieser Kombination wird die farbentwickelnde Substanz durch NADH oder. NADPH in einer Probenlösung reduziert und entwickelt keinerlei Farbe, und demgemäß sollte eine Farbreaktion durchgeführt werden, nachdem das NADH oder NADPH, das durch die Enzymreaktion gebildet wird, vollständig durch NAD(P)H-Oxidase erschöpft ist. Mit anderen Worten ist jedes der Verfahren, wie es in den Amtsblättern veröffentlicht ist, ein 2-Stufen-Verfahren und kann deshalb nicht als ein Verfahren mit hoher Genauigkeit angesehen werden, da die Möglichkeit besteht, daß mindestens ein Teil des durch die NAD(P)H- Oxidasereaktion gebildeten Wasserstoffperoxids zersetzt wird, indem es mit einer oder mehreren gewissen Komponenten in der Körperflüssigkeitsprobe, wie Serum, Urin oder dergleichen, reagiert.
Ein Hauptziel der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, um NADH oder NADPH mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit zu messen.
Ein zusätzliches Ziel der Erfindung ist es, ein Meßverfahren für NADH oder NADPH mit einer automatischen Analysiervorrichtung bereitzustellen.
Die Erfinder haben mit Energie geforscht und untersucht, um die Probleme im Stand der Technik bei der Messung von NADH und NADPH, die NAD(P)H-Oxidase verwendet, zu lösen, um schließlich die Erfindung zu machen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung von NADH oder NADPH, das dadurch gekennzeichnet ist, daß, wenn NADH oder NADPH gemessen wird, die Schritte zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid mit der Einwirkung von NAD(P)H-Oxidase und des Messens des Wasserstoffperoxids durch eine chromogene Reaktion gleichzeitig durchgeführt werden. Wenn beide Schritte gleichzeitig stattfinden, wird die Meßgenauigkeit von Wasserstoffperoxid gesteigert, was die Messung von NADH und NADPH mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit möglich macht.
Wenn die Messung gemäß der Erfindung durchgeführt wird, gibt es keine Beschränkung der Art der NAD(P)H-Oxidase. Sie sollte NADH oder NADPH spezifisch oxidieren, um Wasserstoffperoxid zu erzeugen. Als Kupplungsmittel für das farbentwickelnde Reagenz wird nicht 4-AA (das in breitem Umfang verwendet wird), sondern MBTH oder dessen Derivat verwendet, da das letztgenannte durch die Reduktionswirkung auf Grund von NADH und NAD(P)H nicht beeinflußt wird. Als MBTH-Derivate sind diejenigen, in die eine Sulfonylgruppe, Alkylgruppe, ein Halogen, eine Nitrogruppe, carboxylgruppe oder dergleichen als Substituent eingeführt ist, vorzuziehen.
Die Erfinder haben Messungen von NADH und NADPH gemäß dem Verfahren der Erfindung, wie oben aufgeführt, durchgeführt, um herauszufinden, daß eine Kalibrierungskurve keine lineare Kurve, sondern fast ein Kurve zweiter Ordnung darstellt. Diese pHänomen kann bei dem üblichen 2-stufigen Verfahren unter Verwendung von NAD(P)H-Oxidase nicht gefunden werden. Deshalb haben die Erfinder weitere Untersuchungen vorgenommen, um diese Tatsache zu klären und herauszufinden, daß NAD(P)H nicht nur Wasserstoffperoxid, sondern auch ein Anion von Superoxid bildet. Das heißt, die Kalibrierungskurve kann linear gemacht werden, indem man Superoxiddismutase (nachstehend als "SOD" bezeichnet) zur Koexistenz im Reaktionssystem dazugibt, wenn das Verfahren gemäß der Erfindung durchgeführt wird.
Die SOD ist ein Enzym, das katalytisch in der nachstehend gezeigten Reaktion wirkt und eine Wirkung zur Überführung des Superoxidanions in Wasserstoffperoxid aufweist. Jedoch ist die Reaktion als nichtenzymatische Reaktion auch relativ rasch. Es gibt keine Beschränkung bezüglich der Art von SOD, und diejenigen, die von Rindererythrozyten und dergleichen abstammen, können verwendet werden. Im allgemeinen zeigt SOD eine hinreichende Aktivität im pH-Bereich von ungefähr 5 - 10 und eine gute Stabilität und ist demgemäß zur Verwendung im Verfahren der Erfindung geeignet. Es ist vorzuziehen, eine Konzentration an SOD im Bereich von 10 - 200 mg/l in der Reaktionslösung festzusetzen.
Die Erfindung wird nun durch Vergleich derselben mit dem herkömmlichen Verfahren erklärt. Wenn Serum als Probe zur Messung von beispielsweise 3-Hydroxybuttersäure gesammelt wird, werden in beiden Verfahren die folgenden 3 Reaktionen verwendet.
Gemäß dem herkömmlichen Verfahren wird die Farbreaktion (3) durchgeführt, nachdem zuvor die Reaktionen (1) und (2) beendet sind. Deshalb besteht die Möglichkeit, daß ein Teil des in der Reaktion (2) gebildeten Wasserstoffperoxids mit einer oder mehreren koexistierenden Substanzen in der Serumprobe reagiert, wodurch eine Zersetzung desselben verursacht wird. Dahingegen verlaufen nach dem Verfahren der Erfindung die Reaktionen (1), (2) und (3) gleichzeitig, so daß Wasserstoffperoxid, nachfolgend NADPH oder NADPH und weiter 3-Hydroxybuttersäure mit hoher Genauigkeit gemessen werden können. Dieses Verfahren gemäß der Erfindung entwickelt seine Wirksamkeit, wenn die zu messende Substanz eine extrem kleine Konzentration aufweist. Da ein Einstufen-Verfahren für das Verfahren der Erfindung verwendet wird, ist das Verfahren einfach. Es verringert bemerkenswert die Zeitspanne, die für die Messung erforderlich ist, und kann auf eine in breitem Umfang verwendete automatische Analysiervorrichtung angewendet werden, um die Proben in großer Zahl zu behandeln.
Jedes der Reagenzien, das für das Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann in Form einer Lösung, eines Pulvers oder dergleichen, das durch Lyophilisierung hergestellt ist, vorliegen. Da das Verfahren der Erfindung nur ein Einstufen-Verfahren verwendet, können alle Reagenzien in einem absorbierenden Träger, wie einem Filterpapier, adsorbiert werden, und der Träger wird getrocknet, um ein Teststück herzustellen.
Die Erfindung wird nun in mehr Einzelheit und konkret mit Bezug auf Testbeispiele und ein Meßbeispiel erklärt, das sich auf Zeichnungen bezieht, worin
Fig. 1 eine graphische Darstellung ist, die eine Beziehung zwischen einer Konzentration von NADH und der Absorbanz zeigt, wenn SOD gleichzeitig vorliegt oder nicht; und
Fig. 2 eine graphische Darstellung einer Standard-Kalibrierungskurve für die Messung von 3-Hydroxybuttersäure gemäß dem Verfahren der Erfindung ist.

Testbeispiel 1

(A) Gegenstand

Unter den Oxidasen befinden sich diejenigen, die ein Superoxidanion erzeugen, beispielsweise durch Xanthinoxidase verkörpert. Deshalb wird, wenn NAD(P)H-Oxidase und NADH in Anwesenheit von Nitrotetrazolium-Blau umgesetzt werden, die Erzeugung von Diformazan gemessen, um zu überprüfen, ob NAD(P)H-Oxidase die Fähigkeit aufweist, ein Superoxidanion zu erzeugen oder nicht.
(B) Reagenzien
a) Reagenz 1
NADH 200 µM
Phosphatpuffer (pH 7,5) 50 mM
b) Reagenz 2
FAD 0,1 mM
Phosphatpuffer (pH 7,0) 50 mM
FAD: Flavinadenindinucleotid
c) Reagenz 3
Nitrotetrazolium-Blau 1,2 mM
NAD(P)H-Oxidase 2300 E/l
Phosphatpuffer 50 mM
(C) Verfahrensweisen
Zum Reagenz 1 (40 µl) wurde das Reagenz 2 (700 µl) gegeben und damit gemischt, und die Mischung wurde 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Zu der resultierenden Lösung wurde das Reagenz 3 (100 µl) gegeben, um 5 Minuten bei 37ºC eine Reaktion zu veranlassen, um die Absorbanz bei 550 nm zu messen. Die Absorbanz betrug 0,096, wenn eine Kompensation mit dem Ergebnis einer anderen Messung bei einer Kontrolle durchgeführt wurde, die ähnlich zu dem obigen, aber unter Verwendung der Phosphatpufferlösung allein anstelle des Reagenz 1 durchgeführt wurde. Weiter wurde ein ähnliches Verfahren durchgeführt, indem dem Reagenz 2 20 mg/l SOD zugesetzt wurden, um herauszufinden, daß die Absorbanz 0,013 betrug.
Aus diesen Tatsachen wurde bestätigt, daß NAD(P)H-Oxidase die Fähigkeit besitzt, nicht nur Wasserstoffperoxid, sondern auch das Superoxidanion zu erzeugen.

Testbeispiel 2

(Beziehung zwischen dem Superoxidanion und einer Kalibrierungskurve)

(A) Reagenzien
a) Reagenz 1
MBTH 0,5 mM
SOD 20 mg/l
FAD 0,1 mM
Phosphatpuffer (pH 7,0) 50 mM
b) Reagenz 2
N-Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylanilin 5,0 mM
Peroxidase 72000 E/l
NAD(P)H-Oxidase 2300 E/l
Phosphatpuffer (pH 7,0) 50 mM
(B) Verfahrensweisen und Ergebnisse
Das Reagenz 1 (350 µl) wurde zu 20 µl NADH-Lösung (0, 20, 50, 100 oder 200 mM) gegeben und 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Zu der resultierenden Lösung wurde das Reagenz 2 (50 µl) gegeben, um bei 37ºC eine Reaktion zu veranlassen, um eine Veränderung in der Absorbanz pro 1 Minute bei 570 nm zu messen. Weiter wurden ähnliche Verfahrensweisen unter Verwendung eines dem Reagenz 1 ähnlichen Reagenz wiederholt, das aber kein SOD enthielt, um eine Beziehung zwischen der Veränderung in der Absorbanz und der Konzentration von NADH auf Grund der Anwesenheit oder Abwesenheit von SOD zu überprüfen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Wie daraus offensichtlich ersichtlich ist, kann keine lineare Beziehung zwischen der Konzentration von NADH und der Veränderung in der Absorbanz erkannt werden, wenn SOD nicht enthalten ist, aber die Beziehung wird linear, wenn man SOD zusetzt, so daß es ebenfalls im Reaktionssystem vorhanden ist.

Meßbeispiel (Messung von 3-Hydroxybuttersäure)

(A) Reagenzien
a) Reagenz 1
NAD&spplus; 0,7 mM
MBTH 0,5 mM
SOD 20 mg/l
FAD 0,1 mM
Phosphatpuffer (pH 7,0) 50 mM
b) Reagenz 2
3-Hydroxybutyratdehydrogenase 3320 E/l
N-Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylanilin 50 mM
Peroxidase 72000 E/l
NAD (P) H-Oxidase 2300 E/l
Phosphatpuffer (pH 7,0) 50 mM

(B) Standard-Kalibrierungskurve

Das Reagenz 1 (350 µl) wurde zu jeder von verschiedenen Standard-3- Hydroxybuttersäure-Lösungen (20 µMol) mit bekannter Konzentration gegeben, um 5 Minuten bei 37ºC zu inkubieren. Zu der Lösung wurde das Reagenz 2 (50 µl) gegeben, um eine Reaktion bei 37ºC zu veranlassen, um eine Veränderung der Absorbanz pro 1 Minute bei 570 nm zu messen und eine Standard- Kalibrierungskurve aus der Beziehung zwischen der Veränderung der Absorbanz und der Konzentration von 3-Hydroxybuttersäure in deren Standardlösung zu erstellen. Die Standard-Kalibrierungskurve ist in Fig. 2 gezeigt.

(C) Messung von 3-Hydroxybuttersäure in Serum

Es wurden Verfahren ähnlich denjenigen zur Erstellung der Standard- Kalibrierungskurve, aber unter Verwendung einer Serumprobe anstelle der Standard-3-Hydroxybuttersäure-Lösung durchgeführt, um eine Veränderung der Absorbanz zu messen, und das Ausmaß der Veränderung wurde mit der in Fig. 2 dargestellten Standard-Kalibrierungskurve verglichen, um die Konzentration von 3-Hydroxybuttersäure in der Serumprobe zu bestimmen.
Die Messung gemäß dem obigen Verfahren wurde 10 mal wiederholt, wodurch man fand, daß das Verfahren eine gute Reproduzierbarkeit zeigt, da die Standard-Abweichung 0,50 beträgt und der Variationskoeffizient in der Nähe von 20 µM 1,93% beträgt.
Das Verfahren der Erfindung kann für die Messung von verschiedenen biochemischen Substanzen und der Aktivität von Enzymen in einer Körperflüssigkeit verwendet werden, wie nachstehend beispielhaft aufgeführt.

Claims

1. Verfahren zum Messen von NADH oder NADPH, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn NADH oder NADPH gemessen wird, Schritte der Erzeugung von Wasserstoffperoxid mittels einer Einwirkung von NAD(P)H-Oxidase und des Messens des Wasserstoffperoxids durch eine oxidative Kupplungsreaktion von chromogenen Reagenzien gleichzeitig durchgeführt werden, wobei die chromogenen Reagenzien eine Kombination von Peroxidase, einer Substanz, die aus Anilin und dessen Derivaten ausgewählt ist, und einer Substanz ist, die aus 3-Methyl-2- benzothiazolinonhydrazon und dessen Derivaten ausgewählt ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem ein Superoxiddismutase- Enzym im Reaktionssystem mit vorliegt.