DE2130340C3 - Verfahren und Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von einzelnen Proben unterschiedlicher Konzentration von Substanzen - Google Patents

Description

dung von Luftblasen an der Elektrodenoberfläche, Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind welche die Bestimmung stören. Eine definierte Probe- solche Substanzen, welche sich in Gegenwart von menge muß in die gerührte Lösung eindosiert werden, Sauerstoff übertragenden Enzymen unter Aufnahme und nach einer festgelegten Zeitdauer muß ein Meß- oder Abgabe von Sauerstoff umsetzen lassen. Beiwert abgelesen werden. Vor Durchführung einer 5 spiele für derartige Substanzen sind Zucker, wie GIuneuen Messung muß die Zelle entleert werden. Wenn cose und Galactose, Harnsäure, Nucleosidbasen, wie das System einige Stunden nicht in Betrieb war, wird Xanthin und Hypoxanthin, Cytochrom, Aminosäuren, eine umständliche und langwierige Neueichung erfor- polyungesättigte Fettsäuren, Wasserstoffperoxyd und derlich, die wohl auf Veränderungen an der Elektro- anorganische Peroxyde.

denoberfäche zurückzuführen ist. Es wurde daher io Als Sauerstoff übertragende Enzyme, die im Rah-

auch schon ein Verfahren beschrieben, bei welchem men der Erfindung an einen Träger gebunden einge-

eine sauerstoffsensitive Elektrode ständig von einem setzt werden, seien erwähnt Glucoseoxydase, Galac-

Reagens umströmt wird, das gelöste Glucoseoxydase toseoxydase, Uricase, Xanthinoxydase, Cytochrom-

enthält. Die Probenapplikation erfolgt hierbei aus oxydase, Aminosäureoxyd äsen, Lipoxygenase, Per-

einem Sekundärstrom, der die zu bestimmende GIu- 15 oxidase und Katalase.

cose enthält, indem durch eine semipermeable Mem- Die Sauerstoff übertragenden Enzyme müssen im

bran Glucose in den Reagensstrom hineindialysiert. Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens an einen

Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß der Zeitraum Träger gebunden vorliegen. Der Träger muß zweck-

bis zum Vorliegen des Meßergebnisses relativ groß mäßig so beschaffen sein, daß das Enzym in hoher

ist, da die Dialyse langsam verläuft. Ferner ist ein « spezifischer Aktivität gebunden wird und eine Zer-

Verfahren bekannt, bei welchem an der Elektroden- Setzung des Trägers und ein Verlust an Enzymaktivi-

oberfläche unmittelbar immobilisierte Glucoseoxydase tat weitestgehend ausgeschaltet ist. Ein geeigneter

angebracht ist. Die Oxydation der Glucose erfolgt an Träger ist beispielsweise in der Offenlegungsschrift

der Oberfläche der Elektrode. Dieses Verfahren eig- beschrieben.

net sich praktisch nur zur diskontinuierlichen GIu- »5 Der Träger soll teilchenförmig vorliegen, so daß

cosebestimmung, da nur begrenzte Enzymmengen an er als Säulenfüllung geeignet ist, welche von der Puf-

der Oberfläche der Elektrode fixiert werden können, ferlösung durchströmt wird und dabei eine gewisse

so daß für die Umsetzung der Glucose ein relativ Vermischung des im Pufferlösungsstrom blockartig

langer Zeitraum notwendig ist. oder pfropfenartig eingesetzten Probevolumens mit

Ferner ist aus der USA.-Patentschrift 3 512 517 ein 30 der Pufferlösung hervorruft. Eine hohe spezifische Verfahren zur Überwachung des Blutzuckergehaltes Aktivität des trägergebundenen Enzyms ist erwünscht, einer Person bekannt, wobei Blut kontinuierlich einer da dies die Anwendung sehr kleiner Mengen an trä-Dialysiervorrichtung zugeführt und dort mit einer im gergebundenem Enzym ermöglicht, wodurch die VerKreislauf strömenden, gelöste Glucoseoxydase ent- mischung des Probe-sBlocks« mit der Pufferlösung haltenden Pufferlösung in Berührung gebracht und 35 gering gehalten und die Probenfrequenz erhöht wird der Sauerstoffverbrauch mit einer Elektrode laufend und leicht und rasch auswertbare Meßergebnisse ergemessen wird. Diesem Verfahren liegt eine andere zielt werden. Zweckmäßig sollte die spezifische Akti-Aufgabe zugrunde, und es ist nicht möglich, damit vität des verwendeten trägergebundenen Enzyms quantitativ einzelne Proben unterschiedlicher Kon- wenigstens 10 U/g, vorzugsweise mehr als 50 U/g, zentration von Substanzen zu bestimmen. 4° und besonders bevorzugt mehr als 100 U/g betragen.

Aufgabe der Erfindung ist demgegenüber die Schaf- Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen fung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Verfahrens besteht in der luftblasenfreien blockartigen quantitativen Bestimmung von einzelnen Proben Einführung der Lösung, welche die zu bestimmende unterschiedlicher Konzentration von Substanzen, wel- Substanz (beispielsweise die Glucose) enthält, in den ches die oben beschriebenen Nachteile der bekannten, 45 Pufferlösungsstrom. Die Lösung soll dabei unter für den gleichen Zweck geeigneten Verfahren ver- möglichst geringer Vermischung mit dem Puffermeidet und welches insbesondere einfach und rasch lösungsstrom so eingeführt werden, daß sie nach Art durchgeführt werden kann, jederzeit sofort einsetzbar eines Flürsigkeitspfropfens im fließenden Strom wanist und sich auch zur Durchführung größerer Bestim- dert. Eine derartige Einführung läßt sich beispielsmungsreihen unter geringstem Zeitaufwand eignet. 5° weise mit Hilfe eines Schiebers erzielen, welcher in Das Verfahren soll ferner sehr genaue Resultate lie- einer Bohrung die abgemessene Menge der Lösung fern und einen möglichst geringen Verbrauch an enthält und so in den fließenden Pufferlösungsstrom Enzym aufweisen. gebracht wird, daß die Probelösung blockartig bzw.

Gelöst wird diese Aufgabe bei einem Verfahren pfropfenartig in der Pufferlösung mitgeführt wird,
zur quantitativen Bestimmung von einzelnen Proben 55 Ein weiteres wesentliches Merkmal des erfindungsunterschiedlicher Konzentration von Substanzen in gemäßen Verfahrens besteht darin, daß ein mit konsauerstoffhaltiger wäßriger Lösung durch Oxydation stanter Geschwindigkeit fließender Strom einer geeig- oder Reduktion in Gegenwart von Sauerstoff über- neten Pufferlösung als Träger und Reaktionsmittel für tragenden Enzymen und Messung der Veränderung die Umsetzung verwendet wird. Unter konstanter der Sauerstoffkonzentration mittels sauerstofTsensi- ^6o Geschwindigkeit wird hierbei eine solche Konstanz liver Elektrode erfindungsgemäß dadurch, daß eine der Geschwindigkeit verstanden, daß die unvermeidbestimmte Menge der die zu bestimmende Substanz lieh auftretenden Geschwindigkeitsschwankungen so enthaltenden Lösung luftblasenfrei in einen mit kon- gering sind, daß sie von dem mit der Elektrode verstanter Geschwindigkeit fließenden Strom einer Puf- bundenen Anzeigegerät praktisch nicht registriert ferlösung bestimmter Sauerstoffkonzentration block- 65 werden. Diese Bedingung ist ideal erfüllt, wenn eine artig ohne Änderung der Strömungsgeschwindigkeit konstante Sauerstoffkonzentration angezeigt wird, soeingegeben, über Träger gebundenes Enzym geleitet lange kein Probelösungsblock die Elektrode passiert, und anschließend zur Elektrode geführt wird. Wird diese konstante Geschwindigkeit nicht eingehal-

ten, so wird durch das ständig anzeigende Gerät eine deren Schieber eine zur Aufnahme einer bestimmten

Änderung der Sauerstoffkonzentration vorgetäuscht. Menge Probelösung geeichte Bohrung enthält. Durch

Eine solche Änderung würde auch vorgetäuscht wer- Eintauchen dieser Schieberöffnung in überschüssige

den, wenn bei der Einführung der Probelösung Luft- Probelösung, z. B. überschüssiges Probeserum, oder

blasen in den Reagensstrom gebracht werden. 5 öffnen der Bohrung zu einem größeren Behälter, der

Wesentlich ist weiter, daß die blockartige Einfüh- derartige Probelösung enthält, und Einfließenlassen rung der Probelösung keine Änderung der Strömungs- der Probe wird eine abgemessene Menge Probelösung geschwindigkeit des mit konstanter Geschwindigkeit bei Verschieben des Schiebers abgetrennt und blockfließenden Stroms der Pufferlösung hervorruft, da artig in den Pufferlösungsstrom eingegeben, wenn die auch hierdurch die Gefahr einer Verfälschung des io Bohrung des Schiebers in den unterbrochenen Teil-Meßergebnisses hervorgerufen würde. Erst die gleich- strom der Pufferlösung so gebracht wird, daß durch zeitige Erfüllung aller oben angegebenen wesentlichen die Bohrung die öffnung des unterbrochenen Stro-Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens ermög- mes erfolgt. Hierbei wird gleichzeitig der andere, bis licht es, die weiter unten beschriebenen Vorteile zu zu diesem Zeitpunkt nicht unterbrochene Teilstrom erzielen und eine ständig betriebsbereite vollautoma- 15 unterbrochen, was durch den gleichen Schieber erfoltisch arbeitende Vorrichtung zu schaffen, welche die gen kann.

gewünschten Messungen durchführt, ohne daß irgend- Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsweiche Pipettierschritte, Volumenmessungen, Zeit- gemäßem Verfahrens mit einem Reaktionsraum und messungen od. dgl. notwendig sind. einer Pumpe mit konstanter Förderleistung und mit

Geeignete sauerstoffsensitive Elektroden zur Durch- ao einer mit dem Reaktionsraum über Rohrleitungen

führung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind be- verbundenen Sauerstoffelektrode und Registrierein-

kannt. richtung ist dadurch gekennzeichnet, daß der Reak-

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfah- tionsraum eine Säule mit trägergebundenem Enzym ren so durchgeführt, daß die Pufferlösung nach Pas- ist und daß zwischen der Säule und einem Puffersieren der Elektrode im Kreislauf geführt wird, wobei as reservoir ein eine blockartige Eingabe der Probenverbrauchte Komponenten wieder ergänzt werden. lösung ohne Änderung der Strömungsgeschwindigkeit Wird beispielsweise das Verfahren unter Verwendung erlaubender Applikator (A) angeordnet ist.
einer zu bestimmenden Substanz durchgeführt, welche Der Probeapplikator besitzt vorzugsweise wenigunter Sauerstoffverbrauch oxydiert wird, so wird der stens zwei durch einen Sperrschieber mit wenigstens Sauerstoffgehalt der Pufferlösung wieder ergänzt, 30 zwei korrespondierenden Bohrungen abwechselnd zu indem beispielsweise Luft durchgeleitet wird, was sperrende Durchlässe, und eine der Bohrungen steht zweckmäßig in einem etwas größeren Behälter mit mit einer Zuflußleitung für die die zu bestimmende entsprechender Verweilzeit der Pufferlösung erfolgt. Substanz enthaltende Lösung in Verbindung, wenn Falls die zu bestimmende Substanz reduziert wird der korrespondierende Durchlaß gesperrt ist.
unter Erhöhung des Sauerstoffgehaltes der Lösung, 35 Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungswird der überschüssige Sauerstoff wieder entfernt, form steht der Applikator mit einer einen Unterdruck indem in entsprechender Weise ein sauerstofffreies liefernden Vorrichtung, z. B. einer Vakuumpumpe, in Trägergas, beispielsweise Stickstoff oder ein Edelgas, Verbindung, mit der die Zuflußleitung für die Probedurchgeleitet wird. lösung und die Probebohrung im Schieber evakuiert

Die Pufferlösung selbst stellt eine wäßrige Lösung 40 werden können.

eines für das jeweils verwendete Enzym geeigneten Der Applikator besteht aus einer Hülse mit ver-Puffers in üblicher Konzentration dar. Die geeigneten schiebbarem Kern, wobei Hülse und Kern je drei Puffer und Pufferkonzentrationen sowie die günstigen Durchlässe aufweisen, die durch Verschieben des pH-Werte für die jeweils verwendeten Enzyme sind Kerns zur Deckung gebracht werden können. Ein bekannt. 45 derartiger Applikator kann aus einer Hülse mit einer Die Pufferlösung kann gegebenenfalls noch andere ersten und zweiten Einlaßbohrung, einer ersten und Substanzen außer den puffernden Verbindungen ent- zweiten Auslaßbohrung, einer Lufteinlaßbohrung, halten, welche für die enzymatische Umsetzung not- einer Vakuumbohrung und einer Probelösungsbohrung wendig oder erforderlich sind. Beispiele hierfür sind sowie einem in der Hülse verschiebbar angeordneten Salze, welche etwa erforderliche Ionen, wie z. B. 50 Kern mit drei Bohrungen, die so angeordnet sind, Magnesiumionen, Sulfationen u. dgl., enthalten, oder daß durch Verschieben des Kerns die erste Einlaßstabilisierend wirkende Verbindungen, oberflächen- mit der ersten Auslaßbohrung, die zweite Einlaß- mit aktive Substanzen u. dgl. der zweiten Auslaßbohrung, die Lufteinlaß- mit der Die blockartige Eingabe der Probelösung ohne Vakuumbohrung und die Probelösungsbohrung mit Änderung der Strömungsgeschwindigkeit wird vor- 55 der Vakuumbohrung verbunden werden können, bezugsweise so durchgeführt, daß der Pufferlösungs- stehen, wobei nicht gleichzeitig die erste Einlaßbohstrom geteilt wird und die Teilströme abwechselnd rung mit der ersten Auslaßbohrung und die zweite unterbrochen werden und die die zu bestimmende Einlaßbohrung mit der zweiten Auslaßbohrung verSubstanz enthaltende Lösung (Probelösung) in den bunden werden.

jeweils unterbrochenen Strom eingegeben wird. Be- 60 Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann weiter sonders günstig ist es hierbei, die Probelösung an der eine Pumpe mit konstanter Förderleistung in der Lei-Unterbrechungsstelle selbst zuzugeben. Hierbei wird rung vor oder hinter dem Applikator aufweisen. Hiervorzugsweise ein Überschuß an Probelösung, bei- bei kann beispielsweise eine Schlauchpumpe Verwenspielsweise an Serum, zugegeben und durch öffnen dung finden. Eine solche Schlauchpumpe wird in der des Teilstromes der Überschuß abgetrennt Dies kann «5 deutschen Patentanmeldung P 20 25 056.0 beschriebeispielsweise wie oben bereits angedeutet erfolgen, ben.

indem in einen Teilstrom des Pufferlösungsstromes Der erforderliche mit konstanter Geschwindigkeit

eine schieberartige Vorrichtung eingeschaltet wird, fließende Strom der Pufferlösune läßt sirh iWinrh

auch ohne Pumpe erreichen, indem die Lösung mit aus einer Säulenwand 4, die zweckmäßigerweise zykonstanter Druckdifferenz durch die Vorrichtung ge- lindrische Form aufweist und an den Enden geschlosführt wird. sen ist und an einem Ende eine Einströmöffnung 5

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfin- und am anderen Ende eine Ausströmöffnung 6 für dungsgemäße Vorrichtung werden nachstehend an 5 Pufferlösung aufweist. Sie ist gefüllt mit Körnern 7, Hand der Zeichnung näher erläutert. In dieser stellt die aus Enzym auf festem unlöslichem Träger gebundar den bestehen. Die Größe der Säule hängt von der

F i g. 1 eine schematische Darstellung der erfin- gewünschten Meßempfindlichkeit, der Meßprobedungsgemäßen Vorrichtung, menge und der Aktivität des Enzyms ab. Zweck-

F i g. 2 eine schematische Darstellung der Führung 10 mäßigerweise wird eine Säule in thermostatisierter des Pufferlösungsstromes an der Sauerstoffelektrode, Ausführung verwendet. Zweckmäßig ist die Säule so

F i g. 3 eine Ansicht der mit trägergebundenem gestaltet, daß sie einfach ausgewechselt werden kann, Enzym gefüllten Säule im Schnitt, falls die Aktivität des trägergebundenen Enzyms

F ig. 4 eine Darstellung eines erfindungsgemäßen nachgelassen hat oder aus einem anderen Grunde Applikators mit Verbindungsleitungen sowie im 15 ein Austausch erforderlich ist, beispielsweise, um die Längsschnitt und Querschnitt, Vorrichtung für die Bestimmung einer anderen Sub-

F i g. 5 eine Registrierkurve, stanz einzurichten und damit ein anderes trägergebun-

F i g. 6 eine Eichkurve, denes Enzym einzuführen.

F i g. 7 eine weitere Registrierkurve und Der Probenapplikator A dient wie weiter oben

F i g. 8 die zugehörige Eichkurve. ao bereits beschrieben zum luftblasenfreien, blockartigen

Wie in F i g. 1 gezeigt, enthält ein Reservoir R Einbringen der Probelösung in den Pufferstrom. Er einen Vorrat an Pufferlösung. Eine Pumpe P fördert bewirkt die Abmessung der Probelösung und die die Pufferlösung aus dem Reservoir R in einen Pro- ständige Aufrechterhaltung des Pufferstromes ohne benapplikator A und von dort in eine mit dem träger- größere Geschwindigkeitsschwankungen,
gebundenen Enzym beschickte Säule S und weiter in »5 In der in F i g. 4 gezeigten Ausführungsform beeinen die Meßelektrode enthaltenden Detektor D steht der Applikator aus einer Hülse 10 und einem sowie schließlich wieder in das Reservoir R zurück. darin verschiebbaren Kern 11. Eine Einlaßleitung 12 Am Detektor D angeschlossen ist ein elektronischer für den Pufferstrom führt zur Bohrung 12 a in der Verstärker V, der die Meßsignale der Elektrode ver- Hülse 10. Eine Zweigleitung 13 zweigt von der Leistärkt und sie zur Registrierung an ein Registrier- 30 tung 12 ab und führt zur Bohrung 13 a der Hülse 10. gerät G, welches beispielsweise ein Schreiber sein Desgleichen führt eine Auslaßleitung 14, die mit der kann, weiterleitet. Bohrung 14 a verbunden ist und zum Auslaß der Puf-

Das Reservoir R kann aus einem beliebigen Gefäß ferlcsung dient, an der anderen Seite der Hülse 10 bestehen, welches eine Ablauföffnung für Puffer- weiter. Eine Zweigleitung 15 verbindet die Auslaßlösung enthält. Bei der vorzugsweisen Durchführung 35 bohrung 15 a in der Hülse 10 mit der Auslaßleitung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Kreislauf der 14. Eine Leitung 16, die mit einer Bohrung 16a in Pufferlösung enthält es weiter eine Zulauföffnung für der Hülse 10 in Verbindung steht, ist an ein Va-Pufferlösung sowie zweckmäßig eine öffnung zur Ein- kuum angeschlossen. Der verschiebbare Kern 11 weist leitung von Luft. Bei dieser Ausführungsform dient Bohrungen 17, 18 und 19 auf, welche bei entspreeine Pumpe M zur Erzeugung eines Luftstroms. Bei- 40 chender Schieberstellung jeweils die Bohrungen 12 a spielsweise sind hierfür die bei Aquarien verwendeten und 14a, 13a und 15a sowie 16a mit Bohrung 20 Pumpen geeignet. Zweckmäßigerweise besteht das und Trichterbohrung 21 in der Hülse 10 verbinden Reservoir R aus einem Gefäß in thermostatisierter können.

Ausführung. Die Pumpe P, die zur Förderung des Bei der in F i g. 4 a gezeigten Normalstellung des

Pufferstromes dient, kann, wie bereits erwähnt, als 45 Kerns 11 wird in die trichterförmige öffnung 21 die Schlauchpumpe oder auch als Kolben- oder Kreisel- zu untersuchende Probelösung, beispielsweise Serum, pumpe gestaltet sein. Zweckmäßigerweise ist ihre eingegossen und von dort in die Bohrung 18 des Förderleistung regelbar. Kerns 11. Die Füllhöhe in der trichterförmigen Boh-

Der in F i g. 2 schematisch im Schnitt gezeigte rung 21 der Hülse 10 spielt hierbei keine Rolle, so-Detektor besteht aus einer Durchflußzelle 1, die 50 weit nur Bohrung 18 im Kern 11 vollständig gefüllt zweckmäßigerweise thermostatisierbar gebaut ist. Sie wird. Während die Probe eingefüllt wird, fließt der enthält eine sauerstoffsensitive Elektrode 2 sowie Pufferstrom von 13 a nach 15 a. Nach Abschluß des einen Lösungskanal 3, in den die Meßelektrode 2 Füllens wird der Kern in Pfeilrichtung geschoben, bis hineinragt. sich die Bohrung 18 mit den Bohrungen 12 a und 14 a

Unter der Bezeichnung »Verstärker Vk sind alle 55 deckt. Die Probelösung, deren Volumen dem VoIufunktionalen Teile zu verstehen, die die Meßelektrode men der Bohrung 18 im Kern 11 genau entspricht, zur Arbeit benötigt, also Stromquelle, Anschlußleitun- wird vom Pufferstrom zur Säule S hin blockartig gen zur Stromquelle, elektronische Verstärkung usw. mitgeführt. Bei dieser Stellung des Kernes 11 ist der

Das Registriergerät G dient zur Registrierung der Strom von 13a nach 15a unterbrochen, gleichzeitig Meßergebnisse. Es können beliebige Geräte verwendet 60 wird die in der Einfüllöffnung 21 verbliebene Löwerden, bevorzugt wird jedoch ein Schreiber, der an sungsmenge durch die Bohrung 19, Bohrung 16 a und den Verstärker V angeschlossen werden kann. An Leitung 16 abgesaugt. Sobald die Probelösung im Stelle des Schreibers können auch andere Analog- Pufferstrom abgeleitet ist, wird der Kern Il entgegen oder Digitalgeräte verwendet werden. Für die Mes- der Pfeilrichtung verschoben, bis sich die Bohrung 18 sung erforderlich ist nur die Anzeige des Meßsignals «5 mit der Lufteinlaßbohrung 20 und der Auslaßbohin Relation zum Zeitablauf. In manchen Fällen ge- rung 16 a deckt. Die Bohrung 18 wird dabei vom nügt auch die Registrierung des Meßsignalmaximums. Puffer entleert und der Pufferstrom von Bohrung 13 a

Die in Fi g. 3 im Schnitt gezeigte Säule S besteht zu Bohrung 15 a wieder freigegeben. Schließlich wird

9 10

der Kern 11 wieder in Pfeilrichtung bis zur Ausgangs- einem zweiten Hahn gesteuert, dessen Kern auf der stellung bewegt, und der Vorgang kann wiederholt gleichen Achse sitzt wie der Kern, in den die Probewerden, lösung appliziert wird.

Die Größe des Applikators, insbesondere das Vo- Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfinlumen der Bohrung 18, hängt von der Empfindlich- 5 dungsgemäße Vorrichtung weist eine Reihe besonkeit des Verfahrens, der Strömungsgeschwindigkeit derer Vorteile auf. Es gestattet, außerordentlich der Pufferlösung und der Größe der Säule S ab. Falls rasche Analysen durchzuführen, da das Meßergebnis für die Bohrung 18 ein kapillarer Durchmesser ge- schon nach ganz kurzer Zeit (etwa 10 Sekunden bis wünscht wird, kann zur Erleichterung des Füllvor- 1 Minute) vorliegt. Durch den konstanten Flüssiggangs eine entsprechende öffnung in der Hülse 10 io keitsstrom wird eine sehr stabile Einstellung der Elekgegenüber der EinfüllöfFnung 21 angebracht werden. trode gewährleistet, die langwieriges Nacheichen Die Probe wird nicht auslaufen können, da die Ober- überflüssig macht und ständige Betriebsbereitschaft flächenspannung des unten hängenden Tropfens ein garantiert. Die Verwendung geeichter Meßpipetten Abreißen verhindert. wird überflüssig, so daß hieraus resultierende Fehler-

Der Applikator A kann aus beliebigem Material 15 möglichkeiten eliminiert werden. Durch die Verwen-

sein, soweit dieses Material gegenüber den verwen- dung trägergebundener Enzyme wird zudem noch

deten Lösungen inert ist und einen dichten Sitz von eine erhebliche Kosteneinsparung erzielt, da das

Kern 11 und Hülse 10 ermöglicht. Geeignete Mate- Enzym nicht nur ein einziges Mal verwendet werden

rialien sind z. B. Glas, Kunststoff oder Metall. Der kann, wie bei gelösten Enzymen, sondern außer-

Applikator A kann auch aus verschiedenen Materia- ao ordentlich oft wieder verwendet werden kann. Bei-

lien bestehen, beispielsweise aus Metall mit Oberflä- spielsweise ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit

chen aus einem gleitfähigen Kunststoff, wie z. B. Poly- trägergebundener Glucoseoxydase bereits seit mehr

tetrafluorethylen. als einem halben Jahr in Betrieb, ohne daß ein Wech-

Der Applikator A läßt sich im Rahmen des oben sei des Enzyms oder eine Nacheichung der Elektrode

angegebenen Prinzips auch anders gestalten, z. B. 35 erforderlich wurde.

zylindrisch entsprechend einem Mehrwegehahn. Der Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung

Parallelstrom wird in diesem Fall zweckmäßig in weiter.

Beispiel 1
Bestimmung von D-Glucose im Serum mittels Glucoseoxydase nach der Gleichung:

Glucoseoxydase
Glucose + O₂ + H₂O > Gluconsäure + H₂O₂

; Es wurde die in F i g. 1 der Zeichnung dargestellte Die einzelnen Vorrichtungsteile waren mit Silikon-Vorrichtung verwendet. Die Säule 5 wies einen schlauch von 1 mm Durchmesser verbunden. Als Durchmesser von 1 cm und eine Füllhöhe von 1 cm Puffer wurde 0,2 M Kaliumphosphatpuffer pH 6,0 auf und war mit in Wasser gequollener Glucose- verwendet, enthaltend 18 mM Kaliumiodid, 7,5 mM oxydase auf Träger mit einer spezifischen Aktivität 40 Ammomumheptamolybdat und 800 mM Natriumvon 200 U/g beschickt. Chlorid.

Als Detektor wurde eine handelsübliche sauerstoff- In den Applikator A wurden im Abstand von etwa

sensitive Elektrode mit einem Sauerstoffmeßgerät und einer Minute Serumproben mit bestimmtem Glucose-

angeschlossenem Potentiometerschreiber verwendet. gehalt eingegeben. Die Proben 1 bis 3 enthielten je

Die Anströmgeschwindigkeit der Elektrode be- 45 100 mg Glucose/100 ml Serum. Probe 4 enthielt 200,

trug 7,5 cm/Sek., der Durchmesser der Eintrittsboh- Probe 5 300, Probe 6 400 und Probe 7 500 mg/100 ml.

rung in die Durchflußzelle wie in F i g. 2 dargestellt Die auf dem Registriergerät G aufgezeichneten Meß-

1 mm. kurven zeigt Fig. 5. Die erhaltenen Werte sind in

\> Der verwendete Applikator A wies im Prinzip die F i g. 6 als Eichkurve wiedergegeben und zeigen, daß

If in F i g. 4 der Zeichnung gezeigte Konstruktion auf. 50 die Höhe der Gipfel über der Null-Linie des Meß-

. j^: Die Bohrung 18 im Kern 11 hatte 2 mm Durchmesser Schreibers direkt proportional dem Glucosegehalt der

!If und 10 mm Länge. Der Applikator A bestand aus Glas. Probe ist.

ff Beispiel 2

'■"> Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase nach der Gleichung:

Uricase
Harnsäure + 2H₂O + O₂ > Allantoin + H₂O₂ + CO₂

Das Verfahren vom Beispiel 1 wurde unter An- Es wurde die im Beispiel 1 beschriebene Vorrich-

wendung der gleichen Vorrichtung zur Bestimmung tung verwendet Die Anströmgeschwindigkeit der

von Harnsäure verwendet. Die Säule 5 war mit Uri- Elektrode betrug 3,5 cm/Sek.; der Durchmesser der case auf Träger gefüllt Die Säule5 wies einen Durch- 65 Eintrittsbohrung in die Durchflußzelle, wie in Fig. 2

messer von 1 cm und eine Füllhöhe von 5 cm auf. dargestellt, betrug 1 mm.

Die spezifische Aktivität der trägergebundenen Uri- Der verwendete Applikator A wies im Prinzip die

case betrug 3 U/g. in Fig. 4 der Zeichnung gezeigte Konstruktion auf.

Die Bohrung 18 im Kern 11 hatte einen Durchmesser von 2,5 mm und eine Länge von 13 mm. Der Applikator bestand aus Glas.

Die einzelnen Vorrichtungsteile waren mit Silikonschlauch von 1 mm Durchmesser verbunden. Als Puffer wurde 0,2 M Boratpuffer pH 6,5 verwendet, in dem 600 U/ml Katalase gelöst waren.

In den Applikator A wurden im Abstand von etwa 6 Minuten Proben von Harnsäurelösungen bestimmten Gehaltes eingegeben. Probe 1 enthielt 5 mg Harnsäure/100 ml, Probe 2 10 mg, Probe 3 15 mg, Probe 4

30 mg, Probe 5 45 mg und Probe 6 60 mg/100 ml. Die auf dem Registriergerät G aufgezeichnete Meßkurve zeigt F i g. 7 der Zeichnung. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 8 als Eichkurve wiedergegeben.

Man erkennt daraus, daß die Höhe der Gipfel über der Null-Linie des Meßschreibers direkt proportional dem Harnsäuregehalt der Probe ist.

Das obige Beispiel zeigt, daß auch mit trägergebundenen Enzymen geringer spezifischer Akti-

o vität die Erfindung vorteilhaft durchgeführt werden kann.

Hierzu 7 Blatt Zeichnungen

Claims (9)

1 2 Vakuumpumpe zum Evakuieren der Zuflußlei-Patentansprüche· tun8 (21) und der damit verbundenen Bohrung r (18) in Verbindung steht.

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von S

einzelnen Proben unterschiedlicher Konzentration

von Substanzen in sauerstoShaltiger wäßriger Lösung durch Oxydation oder Reduktion in Gegenwart von Sauerstoff übertragenden Enzymen und Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quanti-Messung der Veränderung der Sauerstoffkonzen- io tativen Bestimmung von einzelnen Proben untertration mittels sauerstoffsensitiver Elektrode, schiedlicher Konzentration von Substanzen in sauerdadurch gekennzeichnet, daß eine be- stoffhaltiger wäßriger Lösung durch Oxydation oder stimmte Menge der die zu bestimmende Substanz Reduktion in Gegenwart von Sauerstoff übertragenenthaltenden Lösung luftblasenfrei in einen mit den Enzymen und Messung der Veränderung der konstanter Geschwindigkeit fließenden Strom 15 Sauerstoffkonzentration mittels sauerstoffsensitiver einer Pufferlösung bestimmter Sauerstoffkonzen- Elektroden sowie eine Vorrichtung zur Durchführung tration blockartig ohne Änderung der Strömungs- dieses Verfahrens.

geschwindigkeit eingegeben, über trägergebunde- Substrate von Sauerstoff übertragenden Enzymen

nes Enzym geleitet und anschließend zur Elek- werden in der Technik wie auch im klinischen Labor

trode geführt wird. ao i_n großem Umfang laufend quantitativ bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- Hierbei besteht ganz allgemein das Problem, diese kennzeichnet, daß die Pufferlösung nach Passieren Bestimmungen rasch und einfach, d. h. ohne Ander Elektrode im Kreislauf zurückgeführt wird. wendung besonderer Reinigungs- und Trennverfahren

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch ge- so durchzuführen, daß die zu bestimmende Substanz kennzeichnet, daß die Sauerstoffkonzentration der 25 chemisch zu einem quantitativ erfaßbaren Produkt Pufferlösung durch Hindurchleiten von sauerstoff- umgesetzt wird. Häufig bedient man sich hierzu enzyhaltigem Gas bzw. sauerstofffreiem Inertgas kon- matischer Umsetzungen. So wird beispielsweise die stant gehalten wird. D-Glucose mit Hilfe des Enzyms Glucoseoxydase

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden unter Beteiligung molekularen Sauerstoffs zur GIu-Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die 30 consäure oxydiert. Dabei gleichzeitig entstehendes blockartige Eingabe der Prcbenlösung so erfolgt, Wasserstoffperoxyd wird mit einem Leukofarbstoff daß der Pufferlösungsstrom geteilt wird, die Teil- umgesetzt unter Bildung eines Farbstoffs, dessen ströme abwechselnd unterbrochen werden und Extinktion im Photometer gemessen wird und der die Probenlösung in den unterbrochenen Strom Glucosemenge äquivalent ist. Dieses Verfahren, das eingegeben wird. 35 als grundsätzliches Beispiel für viele Substratbestim-

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch ge- mungen, beispielsweise von Harnsäure, Galactose kennzeichnet, daß die Probenlösung an der _u. dgl., steht, hat zahlreiche Nachteile. Im allgemeinen Unterbrechungsstelle im Überschuß zugegeben muß bei biologischen Proben enteiweißt werden, was und durch öffnen des Teilstromes der Überschuß einen zusätzlichen Arbeitsschritt bedeutet. Das Verabgetrennt wird. 40 fahren erfordert einen relativ großen Zeitaufwand, so

6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfah- daß die Probenfrequenz bei Serienanalysen nur unter rens nach Anspruch 1 und 2 mit einem Reaktions- Verwendung sehr aufwendiger Analysenautomaten raum und einer Pumpe mit konstanter Förder- groß gehalten werden kann.

leistung und mit einer mit dem Reaktionsraum Zur Blutzuckerbestimmung wurden daher auch über Rohrleitungen verbundenen Sauerstoffelek- 45 bereits Geräte entwickelt, die sich der Sauerstofftrode und Registriereinrichtung, dadurch gekenn- bestimmung als Meßprinzip bedienen und einige der zeichnet, daß der Reaktionsraum eine Säule (S) erwähnten Nachteile nicht aufweisen. Hierbei wird mit trägergebundenem Enzym ist und daß zwi- mit Hilfe von sauerstoffsensitiven Elektroden der sehen der Säule (S) und einem Pufferreservoir (R) Sauerstoffgehalt einer Lösung gemessen. Zugesetzte ein eine blockartige Eingabe der Probelösung 5° Glucoseoxydase führt unter Verbrauch von Sauerstoff ohne Änderung der Strömungsgeschwindigkeit zur Oxydation von Glucose. Die Änderung der Sauererlaubender Applikator (/4) angeordnet ist. Stoffkonzentration wird mit der Elektrode gemessen

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, gekennzeich- und ist der umgesetzten Glucosemenge proportional, net durch eine Rezirkulationsleitung von der Hierbei entfällt die Notwendigkeit zur Enteiweißung Elektrode (D) zum Pufferreservoir (R). 55 der Proben, der Zeitraum zwischen Probenapplika-

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 tion und Vorliegen des Meßergebnisses wird verkürzt, und 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Applika- und die Spezifität wegen Fortfalls angeschlossener tor (A) wenigstens zwei durch einen Sperrschieber unspezifischer Indikatorreaktionen ist hoch.

(11) mit wenigstens zwei korrespondierenden Auch dieses Verfahren weist jedoch noch zahl-Bohrungen (17, 18) abwechselnd zu sperrende 60 reiche Nachteile auf. So muß das Volumen der zu Durchlässe (13a, ISa; 12a, 14a) aufweist und bestimmenden Probe mit Hilfe geeichter Meßpipetten eine der Bohrungen (18) mit einer Zuflußleitung festgelegt werden; was nicht nur Arbeitsaufwand be-(21) für die die zu bestimmende Substanz ent- deutet, sondern auch beträchtliche Fehlermöglichhaltende Lösung in Verbindung steht, wenn der keiten ergibt. So sind Methoden bekannt, die diskorrespondierende Durchlaß (12a, 14a) gesperrt 65 kontinuierlich arbeiten. Hierbei muß eine die sauer-'^st· stoffsensitive Elektrode enthaltende Meßzelle mit

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch ge- einer definierten Menge an Reagens gefüllt werden, kennzeichnet, daß der Applikator (A) mit einer Ein Nachteil ist hierbei die Möelichkeit der RiI-