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Beschreibung
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Verfahren zur Messung von gelösten Bestandteilen zur Verwendung von
immobilisierten Enzymen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Messung von in Lösung befindlichen Substanzen mittels
einer Enzymelektrode oder eines immobilisierten Enzymreaktors sowie eine Vorrichtung
zur Durchführung des Verfahrens. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren
zur Messung von gelösten Bestandteilen im Blut und anderen Körperflüssigkeiten mit
tels einer Enzymelektrode oder eines Reaktors unter Verwendung eines SH-Enzyms sowie
eine Vorrichtung zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.
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Enzymelektroden, die eine Kombination einer immobilisierten Enzymmembran,
die gegenüber dem Substrat (die zu messende Substanz) spezifisch reagiert, mit einer
Ionenelektrode oder dergleichen umfassen, wurden erstmals vor mehr als 10 Jahren
entwickelt; G.G. Guilbault, Handbook of Enzymatic Method of Analysis, Marcel Dekker,
New York, 1976. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt haben mehrere dieser Enzymelektroden
die Praxisreife erreicht. Diese Elektroden sind jedoch immer noch mit einer Reihe
von ungelösten Schwierigkeiten behaftet. Eine Schwierigkeit besteht in der kurzen
Lebensdauer.
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Es werden nämlich insbesondere SH-Enzyme, die für ihre katalytische
Wirkung eine oder mehrere SH-Gruppen benötigen, durch Spurenmengen an Schwermetallen
inaktiviert. Einige
Metallionen, die zur Bildung von Chelatverbindungen
neigen, lassen sich leicht unter Verwendung von Athylendiamintetraessigsäure oder
ähnlichen Verbindungen aus den inaktivierten Enzymen entfernen, jedoch lassen sich
auf die gleiche Weise einwertige Kationen, wie Silber(I), nicht leicht beseitigen.
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Dies ist häufig der Grund für die kurze Lebensdauer von Enzymelektroden.
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Messung von gelösten Bestandteilen bereit zu stellen, bei dem die Inaktivierung
von Enzymelektroden oder immobilisierten Enzymreaktoren mit SH-Enzymen verhindert
wird.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Messung von gelösten
Bestandteilen, bei dem entweder eine Enzymelektrode mit einer immobilisierten Enzymmembran
als Fühlmembran oder ein immobilisierter Enzymreaktor verwendet wird, das dadurch
gekennzeichnet ist, dass man während der Messunterbrechungen die Enzymelektrode
oder den Reaktor in Kontakt mit einer Lösung einer SH-Verbindung bringt.
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Nachstehend wird die Erfindung anhand der Zeichnungen naher erläutert.
Es zeigen: Fig. 1 eine schematische Darstellung des Elektrodenteils einer Analysenvorrichtung
mit einer Enzymelektrode; Figuren 2 (a) und 2 (b) schematische Darstellungen, die
das Prinzip der Analysenvorrichtung, die sich einer Enzymelektrode oder eines Enzymreaktors
bedient, erläutern; Fig. 3 eine schematische Darstellung des Prinzips einer Mehrkanal-Analysenvorrichtung
mit Enzymelektroden; und Fig.- eine schematische Ansicht einer mit einer Abfangvorrichtung
ausgerüsteten Analysenvorrichtung.
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Wirkt beispielsweise ein einwertiges Schwermetallion (nachstehend
als M+ bezeichnet) auf ein Enzym (E-SH), bei dem die freien SH-Gruppen wesentlich
für die Enzymaktivität sind, wird das Schwermetallion leicht gemäss folgender Reaktionsgleichung
an das Enzym gebunden.
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M + E-SH
E-SM + Da die SH-Gruppen eine wesentliche Rolle für die katalytische Aktivität spielen,
geht bei Ablauf dieser Reaktion die Enzymaktivität verloren.
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Kommt eine SH-Verbindung (als R-SH bezeichnet), die gegenüber M+ eine
grössere Reaktivität besitzt, in Kontakt mit so so reagiert M+ gemäss folgender
Reaktionsgleichung: M+ + R-SH
R-SM + Dies bedeutet, dass eine Inaktivierung des SH-Enzyms nicht.
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erfolgt.
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Bringt man ferner R-SH in Kontakt mit dem an M+ gebundenen, inaktivierten
Enzym, lässt sich die enzymatische Aktivität gemäss folgender Gleichung wieder herstellen:
E-SM + R-SH
E-SH + R-SM Nachstehend wird die Erfindung anhand der Messung von Harnstoff-Stickstoff
in Blut unter Verwendung einer Enzymelektrode mit immobilisierter Urease näher erläutert.
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Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Elektrodenteils des in
diesem Beispiel verwendeten Messystems. Die einzelnen Bezugszeichen haben folgende
Bedeutungen: 1 Enzymelektrode, 2 Bezugselektrode, 3 Erdungselektrode, 4 immobilisierte
Urease-Membran, 5 für Ammoniumionen selektive Membran, 6 und 7 ionendurchlässige
Membranen, 8, 9 und 10 Silber/Silberchlorid-Elektroden, 11, 12 und 13 Elektrolytlösungen,
14 kapillares Rohr- bzw. Schlauchsystem, 15 Pufferlösung und 16 Pfeil zur Angabe
der Fliessrichtung der Pufferlösung.
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Läuft beispielsweise eine geringe Menge einer Blutprobe (z.B. 10 >11)
durch das Kapillarrohr 14 unter Verwendung der Pufferlösung als Träger, wird der
in der Probe vorhandene Harnstoff unter der Einwirkung der immobilisierten Ureasemembran
der Enzymelektrode hydrolysiert, was zur Bildung von Ammoniumionen führt. Die Ammoniumionen
verändern das Membranpotential der für Ammoniumionen selektiven Membran, was in
Abhängigkeit von der Harnstoffkonzentration der Probe zu einer Potentialänderung
zwischen der Enzym- und der Bezugselektrode führt.
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Silber/Silberchlorid-Elektroden weisen bekanntlich bei derartigen
Bestimmungen eine höhere Stabilität bei der Ermittlung des elektrischen Potentials
auf. Obgleich Silberchlorid in Wasser nur sehr wenig löslich ist (Löslichkeitsppodukt
1,7 xl0-10 bei 250C) sind immer Spuren an Ag+ in den Elektrolytlösungen 11 bis 13
vorhanden. Ausserdem geht ein Teil des AgCl als Komplex (z.B. / Ag(NH,)2--C1-) in
Assoziation mit Ammoniumionen in Lösung.
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Da die für Ammoniumionen selektive Membran 5 nicht hydrophil ist,
wird die Passage von in der Elektrolytlösung 11 vorhandenem Ag+ durch die Membran
nach aussen als schwierig angesehen, jedoch gelangen Spurenmengen an Ag+ hindurch.
Die in den Elektrolytlösungen 12 und 13 vorhandenen Ag+-Ionen diffundieren leicht
aus dem System, indem sie die ionendurchlässigen Membranen 6 und 7 passieren.
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So lang Pufferlösung 15 durch dieses Messystem fliesst, werden die
von den Elektroden 2 und 3 stammenden Ag -Ionen leicht wegtransportiert, so dass
sie praktisch nicht von der Enzymmembran 4 eingefangen werden. Wenn jedoch der Pufferstrom
stoppt, kommt es selbstverständlich zu einer Diffusion von Ag+, das schliesslich
die Enzymmembran erreicht und die Ureaseaktivität hemmt. Bei dieser Anordnung muss
daher auch dann, wenn keine Messungen durchgeführt werden, die Pufferlösung kontinuierlich
oder zumindest absatzweise durch das System fliessen. Dies ist jedoch unwirtschaftlich.
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Im Rahmen von Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung führten,
wurde festgestellt, dass bei Anordnung der Elektroden 1, 2 und 3 in Abständen von
1 cm die Aktivität der immobilisierten Ureasemembran 4 innerhalb von 15 Stunden
nach Abschalten der Analysenvorrichtung vollständig verschwand. Wurde das Schlauchsystem
14 mit 50 millimolarer 2-Mercaptoäthanollösung gefüllt und 4 Stunden stehengelassen,
so wurden etwa 80 Prozent der ursprünglichen Aktivität der Ureasemembran wieder
hergestellt. Wurde eine vollständig inaktivierte Ureasemembran 8 Stunden in Kontakt
mit der 50 millimolaren 2-Mercaptoäthanolösung gebracht, so kam es zu einer vollständigen
Wiederherstellung der Membranaktivität.
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Füllte man nach Abschalten der Analysenvorrichtung das Schlauchsystem
14 sofort mit einer Mercaptoäthanollösung, so wurde nach 15 Stunden keinerlei Schwächung
der Aktivität der Ureasemembran festgestellt.
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Die gleichen Wirkungen liessen sich nachweisen, wenn eine Kombination
eines immobilisierten Enzymreaktors und einer Ammoniumionenelektrode anstelle der
Elektrode mit der immobilisierten Enzymmembran verwendet wurde.
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Neben den Untersuchungen unter Verwendung der in Fig. 1 dargestellten
Analysenvorrichtung wurden auch einige andere grundlegende Untersuchungen an SH-Enzymen
durchgeführt. Die untersuchten Enzymmembranen wurden hergestellt, indem man Alkohol-dehydrogenase,
Asparaginase, ß-Amylase, Urease, Fructose-biphosphatase und «-Glucosidase an Celluloseacetatmembran
immobilisierte. Ein mit einem porösen Polycarbonatfilter (Nucleo-Filter) in 2 Kammern
unterteiltes Gefäss wurde bereitgestellt. In jede dieser Kammern wurden 10 ml einer
60 millimolaren Phosphatpufferlösung gegeben. Eine Kammer wurde mit 100 yl einer
10 mikromolaren Silbernitratlösung und die andere Kammer mit einem kleinen Stück
der immobilisierten Enzymmembran versetzt. Die Enzymaktivität wurde nach 15-stündigem
Stehenlassen bei 40C gemessen, wobei in sämtlichen Fällen ein vollständiger Aktivitätsverlust
festgestellt wurde. Bei einem weiteren Versuch wurden
vorher in
die Kammer, die für die Aufnahme der immobilisierten Enzymmembran bestimmt war,
100 rl einer 1 m Mercaptoäthanollösung gegeben. Die Enzymaktivität wurde wieder
nach 15-stündigem Stehenlassen bei 24 0C gemessen. Zur Kontrolle wurde eine immobilisierte
Enzymmembran in eine Pufferlösung gebracht und ebenfalls 15 Stunden bei 4°C stehengelassen.
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Im Gegensatz zum Kontrollversuch blieb die enzymatische Aktivität
der Enzymmembran in der Lösung mit einem Gehalt an Mercaptoäthanol erhalten.
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Aus den vorstehenden Ergebnissen wurde erfindungsgemäss der Schluss
gezogen, dass die Inaktivierung von Enzymen durch Schwermetalle, insbesondere durch
einwertige Schwermetalle, verhindert werden kann, wenn immobilisierte SH-Enzyme
in Analysenvorrichtungen (Analysenvorrichtungen mit Enzymelektroden, Enzymreaktoren
und dergleichen) während der Ruhepausen der Analysenvorrichtung in ständigem Kontakt
mit niedermolekularen SH-Verbindungen stehen. Unter dem Ausdruck Ruhepausen sind
nicht nur die Messpausen über Nacht, sondern auch Messpausen von mehreren Tagen
zu verstehen.
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Im allgemeinen verlieren immobilisierte Enzymmembranen im Verlauf
der Zeit allmählich ihre Aktivität. Als ein Grund hierfür, wird, wie bereits erwähnt,
die Inaktivierung durch Schwermetallionen angesehen. Die Schwermetallionen können
aus leicht identifizierbaren Quellen stammen, wie im Fall der Ag+-Diffusion aus
verschiedenen Elektroden, sie können aber auch als Verunreinigungen in den Reagentien
vorliegen.
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Im Langzeitbetrieb können derartige Spurenmengen an Schwermetallionen
einen wichtigen Faktor bei der Verkürzung der Lebensdauer der Enzyme darstellen.
Diese Spuren an Schwermetallen, die als Verunreinigungen in die Analysenvorrichtung
gelangen, können erfindungsgemäss durch SH-Verbindungen abgefangen und aus dem System
entfernt werden.
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Die SH-Verbindungen stellen Reduktionsmittel dar. Sie können der Pufferlösung
zugesetzt werden, wenn sie die Bestimmung nicht stören. Die Konzentration der SH-Verbindungen
kann in
diesem Fall 0,001 bis 10 millimolar und vorzugsweise 0,01
bis 5 millimolar betragen. Konzentrationen über 10 millimolar können ebenfalls angewandt
werden, jedoch stört bei einigen Enzymelektroden, bei denen Nicht-SH-enzyme, z.B.
Glucoseoxidase bei Glucoseelektroden, verwendet werden, ein Kontakt mit Lösungen
mit höheren Konzentrationen an SH-Verbindungen die Elektrodenempfindlichkeit. Im
allgemeinen ist es wünschenswert, in. klinischen Analysenvorrichtungen mehrere Substanzen
gleichzeitig zu messen. Die Messungen werden dabei unter Einsatz mehrerer Enzymelektroden,
die entlang einer Fliesstrecke angeordnet sind, durchgeführt. Während der Messung
sollen Glucoseelektroden und andere Elektroden vorzugsweise nicht in Kontakt mit
den SH-Verbindungen gelangen (vgl. Fig. 3). Selbst wenn jedoch die SH-Verbindungen
nicht in direkten Kontakt mit den Elektroden stehen, wandern bei Betätigung der
Ventile geringe Mengen an SH-Verbindungen zu den Glucoseelektroden und anderen Elektroden.
Aus diesem Grund soll die Konzentration der SH-Verbindungen vorzugsweise nicht über
10 millimolar liegen. Bei Einhaltung von Konzentrationen unter 10 millimolar werden
SH-Verbindungen, die zu den Glucoseelektroden und anderen Elektroden wandern, durch
die Pufferlösung so stark verdünnt, dass ihre Konzentration vernachlässigbar gering
wird und sie keine nachweisbare Wirkung auf die Glucoseelektroden und anderen Elektroden
ausüben.
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Enzymelektroden unter Anwendung von SH-Enzymen, wie Urease, erleiden
keine Empfindlichkeitseinbusse, wenn sie in Kontakt mit SH-Verbindungen in Konzentrationen
von etwa 20 millimolar gelangen. Jedoch ist die Anwendung dieser Verbindungen in
Konzentrationen von mehr als 10 millimolar aus Gründen der Wirtschaftlichkeit und
des unangenehmen Geruchs von SH-Verbindungen unerwünscht. Andererseits sind auch
Konzentrationen von weniger als 0,001 millimolar aus wirtschaftlichen Gründen unerwünscht,
da in diesem Fall grosse Mengen an Lösung durch das System geleitet werden müssten,
um die Inaktivierung der Enzyme zu verhindern. Es können zahlreiche Arten von SH-Verbindungen,
die in der Pufferlösung löslich
sind, eingesetzt werden. Niedermolekulare
Verbindungen sind aufgrund ihrer guten Löslichkeit besonders erwünscht. Beispiele
für derartige SH-Verbindungen sind Mercaptoäthanol, Glutathion, Cystein, Thioglykolsäure,
2-Mercaptoäthylamin, Thiophenol, p-Thiocresol, Dithiothreit und dergleichen.
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Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht
darin, in die Fliesstrecke der Lösung zwischen der Enzymelektrode und der Bezugselektrode
eine mit einem Abfangmittel für einwertige Kationen gefüllte Falle vorzusehen. Bei
diesem Abfangmittel k-ann es sich um unlösliche SH-Verbindungen, wie feine, mercaptanisierte
Polystyrolteilchen handeln. Diese Teilchen werden in poröse Membranen, wie hydrophile
Polyester-Faservliese, die die Teilchen fest zusammenhalten, gebracht. Diese Falle
kann als Schutz für die Enzymelektroden gegen einwertige Schwermetallionen, die
aus der Bezugs- und der Erdungselektrode eluiert werden, dienen.
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Entsprechendes gilt bei Verwendung eines Enzymreaktors anstelle der
Enzymmembran. Die Menge des aus der Ammoniumelektrode eluierten Ag ist wesentlich
geringer als die aus der Bezugselektrode eluierte Menge. Daher kann die mit dem
Abfangmittel gefüllte Falle entweder stromaufwärts oder stromabwärts zur Ammoniumelektrode
angeordnet werden, so lange sie sich in der Fliesstrecke zwischen dem Reaktor und
der Bezugselektrode befindet. Normalerweise ist es am günstigsten, die Falle zwischen
dem Reaktor und der Ammoniumelektrode anzuordnen.
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Hat das Abfangmittel während langer Ruhepausen zu grosse Mengen an
Schwermetallionen adsorbiert, so lassen sich freie SH-Gruppen leicht regenerieren,
indem man eine Pufferlösung mit einem Gehalt an einer löslichen SH-Verbindung durch
die Falle laufen lässt.
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Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.
Fig. 2 zeigt ein Beispiel für eine Vorrichtung
der Erfindung. Fig.
2 (a) erläutert schematisch das Prinzip einer Analysenvorrichtung unter Verwendung
einer Enzymelektrode. Fig. 2 (b) zeigt in entsprechender Weise schematisch das Prinzip
einer Analysenvorrichtung unter Verwendung eines Enzymreaktors. Dabei haben die
Bezugszeichen folgende Bedeutungen: 1, 2 und 3 Enzymelektrode, Eezugselektrode bzw.
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Erdungselektrode, 22 Enzymreaktor mit immobilisierter Urease, 23 Ammoniumionnelektrode,
14 kapillares Rohr- bzw. Schlauchsystem, 15 Pufferlösung als Träger, 17 Flüssigkeitspumpe,
18 Probeninjektor, 19 Zelle zur Aufnahme der Elektroden, 20 Vorverstärker und 21
Aufzeichnungsvorrichtung. Wird eine geringe Probenmenge (z.B. 10 bis 20 rl) aus
dem Probeninjektor in die Fliesstrecke injiziert, wobei die als Träger dienende
Pufferlösung kontinuierlich durch die Zelle läuft, so erreicht die Probe die Elektrode
oder wird zunächst im Reaktor zersetzt und erreicht dann die Elektrode. Das im Aufzeichnungsgerät
registrierte Signal entspricht der gesuchten Konzentration. Wird die Pufferlösung
mit Mercaptoäthanol als SH-Verbindung in einer Konzentration von 5 millimolar versetzt,
so werden die in den Trägerstrom eluierten oder bereits in der Lösung befindlichen
Schwermetallionen kontinuierlich durch die SH-Verbindungen abgefangen, wodurch eine
Beeinträchtigung des immobilisierten Enzyms durch Schwermetallionen verhindert wird.
Die Anwesenheit von SH-Verbindungen in der Pufferlösung während der Messungen und
während der Ruhepausen der Analysenvorrichtung beeinträchtigt die Enzymelektrode
oder den Reaktor mit einem Gehalt an immobilisierter Urease nicht.
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Fig. 2 stellt ein Beispiel für eine Vorrichtung dar, mit der Harnstoff
unter Verwendung von immobilisierter Urease bestimmt wird. Die Vorrichtung von Fig.
3 ist entlang einer einzigen Fliesstrecke mit einer immobilisierten Enzymelektrode
und anderen Elektroden versehen. Da in diesem Fall die Glucoseelektrode und andere
Elektroden durch reduzierende Substanzen beeinträchtigt werden, bewirkt ein Zusatz
dieser Substanzen zur als Träger dienenden Pufferlösung eine Verringerung der Messgenauigkeit.
In Fig. 3 zeigt das Be-
zugszeichen 224 eine Zelle für eine Elekt-rode
für ein SH-Enzym, z.B. Urease, 25 eine Zelle mit einer Bezugselektrode und 26 eine
Zelle mit Elektroden für andere, von Harnstoff unterschiedliche Substanzen, z.B.
für Glucose. Das Bezugszeichen 27 bezeichnet eine Pufferlösung mit einem Gehalt
an einer SH-Verbindung. 28 und 29 sind Ventile in der Fliessstrecke. Während der
Messungen wird die Pufferlösung ohne SH-Verblndung durch den Trägerstrom geleitet.
Bei Ruhepausen oder Messunterbrechungen werden die Ventile 28 und 29 so eingestellt,
dass die Pufferlösung 27 mit einem Gehalt an einer SH-Verbindung nur durch die Zelle
24 oder kurzzeitig durch die Fliesstrecke bis zur Füllung sämtlicher Fliessstrecken
mit der Lösung 27 geleitet wird. Eine Beeinträchtigung der SH-Enzymelektrode kann
auf diese Weise ohne eine Beeinträchtigung der anderen Elektroden verhindert werden.
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Die Pufferlösung 27 kann nach Bedarf ersetzt werden.
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Ahnliche Ergebnisse werden unter Verwendung anderer Verbindungen,
wie Glutathion, Cystein, Thioglykolsäure, 2-Mercaptoäthylamin, Thiophenol, p-Thiocresol
oder Dithiothreit, anstelle von Mercaptoäthanol erzielt.
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Fig. 4 zeigt eine weitere Ausführungsform, bei der eine Falle vorgesehen
ist, die mit einem Abfangmittel für einwertige Schwermetallionen versehen ist. SH-Gruppen
werden auf bekannte Weise an der Oberfläche von Polystyrolteilchen mit einer durchschnittlichen
Teilchengrösse von 0,3 mm gebunden, wodurch man mercaptanisierte Polystyrol-Mikroteilchen
erhält.
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Diese mercaptanisierten Teilchen 241 werden in ein 10 mm langes Kapillarrohr
mit einem Innendurchmesser von 2 mm gepackt. Poröse Membranen 42, 43 aus hydrophilem
Polyester-Faservlies werden oben und unten auf die gepackte Säule gebracht, um ein
Austreten der Teilchen zu verhindern. Fig. 4 ist eine Teilansicht einer Analysenvorrichtung.
Wie in Fig.
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2 (a) sind stromaufwärts ein Gefäss für Pufferlösung, eine Pumpe und
ein Probeninjektor angeordnet. Nach der Messung liess man die Analysenvorrichtung
15 Stunden bei unterbrochenem Flüssigkeitsstrom stehen. Anschliessend wurden nach
Wie-
deraufnahme der Flüssigkeitszufuhr Proben gemessen. Die Ergebnisse
liessen keine Hinweise auf eine Inaktivierung der Enzymelektrode zu.
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Der gleiche Versuch wurde ohne mercaptanisierte Polystyrolteilchen
durchgeführt. Dabei wurde die Enzymelektrode durch die 15-stündige Ruhepause vollständig
inaktiviert.
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Die vorstehenden Beispiele zeigen, dass erfindungsgemäss die Lebensdauer
von Reaktoren mit immobilisierten SH-Enzymen und von Enzymelektroden, bei denen
immobilisierte SH-Enzymmembranen verwendet werden, stark verlängert werden kann.