DE2264847A1

DE2264847A1 - Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin

Info

Publication number: DE2264847A1
Application number: DE2264847*A
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr Rer Nat Beaucamp; Hans Ulrich Prof Dr Bergmeyer; Erich Bernt; Wolfgang Dr Phil Gruber; Alexander Dr Rer Nat Hagen; Gunter Lang; Peter Dr Rer Nat Roeschlau
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1972-05-17
Filing date: 1972-05-17
Publication date: 1975-05-28
Also published as: DE2224132B1; AT324580B; CH589295A5; FR2191743A5; DE2264847C2; DE2224132C2; DE2224132A1; GB1429525A; NL181282B; NL7306738A; BE799543A; AU5586173A; NL181282C

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Wftckmann,

Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN 2 2 6 A 8 4

POSTI-ACH 860 820 HKW MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

int.Nr. 1825 B I

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, 68 Mannheim, Sandhofer Str. 112-132

Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin

Ausscheidung aus Patent (Patentanmeld. P 22 24 132.3)

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatisehen Bestimmung von verestertem und freiem Cholesterin und ein Reagenz zur Durchführung dieses Verfahrens.

Die Bestimmung von Cholesterin hat für die medizinische Diagnostik eine erhebliche Bedeutung. Ein erhöhter Cholesterinspiegel im Blut ist ein wesentlicher Risikofaktor der Arteriosklerose. Bei hohen Cholesterinwerten, also Hypercholesterinämie, kommen Koronarinsuffizienz und Herzinfarkt häufiger vor als bei niedrigen Cholesterinwerten. Hypercholesterinämie begünstigt das Auftreten von Arteriosklerose und Koronarerkrankungen und muß daher frühzeitig erkannt werden, damit die Behandlung rechtzeitig beginnen kann. Erhöhte Cholesterinwerte finden sich häufig auch bei Diabetes mellitus, nephrotischem Syndrom, Hypothyreose und Leberkrankheiten, wie der biliären

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Cirrhose. Eine rasche und zuverlässig durchführbare Methode zur Bestimmung von Cholesterin hat daher große Bedeutung.

Die bekannten und brauchbaren Methoden zur Cholesterinbestimmung basieren auf der Reaktion nach Liebermann und Burchard. Freies und verestertes Cholesterin bilden danach mit Essigsäureanhydrid und konzentrierter Schwefelsäure blaugrüngefärbte Verbindungen, deren Farbintensität der Cholesterinkonzentration proportional ist und spektrometrisch gemessen wird. ,

Dieses bekannte Verfahren weist jedoch wesentliche Nachteile auf. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens liegt in seiner Unspezifität. Die Liebermann-Burchard-Reaktion stellt eine relativ unspezifische Steroidreaktion dar, die außer von Cholesterin auch von anderen Steroiden eingegangen wird. Da beispielsweise im Plasma noch 1 bis 3 % Dihydrocholesterol und 0,5 bis 1,4 $> Δ -Cholestenol neben anderen Steroiden vorhanden sind, ergibt sich ein unerwünscht großer Fehler. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß mit aggressiven und ätzenden Reagenzien gearbeitet werden muß.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen vollenzymatischen Verfahrens und eines Reagenzes zur Bestimmung von verestertem und freiem Cholesterin, welches die oben erwähnten Nachteile nicht aufweist und insbesondere absolut spezifisch für Cholesterin ist und keine aggressiven Reagenzien erfordert.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, welches darin besteht, daß man Cholesterin in wässrigem Medium mit Cholesterinoxydase inkubiert und entweder den Sauerstoffverbrauch oder gebilde-

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tes HpOp bzw. Cholestenon bestimmt, dann Cholesterinesterase zusetzt und anschließend das gebundene Cholesterin bestimmt.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur vollenzymatischen Umsetzung von verestertem und von freiem Cholesterin und ermöglicht damit die Bestimmung von sowohl Gesamtcholesterin, gebundenem Cholesterin als auch freiem Cholesterin durch Messung eines der oben aufgeführten Reaktionsprodukte bzw. des bei der Reaktion verbrauchten Sauerstoffs.

Cholesterinoxydase ist ein neues Enzym, welches nachstehende Reaktion katalysiert:

Cholesterin + O₂ , _{cholestenon +} ^

Durch die erfindungsgemäße Koppelung dieser Reaktion mit der enzymatischen Spaltung von verestertem Cholesterin wird eine rasche und quantitative Spaltung des veresterten Cholesterins erzielt und auch freigesetztes Cholesterin rasch quantitativ weiteroxydiert. Das Verfahren ermöglicht damit eine absolut spezifische und genaue quantitative Bestimmung des gesamten Cholesterins.

Cholesterinoxydase, das Ausgangsmaterial zur ihrer Gewinnung, ihre Reinigung und die Eigenschaften sind in den deutschen Offenlegungsschriften DT-OS 2 224 133-4 und 2 224 131.2 beschrieben.

Das Verfahren der Erfindung eignet sich zur Bestimmung von Cholesterin in wässrigen Medien aller Art, wie Lebensmittelextrakten, Körperflüssigkeiten.und insbesondere Serum, in denen Cholesterin auch in veresterter Form vorkommt.

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Als Cholesterinesterase wird eine solche aus Leber oder Pankreas bevorzugt.

Die Messung des SauerstoffVerbrauchs, der HpOp-Bildung oder der Cholestenonbildung gemäß obiger allgemeiner Gleichung kann nach den hierfür bekannten und üblichen Methoden erfolgen.

Geeignete Methoden zur Bestimmung des Sauerstoffverbrauches sind beispielsweise Gaschromatographie und Depolarisationsverfahren. Bevorzugt wird die polarometrische Bestimmung mittels Sauerstoffelektrode, da sich dieses Verfahren besonders zur automatisierten Durchführung der Cholesterinbestimmung eignet. Derartige Bestimmungsmethoden sind bekannt. Besonders geeignet erwiesen sich die in den deutschen Offenlegungsschriften 2 130 340 und 2 130 308 beschriebenen Methoden zur polarometrischen Messung des Sauerstoffverbrauchs in wässrigen Medien.

Gebildetes Wasserstoffperoxyd kann sowohl titrimetrisch als auch potentiometrisch, polarographisch und colorimetrisch sowie enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt werden die enzymatischen Methoden unter Verwendung von Katalase oder Peroxydase, da diese nicht nur äußerst spezifisch und zuverlässig sind, sondern auch mit der Hauptreaktion unter Bildung von Wasserstoffperoxyd auf einfachste Weise kombiniert werden können. Als besonders geeignet erwies sich insbesondere die Bestimmung mittels Katalase in Gegenwart von ß-Diketonen, z.B. Acetylaceton und Methanol bzw. Äthanol oder Methylenglycol, sowie die Bestimmung mittels Peroxydase in Gegenwart eines Chromogens, Bei der Bestimmung mittels Katalase, Acetylaceton und Methanol wird letzteres zu Formaldehyd oxydiert, der mit Acetylaceton eine Farbreaktion eingeht, die gemessen werden kann. Bei der Bestimmung mittels Peroxydase werden als Chromophor Verbindungen zugesetzt, die nach der Reaktion photometrisch bestimmt werden können. Ein Beispiel für ein geeignetes Chromophor ist

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2,2*-Aminobenzthiazolinsulfonsäure.

Die Bestimmung des Cholestenons erfolgt mit Hilfe von Ketoreagenzien, vorzugsweise einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung umsetzenden Hydrazinderivat, wie z.B. 2,4-Dinitrophenylhydrazin.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin, welches aus Cholesterinoxydase, einem System zur Bestimmung von HpOp oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon und aus Cholesterinesterase besteht. In einer ersten bevorzugten Äusführungsfrom besteht dieses Reagenz aus Cholesterinoxydase, Cholesterinesterase, Katalase, Acetylaceton, Methanol und Puffer, einzeln oder gemischt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Reagenz aus Cholesterinoxydase, Cholesterinesterase, Peroxydase, Chromogen und Puffer, einzeln oder gemischt. Als Chromogen wird 2,2^f-Aminobenzthiazolinsulfonsäure bevorzugt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Reagenz aus Cholesterinoxydase, Cholesterinesterase und einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierenden Hydrazinderivat sowie gegebenenfalls einem Puffer. Als Hydrazinderivat wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin bevorzugt.

Die oben erwähnten bevorzugten Reagenzkombinationen können außer den aufgeführten obligaten Bestandteilen zusätzlich übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/und oberflächenaktive Substanzen enthalten. Alle diese Zusatzstoffe sind dem Fachmann bekannt und in Nachweissystemen für Wasserstoffperoxyd bzw. Cholestenon üblich.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

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Beispiel 1

0,02 ml Serum werden zu 10,0 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5» der 0,4 % Hydroxypolyäthoxydodecan enthält, gegeben. Es wird die Extinktion (E₁) bei 240 nm in einem geeigneten Spektralphotometer abgelesen und die Reaktion mit 0,02 ml (entsprechend 0,2 U) Cholesterinoxydase gestartet. Nach 5 min wird erneut die Extinktion (E₉) abgelesen. Die Konzentration des gebildeten Δ -Cholesten-3-ons und damit des freien Cholesterins ergibt sich aus der Differenz zwischen der ersten und der zweiten Ablesung unter Berücksichtigung des molaren Extinktionskoeffizienten für Δ -Cholesten-3-on bei 240 nm U = 15,5 οΐη²/μΜο1).

Zur Bestimmung des veresterten Cholesterins werden nun 0,02 ml (= 0,2 U) Cholesterinesterase aus Candida spec. (WS 90024) dazugegeben und nach 15 min die Extinktion (E,) abgelesen. Die Konzentration des veresterten Cholesterins ergibt sich aus der Differenz E, - E₂ unter Berücksichtigung der Eigenabsorption der Cholesterinesterase. Die Messung einer typischen Probe ergab '50 mg % freies Cholesterin und 148 mg i» verestertes Cholesterin. Die Vergleichsbestimmung nach Liebermann/Burchard ergab 212 mg % Gesamtcholesterin (freies und verestertes Cholesterin).

Beispiel 2

10 g Ammoniumhydrogenphosphat werden in 100 ml Wasser gelöst und mit 85 #iger Phosphorsäure auf pH 7,0 eingestellt. Dann werden 6,6 . 10^U Katalase zugesetzt. Mit der so erhaltenen Lösung wird eine Mischung von 0,2 ml Acetylaceton, 10 ml Methanol, 1,2 g Polyäthylenglykol und 1,2 g Natriumcholat auf 100 ml aufgefüllt.

5,0 ml der so erhaltenen Lösung werden mit 0,05 ml Serum bzw.

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0,05 ml einer Cholesterin-Standard-Lösung mit einem Gehalt von 200 mg $ Cholesterin gemischt. Aliquots der serumhaltigen Probe sowie der Cholesterin-Standard-haltigen Probe werden mit je 0,2 U Cholesterinoxydase und 0,2 U Cholesterinesterase aus Pankreas versetzt und 70 min bei 37⁰C inkubiert. Dann wird der gebildete Farbstoff bei 405 um photometrisch gemessen unter Berücksichtigung des Reagentienleerwertes.

Der Cholesteringehalt der serumhaltigen Probe wird unter Benutzung des Standards als Bezugsgröße bestimmt. Kontrollbestimmungen nach Liebermann/Burchard ergaben eine Abweichung von etwa 5 #.

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Claims

Patentansprüche

f1.) Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterin in wässrigem Medium mit Cholesterinoxydase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes H₂O₂ bzw. Cholestenon bestimmt wird, dann Cholesterinesterase zugesetzt und anschließend das gebundene Cholesterin bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Sauerstoffverbrauch polarometrisch gemessen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß gebildetes H₂O₂ enzymatisch mit Katalase oder Peroxydase bestimmt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß gebildetes Cholestenon mit einem Ketoreagenz, wie 2,4-Dinitrophenylhydrazin, gemessen wird.
5. Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Cholesterinoxydase, einem System zur Bestimmung von H₂O₂ oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon und Cholesterinesterase besteht.
6. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Bestimmung von H₂O₂ aus Katalase, Acetylaceton, Methanol und Puffer besteht.
7. Reagenz nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Bestimmung von HpOp aus Peroxydase, Chromogen und Puffer besteht.

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8. Reagenz nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Bestimmung von Cholestenon aus einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierenden Derivat, insbesondere 2,4-Dinitropheny!hydrazin, besteht.

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