DE2833612A1 - Mittel und verfahren zur bestimmung von wasserstoffperoxyd - Google Patents

Mittel und verfahren zur bestimmung von wasserstoffperoxyd

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Description

F1ATtNTANWALTF O Π O O- C 1 O
/θ JJQ ti
PROF. DR. DR. J. REtTSTOTTER
DR.-ING. WOLFRAM BUNTE
DR. WERNER KINZEBACH
IIAlJEf?STnA'-.SE 22. D-HOÜU MtINCKEN -ΛΟ ■ I'DTNRUF ΙΟΪΙ9) 37 «S Θ3 · TELEX SPtSZOO ISAR D POSTANSCHRIFT: POSTFACH TIlO. D-OOOO MÜNCHEN 43
München, den 28. Juli T978 ' M/19 192
WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. 10, Doshomachi-3-chome, Higash.i-ku, Osaka, Japan
Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd
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Die kolorimetrische Bestimmung von Wasserstoffperoxyd bei klinischen Untersuchungen., Nahrungsmittelzusatz'-Analysen und allgemeinen Analysen kann genau, rasch und wirtschaftlich durchgeführt werden, wenn man ein Mittel zur Herstellung von Farbbildungsreagentien verwendet, enthaltend 4—Aminoantipyrin, ein N-substituiertes 3-Alkylanilin und ein Wasserstoffperoxyd aktivierendes Mittel, wie Peroxidase. Dieses Mittel bildet ein färbendes Material mit ausgezeichneter Senstitivität und Farbstabilität, wenn es in Kontakt mit Wasserstoffperoxyd gebracht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Mittel zur Herstellung von Farbbildungsreagentien bei der Bestimmung j von Wasserstoffperoxyd und ein Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd unter Anwendung dieses Mittels.
In letzter Zeit wurden bei klinischen Untersuchungen ι aufgrund der höchst geschätzten Spezifizität enzymatische Analysen in immer größerem Ausmaß angewandt.
Bei Verfahren zur Bestimmung von Glucose, Harnsäure, Cholesterin, Cholinesterase, Phospholipid, Kreatin oder j Kreatinin in Körperfluiden, verwendet man erfolgreich Ver- ; fahren zur Bestimmung der gewünschten Substanz, indem man ■ das Wasserstoffperoxyd bestimmt, das beispielsweise erhalten ' wird, indem man deren Oxydationsenzym oder ein Oxydationsenzym auf das im Verlaufe der Enzymreaktion erhaltene Produkt einwirken läßt.
! Diese Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd können ■'" grob in die folgenden Verfahren eingeteilt werden:
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(Ia) ein Verfahren, bei dem man ein Chromogen durch enzymatische Einwirkung von Peroxidase in ein durch Oxydation farbentwickeltes Material überführt und die optische ; Absorption des farbentwickelten Materials mißt,
(Ib) ein Verfahren, bei dem man ein oder zwei Chromogene durch j enzymatische Einwirkung von Peroxidase oxydativ konden- ' siert, wobei man ein farbentwickeltes Material erhält, ι und die optische Absorption des farbentwickelten Materials mißt,
(II) ein Verfahren, bei dem man entweder Catalase in Gegenwart eines Alkohols umsetzt und den erhaltenen Aldehyd in ein Farbentwicklungssystem einführt, oder Aldehyddehydrogenase in Gegenwart von NAD umsetzt und die Menge : an erhaltenem NADH mißt.
Beim Verfahren Ia wurden als Chromogene o-Tolidin, 2,7-Diaminofluoren, Ν,Ν-Dimethyl-p-phenylendiamin, o-Dianisidin, o-Aminophenol und dergleichen verwendet.
Beim Verfahren Ib wurden als Chromogene eine Kombination von j 4-Aminoantipyrin mit Phenol oder Ν,Ν-Dimethylanilin oder j Ν,Ν-Diäthylanilin,
eine Kombination von 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon I
j mit o-Tolidin oder Ν,Ν-Dimethylanilin oder N,N-D.iäthylanilin,
I oder 4-Methoxy-1-naphthol oder dessen Derivaten, welche ; ein Dimeres bilden können, verwendet. Diese Chromogene werden . allein oder in Kombination zur Herstellung von Farbbildungs-
! reagentien zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd verwendet, ι
Andererseits variiert der optimale Aktivierungs-pH des : Oxydationsenzyms, welches die gewünschte Substanz oxydativ zersetzt, über einen weiten Bereich, im allgemeinen von etwa pH 5 bis 9. Wenn der optimale Aktivierungs-pH-Wert
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mit dem optimalen pH-Wert für die Farbbildunqsreaktion nicht identisch oder diesem nicht sehr nahe ist, sind jodocli di« Genauigkeit der Messung, die einfache und rasche Durchführung und die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens nicht mehr gewährleistet»
Beispielsweise ist der optimale Aktivierungs pH-Wert von Uricase, welche von Hefe abgeleitet und ein Oxydationsenzym für Harnsäure ist, ein pH-Wert von 7,5 bis 8,5, aber es gibt kein geeignetes Farbbildungsreagenz, welches bei diesem pH-Wert die nötige Empfindlichkeit hat und die Farbstabilität aufrechterhalten kann. Deshalb wird die Messung von Harnsäure so vorgenommen, daß man entweder die Uricase-Reaktion und die Oxydationsreaktion oder die oxydative Kondensationsreaktion getrennt bei verschiedenen pH-Werten durchführt oder indem man eine große Menge Uricase zur Messung bei einem niedrigen pH-Wert oder eine große Menge der Probe und eines färb— bildenden Reagenzes mit geringer Empfindlichkeit und optimaler Farbentwicklung bei pH 7 bis 8 durchführt und mißt. Diese Verfahren sind jedoch nicht so genau und wirtschaftlieh.
Um die Nachteile der herkömmlichen Verfahren zu beseitigen, wurden Untersuchungen hinsichtlich der Farbbildungreagentien zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd durchgeführt, wobei ein Wasserstoffperoxydaktivierungsmittel als Katalysator oder Reaktionsteilnehmer verwendet wurde. Dabei wurde gefunden, daß wenn man spezielle N-substituierte 3-Alky!aniline als Farbbildungsmittel verwendete, welche mit 4-Äminoantipyrin, das sich als am verläßlichsten erwiesen hat, kondensiert wurden, das erhaltene Farbbildungsreagens über einen extrem weiten pH-Bereich ausgezeichnet empfindlich und farbstabil war. Die Stabilität der Reagentien als solche ist ebenfalls aus-: gezeichnet. :
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Die vorliegende Erfindung schafft somit ein Mittel zur Herstellung von Farbbildungsreagentien zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd, enthaltend:
4-Aminoantipyrin,
ein N-substituiertes 3-Alkylanilin der allgemeinen Formel I:
(D
IT
worin R und R unabhängig voneinander eine Niedrigalkylgruppe oder eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeuten und R für eine Niedrigalkylgruppe steht,
ein Wasserstoffperoxyd-Aktivierungsmittel.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Wasserstoffperoxyd unter Verwendung dieses Mittels, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
4-Aminoantipyrin in Kombination mit einem N-substituierten : 3-Alkylanilin der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1 in [ Gegenwart eines Wasserstoffperoxyd-Aktivierungsmittels verwendet, wobei sich in Kontakt mit Wasserstoffperoxyd ein färbendes J Material bildet, und man die Menge des erhaltenen farbbildenden ,; Materials mißt.
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Bei den N-substituierten 3-Alkylanilinen der allgemeinen Formel I umfaßt die Niedrigalkylgruppe eine Alkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 5 C-Atomen, wie Methyl, Äthyl, Propyl,
Isopropyl, etc.
Beispiele für die Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 5 C-Atomen sind Hydroxymethyl, Hydroxyäthyl, Hydroxypropyl und dergleichen.
Beispiele für N-substituierte 3-Alkylaniline der allgemeinen Formel I sind N-Methyl-N-hydroxymethyl-3-methylanilin, N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin, N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-äthylanilin, N-Methyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin, N-Methyl-N-hydroxypropyl-3-methylanilin, N-Äthyl-N-hydroxypropyl-3-methylanilin, N-Methyl-N-hydroxyäthyl-3-äthylanilin, N-Propyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin, N-Methy1-N-hydroxyäthyl-3-propylanilin, Ν,Ν-bis(ß-Hydroxyäthyl)-3-methyl-anilin, N,N-bis(ß-Hydroxypropyl)-3-methylanilin, N,N-Dimethyl-3-methylanilin, N,N-Dimethyl-3-äthylanilin, N,N-Dimethyl-3-propylanilin, N,N-Diäthyl-3-methylanilin, N,N-Diäthyl-3-äthylanilin, j N,N-Dipropyl-3-methylanilin und dergleichen. Alle der wie oben definierten N-substituierten 3-Alkylaniline der allgemeinen Formel I ergeben eine ausgezeichnete Empfindlichkeit und Farbstabilität. Insbesondere N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin ergibt die beste Empfindlichkeit.
Ist jedoch die 2-Stellung(ortho-Stellung) oder 4-Stellung (para-Steilung) von N-substituierten Anilinen mit einer Niedrigalkylgruppe substituiert, so können hinsichlich Empfindlichkeit und Farbstabilität keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt werden.
Die N-substituierten 3-Alkylaniline der allgemeinen Formel I werden im allgemeinen in einer Menge von etwa 1 bis 20 Mol pro Mol 4-Aminoantipyrin eingesetzt.
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Zu don crfindunysgcmaß verwendeten Wasserstoffperoxydaktivierungsmitteln gehört nicht nur Peroxidase sondern auch Wolframsäure und deren Salze, Molybdänsäure und deren Salze, Mischungen eines Jodids und einer dieser anorganischen Verbindungen, Eisen-, Kupfer-, Cer-Ionen und Vanadinsäure und dergleichen. Üblicherweise verwendet man eine katalytische Menge des Wasserstoffperoxyd-Aktivierungsmittels.
Das N-substiuierte 3-Alkylanilin der allgemeinen Formel I, welches erfindungsgemäß ein Farbbildungsmittel darstellt, wird in Kontakt mit H_0_ oxydativ mit 4-Aminoantipyrin kondensiert, wobei sich ein Indophenol-Farbstoff der allgemeinen Formel II, wie untenstehend gezeigt, ergibt, welcher eine maximale Absorption nahe A= 54 5 nm hat.
Wasserstoffperoxydaktivierungsmittel
CH
(H)
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Verwendet man das erfindungsgemäße Mittel, so erreicht man bei Kontakt mit Wasserstoffperoxyd eine bemerkenswert gute Empfindlichkeit und Farbstabilität über einen weiten pH-Bereich, wie nachstehend in Tabelle I gezeigt, im Gegensatz zu der bekannten Anwendung von 4-Aminoantipyrin zusammen mit Phenol, wo die Farbentwicklung und die Farbstabilität auf den pH-Bereich von 7 bis 9 begrenzt sind und die bekannte gemeinsame Anwendung von 4-Aminoantipyrin und Dimethylanilin oder Diäthylanilin, wo die Farbentwicklung und Farbstabilität auf den pH-Bereieh von pH 4 bis 6 begrenzt sind.
Tabelle I
Farb-^^11^^-----^^^^
bildungsmittel ~~"~—--^_^^ ......
( Λ- max) ^~^~-—^.		 N-Äthyl-N-
hydroxyäthyl-		 PH 96 4 5 6 7 8 9
3-methylanilin
(545 nraj		 Empfind
lichkeit		 98 98 100 100 100 99 97
erfindungs
gemäße Farb
bildungs
mittel		 K,N-Dimethyl-
3-methylanilin		 Farb
stabilität		 93 99 99 99 98 97 81
(545 nm) Empfind
lichkeit		 92 95 9& 96 95 90 a?
N, N-bis- (ß-
Eydroxyäthyi)-		 Farb
stabilität		 l» 99 100 100 98 92 78
3-äthylanilin
(545 nm)		 Empfind
lichkeit		 82 39 39 41 41 41 36
Phenol Farb-
stabilität		 fr 95 99 100 100 97 82 .
herkönmliche
Farbbildungs-
iaittel		 (505 nm) Empfind
lichkeit		 21 22 31 40 42 42 41
Ν,Ν-Dimethyl-
anilin		 Farb-
;■ Stabilität		 79 37 63 82 98 98 96
(545 nm) Empfind
lichkeit		 95 85 85 84 80 71 56
Farb-
Stabilität		 too TOO 98 82 63 45
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In Tabelle I stehen die In den Zeilen für Farbstabilität angegebenen Werte für das Absorptionsverhältnis in Prozent nach 90 Minuten, bezogen auf die Absorption bei völliger Farbentwicklung (100 %} und die in den Zeilen für die Empfindlichkeit angegebenen Werte bedeuten das Absorptionsverhältnis in Prozent, bezogen auf die Absorption von N-iithyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin bei dem pH-Wert, bei dem sich die maximale Empfindlichkeit erreichen läßt (100 %).
In Tabelle I sind typische Beispiele für erfindungsgemäß verwendete Farbbildungsmittel aufgeführt, es ist jedoch selbstverständlich, daß die gleichen ausgezeichneten Ergebnisse auch mit den anderen N-substituierten 3-Alkylanilinen der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1 erzielt werden können.
Unter Verwendung der nachstehend aufgeführten. Proben und Farbbildungsreagenzlösungen wird die Absorption wie folgt gemessen, wobei man dann zu den Werten der Tabelle I kommt:
Meßverfahren:
Eine Mischung, welche 50 μΐ einer Probe und 5 ml einer Farbbildungsreagenzlösung enthält, läßt man bei Raumtemperatur 5 Minuten stehen und mißt dann die Absorption bei jeder maximalen Absorptionswellenlänge ( λ max).
Probe:
Wasserstoffperoxydlösung: H„O„ 5 mg/dl Farbbildungsreagenzlösung:
Zu einer Pufferlösung, welche erhalten wurde, indem man wie in Tabelle II gezeigt, für jeden pH-Wert einen Puffer ver- j wendete, gibt man 2000 Einheiten Peroxidase, 0,5 mMol· 4-Amino- ι antipyrin und 5 mMol eines Farbbildungsmittels wie in Tabelle I
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aufgeführt und stellt das Gesamtvolumen auf 1 1 ein.
Tabelle II
pH 3 4 5 6 7
Puffer Acetat (0,1 m) Phosphat (0,1 m) Borat (0,1 m)
Wie oben bereits angegeben, ist der optimale pH-Bereich für die Farbentwicklung des Mittels, d.h. der zu dem erfindungsgemäßen Mittel kombinierten Farbbildungsreagentien,so breit, daß der pH-Bereich nur nach dem anderen Faktor, beispielsweise dem optimalen Aktivierungs-pH eines zu verwendenden Oxydationsenzyms gewählt werden kann. Dies bedeutet beispielsweise, daß man bei Bestimmung von Glucose im Serum, wobei man Glucoseoxydase verwendet, welche einen optimalen Aktivierungs pH-Wert bei pH 5 hat, einen pH-Wert von 5 verwenden kann; bestimmt man Cholesterin im Serum unter Verwendung von Cholesterinoxidase mit einem optimalen Aktivierungs-pH-Wert von etwa 5,8, so kann man etwa pH 6 verwenden und im Fall der Bestimmung von Harnsäure im Serum durch üricase mit einem optimalen AktivierungspH-Wert bei pH 7,5 bis 8,5, kann man etwa pH 8 verwenden. Die bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd erhaltenen Ergebnisse sind exakter, rascher und wirtschaftlicher. '■
j Das Farbenwicklungsmittel mit der höchsten Empfindlichkeit j is N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin. Die Anwendung einer Kombination von N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin und 4-Aminoantipyrin ergibt eine etwa 2,5 mal höhere Empfindlichkeit als die Anwendung einer Kombination von Phenol und 4-Aminoantipyrin, wie dies auch in Tabelle I gezeigt ist.
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Derartig hochempfindliche Farbbildungsmittel, wie N-Athyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin und N,N-Dimethyl-3-methylanilin werden vorzugsweise zur Bestimmung von Harnsäure, Kreatinin, i.'reiem Cholesterin und dergleichen angewandt, welche im
Serum nur in sehr geringen Mengen anwesend sind.
Diejenigen N-substituicrten 3-Alkylaniline der allgemeinen Formel I, welche eine relativ geringe Empfindlichkeit aufweisen, wie N,N-Dihydroxyäthyl-3-methylanilin, werden vorzugsweise zur Bestimmung von Glucose, Gesamtcholesterin,
Cholinesterase, Phospholipiden und der gleichen angewandt, welche in großen Mengen im Serum enthalten sind.
Die N-substituierten 3-Alkylaniline der allgemeinen Formel I sind in Form einer Lösung bei einem pH von~6 oder darunter sehr stabil, sie können jedoch, falls erforderlich auch in
Form eines Salzes, beispielsweises eines Mineralsalzes, wie Hydrochlorids, Sulfats, etc. oder eines organischen Säuresalzes eingesetzt werden, nötigenfalls können sie auch als Pulver, oder in Form eines zu Tabletten bearbeiteten Feststoffs, als gefriergetrocknete Produkte und dergleichen, oder zusammen mit anderen Bestandteilen, falls nötig, verwendet werden.
Werden die erfindungsgemäßen Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd verwendet, so kann das Verfahren in einem
pH-Bereich von pH 3 bis 9 durchgeführt werden. Darüberhinaus können die erfindungsgemäßen Mittel nicht nur für klinische Untersuchungen, sondern auch für Analysen auf Nahrungsmittelzusätze und für Analysen im allgemeinen verwendet werden.
Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, sie jedoch nicht einschränken.
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Beispiel 1
Bestimmung von Harnsäure
In 100 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 8,0) löst man 10 Einheiten Uricase, 100 Einheiten Peroxydase, 30 mg 4-Arainoantipyrin und 100 mg N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin, wobei man eine Farbbildungsreagenzlösung erhält.
In ein Teströhrchen gibt man 100 μΐ Serum und 3 ml der Farbbildungsreagenzlösung und läßt bei 3? 0C 10 Minuten stehen. Danach werden die Absorption bei 546 nm und 600 nm sowohl bei der Probe als auch einem Reagens allein gemessen, so daß man die Differenz der Absorptionen erhält. Die Harnsäurekonzentration im Serum wird mit Hilfe einer Kalibrierungskurve berechnet, welche zuvor nach dem herkömmlichen. Verfahren aufgestellt wurde.
: Beispiel
Bestimmung von Glucose
In 100 ml einer 0r1 m Acetatpufferlösung (pH 5,0) löst man 400 Einheiten Glucoseoxydase, 200 Einheiten Peroxydase, 30 mg 4-Aminoantipyrin und 100 mg N,N-bistß-Hydroxyäthyl)-3-methylanilin, wobei man eine Farbbildungsreagenzlösung erhält.
In ein Teströhrchen gibt man 20 μΐ Serum und 3 ml der Farbbildungsreagenzlösung und läßt 10 Minuten bei 37 0C stehen. Danach wird die Absorption bei 545 nm sowohl bei der Probe als auch bei der Reagenzlösung allein gemessen, um die Absorptionsdifferenz zu erhalten. Eine Glucosekonzen-
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LraLion im Serum wird mit Hilfe einer Kalibirierungskurve berechnet, welche zuvor nach herkömmlichen Verfahren aufgestellt wurde.
Beispiel 3
Bestimmung von Gesamtcholesterin
In 100 ml 0,2 m Phosphatpufferlösung (pH 5,8), löst man 15 Einheiten Cholesterinoxydase, 20 Einheiten Cholesterinesterhydrase, 100 Einheiten Peroxydase, 10 mg 4-Aminoantipyrin, 100 mg N,N-Dimethyl-3-methylanilin und 150 mg Triton X-100 (Handelsbezeichnung von Röhm&Haas Co.), wobei man eine Farbbildungsreagenzlösung erhält.
In ein Teströhrchen gibt man 10 μΐ Serum und 3 ml der Farbbildungsreagenzlösung und läßt 10 Minuten bei 37 C stehen. Anschließend wird die Absorption bei 545 nm sowohl bei der Probe als auch der Reaktionslösung allein gemessen und die Absorbtionsdifferenz erhalten. Die Gesamtcholesterinkonzentration im Serum wird mit Hilfe einer Kalibirierungskurve berechnet, welche zuvor auf herkömmliche Weise erhalten wurde.
Beispiel
Bestimmung von Gesamtcholesterin
In 100 ml 0,2 m Phosphatpufferlösung (pH 5,8) löst man 15 Einheiten Cholesterinoxydase, 20 Einheiten Cholesterinesterhydrase, 0,5 g Natriumwolframat, 1,0 g Natriumiodid, 10 mg 4-Aminoantipyrin, 100 mg N,N-Dimethyl-3-methylanilin und 150 mg Triton X-100, wobei man eine Farbbildungsreagenzlösung erhält.
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In ein Teströhrchen gibt man 10 μΐ Serum und 3 ml der Farbbildungsreagenzlösung und läßt 10 Minuten bei 37 0C stehen. Danach wird die Absorption bei 54 5 nm sowohl bei der Probe als auch bei der Reagenzlösung allein gemessen und die
Absorptionsdifferenz erhalten. Die Gesamtcholesterinkonzentration im Serum wird mit Hilfe einer Kalibrierungskurve
berechnet, welche auf herkömmliche Weise erstellt wurde.
Die Empfindlichkeit und Farbstabilität bei den Beispielen 1 bis 4 sind wie in Tabelle III aufgezeigt.
Tabelle
III
Beisp. untersuchte Empfindlichkeit der
Substanz „, , ,,.. Nr. , . Standardlosung
Farbstabilität
Harnsäure
(8,0)
Standardlsg.: Harnsäure
10 mg/dl Empfindlichk.: 0,135
(λ 546 nm/600 nm)
98 % (90 Min/10 Min)
Glucose
(5,0)
Standardlsg.: Glucose
200 mg/dl
Empfindlichk.: 0,403
(λ 545 nm)
100 % (90 Min/10 Min)
Gesamt- Standardlgs.: Cholsterin
cholesterin 200 mg/dl
(5,8) Empfindlichk.: 0,227
(X 545 nm)
100 % (90 Min/10 Min)
Gesamt- Standardlsg.: Cholesterin
cholesterin . 200 mg/dl
(5,8) Empfindlichk.: 0,227
(^. 545 nm)
100 % (90 Min/10 Min)
Anmerkung: Die Absorptionen wurden mit Hilfe eines Hitachi Typ 101 Spektrophotometers gemessen.
809886/1024

Claims (7)

M/19 192 - A - Patentansprüche
1. Mittel zur Herstellung von Farbbildungsreagentien zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd, enthaltend
4-Aminoantipyrin,
ein N-substituiertes-3-Alkylanilin der allgemeinen Formel I:
(D
12
worin R und R unabhängig voneinander eine Niedrigalkylgruppe oder eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeuten und R für eine Niedrigalkylgruppe steht, und
ein Wasserstoffperoxyd-Aktivierungsmittel.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) R für eine Niedrigalkylgruppe
mit 1 bis 5 C-Atomen steht, R eine Hydroxyalkylgruppe
mit 1 bis 5 C-Atomen bedeutet und R3 für Methyl, Äthyl oder Propyl steht.
8098 86/102 4 ORIGINAL-INSPECTED
•a·
3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) R und R^ gleiche oder verschiedene Alkylgruppen mit 1 bis 5 C-Atomen bedeuten und R für Methyl, Äthyl oder Propyl steht.
4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in
1 2
der allgemeinen Formel (I) R und R gleiche oder verschiedene Hydroxyalkylgruppen mit 1 bis
5 C-Atomen bedeuten und R für Methyl, Äthyl oder Propyl steht.
Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das N-substituierte 3-Alkylanilin N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-methy!anilin ist.
6. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das ι N-substituierte 3-Alkylanilin N,N-Dimethyl-3-methylanilin j ist.
!
7. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das j N-substituierte 3-Alkylanilin N,N-bis( ß-Hydroxyäthyl)-j 3-äthylanilin ist.
8. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
, Wasserstoffperoxyd aktivierende Mittel Peroxydase ist.
Mittel nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasserstoffperoxyd aktivierende Mittel aus einer Mischung aus Jod und einer Verbindung ausgewählt unter Wolframsäure und deren Salzen oder Molybdänsäure und deren Salzen besteht.
809886/1024
Λ-
TO. Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd, dadurcit gekennzeichnet, daß man 4-Aminoantipyrin in Kombination mit einem N-substituierten 3-AlkyIanilin der allgemeinen Formel (I)
12
worin R und R unabhängig voneinander eine Biedrigalkyl-
gruppe oder eine Hydroxyalky!gruppe mit 1 bis 5 C-Atomen S χ
ι bedeuten und R für eine Niedrigalkylgruppe steht,
j -
in Gegenwart eines Wasserstoffperoxyd aktivierenden Mittels zui" Bildung eines färbenden Materials umsetzt.
809888/1024
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