DE2455970C3

DE2455970C3 - Verfahren und Vorrichtung zur Analyse von Harnstoff

Info

Publication number: DE2455970C3
Application number: DE2455970A
Authority: DE
Inventors: Don Norman Gray; Melvin Hubert Keyes; Frank Edward Toledo Semersky
Original assignee: Owens Illinois Inc
Current assignee: OI Glass Inc
Priority date: 1973-12-21
Filing date: 1974-11-27
Publication date: 1978-03-02
Also published as: JPS5330035B2; CA1039163A; JPS5098396A; FR2255602B1; NL176308C; NL7415252A; AU7676174A; NL176308B; FR2255602A1; US3926734A; GB1494490A; DE2455970B2; DE2455970A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Harnstoffbestimmung in einer wäßrigen Probe, bei dem Harnstoff mittels Urease hydrolysiert, der entstandene Ammoniak nach Diffusion durch eine hydrophobe Membran bestimmt und anschließend die Ammoniak- 4s werte in die äquivalente Probenharnstoffmenge umgerechnet werden.

Derartige Verfahren sind beispielsweise aus einem Artikel über Harnstoff (E. B e r η t und H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, so 2. Auflage, 1970, Band 2, S. 1738 ff.) bekanntgeworden. Dort werden verschiedene quantitative Methoden zur Harnstoffbestimmung beschrieben, z. B. gravimetrische chemische Verfahren, verschiedene photometrische Bestimmungen und auch die enzymatische Hydrolyse ss von Harnstoff mittels Urease, wobei Ammoniak direkt gebildet wird. Anschließend diffundiert der Ammoniak durch eine Membran und wird titriert, oder nach einem anderen dort beschriebenen Verfahren wird der Ammoniak drei weiteren Folgereaktionen unterwoi fen, <>o um 2-lndophenol herzustellen, dessen Gehalt dann kolorimetrisch bestimmt wird und proportional zur Harnstoffmenge ist. Dieses Verfahren ist dadurch besonders nachteilig, daß eim¹ große Anzahl von Reagenzien notwendig ist, um die 4-Stufen-Reaktion <\s durchzuführen, die zudem noch von p.a.-Qualität sein müssen. Ferner ist die Extinktion nur bis zu 20 g Harnstoff/100 ml Harn der Konzentration proportional.

so daß keine Proben analysiert werden können, die einen größeren Harnstoffgehalt aufweisen. Weiterhin macht sich auch nachteilig bemerkbar, daß die Farbreaktion erst innerhalb von 20—30 Minuten beendet ist, so daß dieser Zeitfaktor bei Routinearbeiten besonders unvorteilhaft ist.

Ferner sind aus der US-PS 37 76 819 sowie aus dem IBM-Technical Disclosure Bulletin, Vol. 11, No. 4, September 1968, S. 374 und 375, auch sogenannte Enzymelektroden bekannt, bei denen die Harnstoffprobe über eine Hydrolysezone mit immobilisierter Urease geleitet wird. Danach werden derartige Harnstoffbestimmungen insbesondere bei biologischen Flüssigkeiten wie Blut angewendet. Dabei wird die immobilisierte Urease durch eine semipermeable Membran von der Probenlösung abgetrennt, um zu verhindern, daß die Urease direkt mit der Harnstofflösuiig in Kontakt kommt bzw. durch sie ausgelaugt wird. Lediglich Harnstoff kann die semipermeable Membran durchdringen, um mit der Urease zu reagieren. Nachteilig macht sich bei diesen Enzymelektroden bemerkbar, daß eins.-Membran erforderlich ist, um die Urease von der Prcöe abzutrennen, damit sie nicht angegriffen wird oder selbst in die Probenflüssigkeit übergeht. Bei der genannten US-PS ist es ferner notwendig, die Urease in Form eines besonderen Überzuges auf die Elektrode selbst aufzubringen, der dann wiederum mit der Membran beschichtet wird.

Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Verfahren und eine Vorrichtung zur quantitativen Harnstoffanalyse zu schaffen, die die aufgezeigten Nachteile des Standes der Technik vermeiden und allgemein anwendbar sind und außerdem genau und zeitsparend arbeiten.

Bei einem Verfahren der eingangs genannten Art wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die Probe über in einer Hydrolysezone immobilisierte Urease geleitet und in dieser Zone unter Bildung von Ammonium-Ionen hydrolysiert wird, daß die Hydrolysemischung aus der Hydrolysezone entfernt und ihr pH-Wert auf mindestens etwa 11 angehoben wird, um die Ammonium-Ionen enthaltende Mischung in eine wäßrige Ammoniaklösung zu überführen und daß der durch die Membran diffundierte Ammoniak in einem Elektrolyten gelöst und der daraus entstandene Anstieg des pH-Wertes im Elektrolyten potentiometrisch bestimmt wird.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist die quantitative Harnstoffanalyse insoweit verbessert worden, als nunmehr auf eine Membran zwischen Urease und Probenlösung sowie eine Diffusion des Harnstoffs durch diese Membran verzichtet werden kann, wobei außerdem keine besondere Beschichtung der Elektrode mit Urease mehr benötigt wird. Ferner können erfindungsgemäß exakte Werte schnell bei verschiedenen Anwendungsgebieten zuverlässig ermittelt werden, ohne daß eine umständliche Mehrstufenreaktion mit anschließender photometrischer Bestimmung des erstandenen Farbstoffs durchgeführt werden muß, sondern vielmehr eine potentiometrische Analyse vorgenommen werden kann, die keine Inaktivierung des immobilisierten Enzyms verursacht und auch bei Fremd-Kationen in der Harnstoffprobe einwandfrei arbeitet. Eine schnelle Analyse isl auch bei Anwesenheit von 1 wertigen Kationen, wie Lithium-, Natrium- und Kalium-Ionen möglich, da die immobilisierte Urease von der potenliometrischen Elektrode getrennt ist, die wiederum nur auf eine Änderung des pH-Wertes anspricht, für die ausschließlich das Ammoniakgas verantwortlich ist. Erfindungsgemäß wird eine Inaktivierung der immobilisierten Urease durch den für die Umwandlung der Ammonium-Ionen in Ammoniak notwendigen pH-Wert dadurch verhindert, daß die Hydrolysezone von dem Bereich räumlich getrennt ist, wo der Basenzusatz erfolgt, um eine stark alkalische Lösung mit einem pH-Wert von mindestens 11 herzustellen.

Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung an Hand der Figuren beschrieben:

Es zeigt

Fig. 1 ein schematisches Ablaufdiagramm,

Fig. 2 und 3 Querschnitte durch eine Ausführungsform einer pH-Elektrodenzelle mit einer hydrophoben ammoniakpermeablen Membran.

Gemäß Fig. 1 fließt eine wäßrige Probe, die Harnstoff enthält, in ein Bett aus immobilisierter Urease, das als Hydrolysezone wirkt, indem die Probe eine Zeitlang auf einer Temperatur gehalten wird, die zur Hydrolyse des Harnstoffs zu Ammonium-Ionen ausreicht. Die Probe wird vorzugsweise so lange in Kontakt mit der immobilisierten Urease gehalten, bis der gesamte Harnstoff zu Ammonium-Ionen hydrolisiert wird. Diese Hydrolyse wird normalerweise in einigen Sekunden bis 30 Minuten oder länger bei Temperaturen von 0 bis etwa 50⁰C und mehr vervollständigt. Die Hydrolysereaktion verlauf! etwa nach folgender Gleichung:

Il
2H + H₂O -f H₂N C NH₂

-—-<· 2NH₄ + CO₂

oder

2H + OH + H,O , 11,N-C-NH,

Es wird angenommen, daß die Urease bei einem

JD pH-Wert von etwa 5 bis 9 für die Hydrolyse des Harnstoffs am wirksamsten ist. Wegen dieser Tatsache wird die Harnstoffprobe, bevor sie mit der Urease in Kontakt tritt, gewöhnlich mit einem wäßrigen Verdünnungsmittel vermischt, das auf einen pH-Wert von 5 bis

is 9 abgepuffert ist.

Der Verdünnungsgrad der Harnstoffprobe mit dem abgepufferten Verdünnungsmittel variiert mit der Konzentration des Harnstoffes in der Probe. Bei physiologischen Flüssigkeiten, wie Blut oder Urin, die innerhalb des erwarteten Konzentrationsbereiches eine unbekannte Konzentration aufweisen, ist ein Verhältnis von einem Volumenteil Probe auf 25 bis 50 Teile Verdünnungsmittel geeignet, um eine annehmbares Ansprechen der Elektrode zu erzielen, Gewöhnlich wird aus Sparsamkeits- und Wirtschaftlichkeitsgründen eine kleine Probe (etwa 10 bis 50 Mikroliter) zur Einführung in das Bett aus immobilisierter Urease in einen Strom eines abgepufferten Verdünnungsmittels, der mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 10 ml pro Minute fließt, eingegeben. Geeignete abgepufferte Verdünnungsmittel enthalten 0,01 M Natriumzitrat (pH 6,0), 0,01 M Natriummaleat (pH 6,2) und 0,01 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, eingestellt mit HCI auf einen pH-Wert von 7.

Zur Verzögerung der Inaktivierung der immobilisierten Urease und der Beschädigung des Trägermaterials können zusätzliche Reagenzien in das abgepufferte Verdünnungsmittel eingearbeitet werden. Dazu gehören Salze der Äthylendiamintetraessigsäure, um eine

so Vergiftung des Enzyms mit Schwermetallionen zu verhindern, /?-Mercaptoäthanol, um die Urease vor Oxydation zu schützen, und Natriumazid als Bakterieninhibitor.
Zur Immobilisierung von Urease auf einem unlösli-

ss chen Trägermaterial können sämtliche bekannte Verfahren Anwendung finden. Beispielsweise kann Urease kovalent mit einem aminofunktionellen Silan-Bindemittel an ein poröses Glasträgermaterial gebunden werden, wie es in dem Artikel »Urease Ccvalently Coupled to

(m Porous Glass« von H. H. W e e t a 11 und L. S. H e r s h , Biochim, Biophys. Acta, 185 (1969), Seiten 464-465, und in der US-Patentschrift 35 19 538 beschrieben ist, des weiteren kann Urease an wasserunlösliche Diazoniumsalze gebunden werden, wie es in dem Artikel

ds »Preparation and Properties of Waterinsoluble Derivatives of Urease« von E. R i e s e I und E. Katchalski, lournal of Biologial Chemistry, Vol. 239, No. 5 (1964), Seite 1521, beschrieben ist. oder Urease kann knvülpm

an Nylon gebunden werden, mit dem Verfahren, das in dem Artikel »The Immobilization of Enzymes on Nylon Structures and their Use in Automated Analysis« von D. J. I π man und W. F.. Hornby, Biochem. J. (1972), 129, Seiten 255 — 262, erwähnt ist, des weiteren kann Urease mit einem in dem Artikel »A Urea-Specific Enzyme Electrode« von G. G. G u i 1 b a u 11 und J. G. Montalvo, Jr., Journal of American Chemical Society, 91 (1969), Seiten 2164-2165, beschriebenen Verfahren auf einem Polyacrylamidge! immobilisiert werden, oder Urease kann auf der Oberfläche von Kaolinit absorbiert werden, beschrieben in dem Artikel »Preparation and Properties of Solid-Supported Urease« von P. V. Sundaram und E. M. Crook, Canadian Journal of Biochemistry, Vol. 49 (1971), Seiten 1388—1394, und schließlich kann Urease gemäß dem Verfahren des US-Patents 36 45 852 mit dem Titel »Method of Bindung Water-soluble Proteins and Watersoluble Peptides to Water-insoluble Polymers Using Cyanogen Haiide« von R. Axen, J. Porath und E. Er η bach und dem Artikel »The Preparation and Characterization of Lyophilized Polyacrylamide Enzyme Gels for Chemical Analysis« von G. P. H i c k s und S. J. Updike, erschienen im Analytical Chemistry, Vol. 38, No. 6, Mai 1966, Seite 726, mit Zyanbromid immobilisiert werden. Bei der Ausbildung des Bettes aus immobilisierter Urease ist daher die Auswahl des Trägermaterials aus Materialien, wie poröses Glas, Ton, wasserunlösliche Polymerisate, und das Immobilisieren der Urease auf diesen Materialien auf chemischem oder physikalischem Wege bekannt.

Nach der Hydrolyse des Harnstoffes strömt die resultierende Hydrolysemischung, die die Ammoniumionen enthält, aus dem Bett der immobilisierten Urease heraus und wird in einer geeigneten Mischkammer in ausreichender Weise mit einer Base vermischt, um den pH-Wert der Mischung mindestens auf etwa 11 zu stellen. Bei diesem pH-Wert und darüber werden nahezu alle Ammoniumionen in eine wäßrige Ammoniaklösung umgewandelt. Die Mischkammer weist einen Einlaß für den hydrolysierten Harnstoff, einen Einlaß für die Base und einen Auslaß für die entstehende Reaktionsmischung auf. In der Mischkammer kann zum Vermischen der Base mit dem hydrolysierten Harnstoff jeder beliebige Mixertyp, beispielsweise ein Impeller oder ein Schaufelmischer Anwendung finden, obgleich mit einem kleinen magnetisch betätigten Mixerstab bereits befriedigende Ergebnisse erzielt wurden.

Zur Einstellung des pH-Wertes auf mindestens etwa 11 kann jede beliebige Base verwendet werden, die keinen Ammoniak oder Ammoniumionen enthält. Geeignete Basen sind die Alkalimetallhydroxide [d. h. Ca(OH)₂ oder Mg(OH)₂], obgleich aus Wirtschaftlichkeits- und Sparsamkeitsgründen bei der pH-Werteinstellung verdünnte wäßrige Lösungen von Alkalimetallhydroxiden, insbesondere NaOH, mit Konzentrationen von etwa 0,01 bis etwa 1N bevorzugt werden.

Nach Einstellung des pH-Wertes auf mindestens 11 wird die resultierende wäßrige Ammoniaklösung mit einer hydrophoben, ammoniakpermeablen Membran über einen Zeitraum in Kontakt gebracht, der ausreicht, den gasförmigen Ammoniak durch die Membran dringen zu lassen. Derartige hydrophobe Membranen lassen gasförmigen Ammoniak hindurchtreten, während sie wäßrige Lösungen zurückhalten, und können in der Form von hydrophoben porösen und mikroporösen Kunststoffilmen mit einer Stärke von etwa 0,1 bis etwa 10 mil. einer Porosität von etwa 10 bis etwa 35% und

einem Porendurchmesser von etwa 0,05 bis 10 μ ausgebildet sein. Vorzugsweise weisen derartige mikroporöse Kunstsioffilme eine Dicke von etwa 0,5 bis 5 mil, eine Porosität von etwa 25% bis 80% und einen durchschnittlichen Porendurchmesser von etwa 0,05 bis 5 μ auf. Geeignete Kunststoffmembranen sind in der Form von porösen Kopolymerisaicn von Acrylnitril und Vinylchlorid auf einem Nylonträgermaterial, als poröses hydrophobes Zelluloseazetat, poröses Polytetrafluoräthylen, als mikroporöses Polypropylen, als poröses Polyvinylidenfluorid und anderen Membranmaterialien, die in dem US-Patent 36 49 505 beschrieben sind, im Handel. Diese Membranen gestatten die Diffusion von gasförmigem Ammoniak, während einwertige Ionen, wie Na⁴, K⁴ oder Li⁴, in der wäßrigen Lösung verbleiben, die nicht durch die Membran diffundiert.

Der durch die Membran dringende gasförmige Ammoniak wird danach zu einer pH-Elektrodenzelle geleitet, die eine wäßrige Elektrolytlösung enthält. Der gasförmige Ammoniak löst sich in dieser Elektrolytlösung und läßt auf diese Weise den pH-Wert der Lösung ansteigen. Dieser Anstieg des pH-Wertes wird mit einer pH-sensitiven Elektrode potentiometrisch gemessen.

Die Elektrolytlösung ist gewöhnlich eine verdünnte Lösung eines Ammoniumsalzes (0,1 M NH⁴CI), so daß auf diese Weise eine Basis-Ammoniumionenkonzentration geschaffen wird, gegenüber der ein Ansteigen des pH-Wertes rasch gemessen werden kann. Dieser Anstieg des pH-Wertes ist eine Funktion der Ammoniakgasmenge, die durch die Membran dringt. Die entsprechende potentiometrische Ablesung auf der pH-Elektrode kann rasch in die äquivalente Menge Harnstoff der ursprünglichen Probe umgewandelt werden. Die äquivalente Harnstoffmenge der Ursprungliehen Probe wird normalerweise in mg Blut-Harnstoff-Stickstoff (BHS/100ml Probe) angegeben. Diese Einheiten sind bei klinischen Anwendungszwecken gebräuchlich.

In Fi g. 2 ist ein Querschnitt durch eine pH-Elektrodenzelle gezeigt, die erfindungsgemäß eingesetzt werden kann.

F i g. 3 ist eine Vergrößerung der F i g. 2, wobei Teile nicht gezeigt sind, in der die Membran und die Elektrode im Detail dargestellt sind. Wie man den Fig.2 und 3 entnehmen kann, umfaßt die pH-Zelle 10 eine Elektrodenkammer 10a, mit der das Membrangehäuse 106 über ein Schraubengewinde 10c in Eingriff steht. Die Kammer 10a enthält eine pH-sensitive Elektrode 11, die eine herkömmliche Glaselektrode sein kann, welche auf eine geeignete herkömmliche Standard-Bezugselektrode 12, beispielsweise einen Platindraht, der mit Silber/Silberchlorid beschichtet ist, bezogen ist. Beide Elektroden werden von der Elektrodenhalterung 20, die mit einem Dichtungsring 21 ausgerüstet ist, gehalten. Die Elektroden 11 und 12 sind elektrisch an ein herkömmliches potentiometrisches pH-Meßwerk angeschlossen, das nicht gezeigt ist

Die Abtastspitzen der Elektroden 11 und 12 erstrecken sich in den Elektrolythohlraum 13, der eine wäßrige NH₄CI-Lösung (0,1 M) enthält Der Boden des Elektrolythohlraumes 13 wird von einer hydrophoben, ammoniakpermeablen Membran 14 gebildet, in deren unmittelbarer Nähe die Abtastspitze der Elektrode 11 angeordnet ist Mittels des Membrangehäuses iOb und der Membranhalterung 22 wird die Membran 14 mit dem Elektrolythohlraum 13 in Kontakt gehalten. Über den Dichtring 16 wird eine flüssigkeitsdichte Verbindung erzielt Das Membrangehäuse" tOb ist darüber

hinaus mit einem engen Durchgang 17 versehen, durch den die den Ammoniak enthaltende Probe in die üurchdringungskammer 23 dringt. Der Durchgang 17 und die Durchdringungskammer 23 weisen solche Abmessungen auf, daß ein turbulentes hinströmen gesichert wird, um die Probe zum Erzielen eines wirksamen Ammoniakdurchganges der Membran 14 in maximaler Weise auszusetzen. Nach dem Kontakt mit der Membran 14 verläßt der Probenrest, der nunmehr keinen Ammoniak mehr aufweist, die Kammer über den Durchgang 18. Die potentiometrische Messung, die aus dem Ansteigen des pH-Wertes resultiert, wird mittels potentiometrischer Eichtechniken in die Harnstoffkonzenlration der ursprünglichen Harnstoffprobe umgewandelt.

Bei dem oben beschriebenen Verfahren kann eine herkömmliche Ammoniakgaselektrode, beispielsweise eine handelsübliche Gastastelektrode oder eine Ammoniakelektrode Anwendung finden, bei denen die hydrophobe, ammoniakpermeable Membran in die pH-Elektrodenzelle eingearbeitet ist.

Bei der wirksamsten Ausführungsform für die klinische Laborarbeit werden das abgepufferte Verdünnungsmittel und die Base kontinuierlich durch das in Fig. 1 gezeigte System mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,1 bis etwa 10 ml/Minute, gewöhnlich um etwa 1 ml/Minute, gepumpt. Etwa 10—25 Mikroliter Harnstoffprobe werden mit einer Spritze am Einlaß in das Bett aus immobilisierter Urease direkt in den Strom des abgepufferten Verdünnungsmittels eingegeben. Im Bett aus immobilisierter Urease wird der Harnstoff zu Ammoniumionen und Bicarbonationen hydrolysiert. Nach dem Verlassen des Bettes aus immobilisierter Urease wird das Reaktionsprodukt mit der Base vermischt, um zur Überführung der Ammoniumionen in lösliches Ammoniakgas den pH-Wert auf mindestens etwa 11 ansteigen zu lassen. Bei diesem erhöhten pH-Wert werden die Bicarbonationen in Carbonationen umgewandelt.

Der Strom des abgepufferten Verdünnungsmittels, der den gelösten Ammoniak enthält, tritt danach mit der hydrophoben, ammoniakpermeablen Membran in Berührung, wonach der Durchgang des Ammoniaks beginnt. Bevor jedoch auf beiden Seiten der Membran das Gleichgewicht erreicht ist, ist die Konzentration des gelösten Ammoniaks in dem abgepufferten Verdünnungsmittel auf einen Punkt abgesunken, bei dem Ammoniak aus der Elektrodenelektrolytlösung in den abgepufferten Verdünnungsmittelstrom zurückdiffundiert.

Da die Harnstoffprobe in einer relativ hohen eingegrenzten Konzentration in den abgepufferten Verdünnungsmittelstrom eingegeben worden ist, tritt diese Reaktion schnell auf (d. h. innerhalb von etwa 2 oder 3 Minuten) und führt zu einem raschen Ansteigen des pH-Wertes, wodurch beim Ansprechen der potentiometrischen Elektrode eine scharfe Spitze entsteht Die Änderungsrate des pH-Wertes ist eine Funktion der Konzentration, d. h., je höher die Konzentration von NHj in der Mikroumgebung der Elektrode ist, desto größer ist der Anstieg der pH-Kurve. Die Schärfe der Spitze ist ebenfalls eine Funktion der Änderungsrate der NH3-Konzentration, d.h., die Schnelligkeit des Abfallens des pH-Wertes hängt davon ab, wie schnell der Ammoniak in den abgepufferten Verdünnungsmittelstrom ■zurückdiffundiert. Kleine Proben sollten schneller entfernt werden als große Proben. Die Höhe dieser scharfen Spitze ist ein Maß für die Harnstoffkonzentration. Die nächste Harnstoffprobe kann dann eingegeben werden, wenn die potentiometrische Ablesung zur Grundlinie oder an einen Punkt nahe der Grundlinie zurückgekehrt ist, sa

*> daß die nächste Harnstoffbestimmung nicht nachteilig beeinflußt wird.

Bei einer anderen Betriebsweise findet eine langsame Einführung der Harnstoffproben über längere Zeitperioden Anwendung, bis Gleichgewicht in der Ammo-

i<> niakdiffusion quer durch die Membran erreicht ist Beispielsweise werden 10-25 Mikroliter einer Harnstoffprobe langsam und kontinuierlich unter vollständigem und gleichzeitigem Mischen über eine lOminütige Periode in einen abgepufferten Verdünnungsmittel

is strom, der mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/Minute fiießt, eingeführt. Dadurch wird mit einem konstanter pH-Wert im Elektrodenelektrolyten und einem entsprechend konstanten potentiometrischen Ansprechen Gleichgewicht erreicht. Nachdem die konstante Able sung vorgenommen worden ist, wird die Einführung der Harnstoffprobe gestoppt, so daß die potentiometrische Ablesung zur Grundlinie zurückkehrt Diese Technik wird jedoch weniger vorgezogen da für jede Bestimmung ein längerer Zeitraum benötigt wird.

2«; Nachstehend wird die Erfindung an Hand von Beispielen weiter erläutert, wobei alle Teile Gewichtsteile, alle Prozentsätze Gewichtsprozentsätze und alle Temperaturen in Grad Celsius angeführt sind, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 1

In Beispiel 1 ist das abgepufferte Verdünnungsmittel eine wäßrige, 0,01 M Lösung von Tris-(hydroxymethyl)· aminomethan, die auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt is worden ist (mit HCl) und die Natriumäthylendiamintetraessigsäure, /J-Mercaptoäthanol und Natriumazid jeweils in einer Konzentration von 0,001 M enthält.

Die zur Einstellung des pH-Wertes verwendete Base war eine 0,03 N-Natriumhydroxidlösung.
Das Ureaseenzym wurde von der Worthingtor Biochemical Corporation erhalten und wies eine Aktivität von 139 internationalen Einheiten pro mg auf.

Das Trägermaterial für die Immobilisierung des Ureaseenzyms war Agarosegel (ein stark poröse« Polydextran), das unter der Warenbezeichnung Sepharose 4 B bei der Firma Pharmacia Fine Chemicals Ine erhältlich ist Der Elektrolyt in dem Hohlraum 13 war 0.1 M N H₄CI.

Als pH-Zelle wurde eine herkömmliche Glas-pH-Elektrode eingesetzt unter Verwendung eines Silber-Silberchlorid-Elementes in einem HCI-Elektrolyten mil einer Silber-Silberchlorid-Bezugselektrode.

Als ammoniakpermeable, hydrophobe Membran wurde ein mikroporöser Polypropylenfilm mit etnei Dicke von 1 mil, einer Porosität von 35%, einen: durchschnittlichen Porendurchmesser von weniger ah 0,1 μ verwendet, der bei der Celanese Corporation untei der Warenbezeichnung Celgard 2400 erhältlich ist

^TeilA

44 ml einer wäßrigen Dispersion von 4 Gewichtsprozent des oben beschriebenen Agarosegels wurden in einen Buchner-Trichter gegossen und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Agarose auf dem Filter wurde in ein Becherglas gegeben, wonach destilliertes Wasser unter Agitation so lange zugegeben wurde, bis eine Dispersion von 40 ml erhalten wurde, die dann in Zentrifugenröhren bei etwa 1000 Umdrehungen prc

Minute 5 Minuten lang zentrifugiert wurde. Nach Dekantieren des Obenstehenden wurde die Agarose im Boden der Zentrifugenröhren wiederum in ein Becherglas gegeben, wonach destilliertes Wasser unter Rühren zur Bildung eines einheitlichen Gels mit einem Volumen von 40 ml zugesetzt wurde.

Teil B

400 mg der oben beschriebenen Urease wurden in einer wäßrigen Lösung von 20 ml 0,05 M Natriuniborat, die mit 6 N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 0,5 eingestellt worden war, gelöst. Die entstandene Lösung wurde in einem Eisbad für die in Teil C beschriebene Verwendung gelagert.

TeilC

4 g von als Reagenz geeigneten Cyanbromidkristallen wurden dem Agarosegel von Teil A zugesetzt, und der pH-Wert wurde unter kontinuierlichem Rühren schnell mit 6,0 M Natriumhydroxid auf etwa 11 eingestellt. Durch Zugabe des erforderlichen Natriumhydroxids (6,0 N) wurde der pH-Wert der Mischung auf diesem Wert oder im Bereich dieses Wertes gehalten; während dieser Zeit lösten sich die Cyanbromidkristalle langsam auf und reagierten. Diese Lösungsreaktion erforderte etwa 15 Minuten, während denen zerdrücktes Eis zugegeben wurde, um die Temperatur unter 20⁰C zu halten. Eine Gesamtmenge von etwa 40 ml von 6,0 M Natriumhydroxid war über diese 15minütige Periode erforderlich, um den pH-Wert auf 11 zu halten.

Nachdem sich das Cyanbromid vollständig aufgelöst hatte und reagiert war, wurde das entstandene Gel auf einem Trichter aus gesintertem Glas mit 300 ml einer kalten 0,05 M Natriumboratlösung, die mit NaOH auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt worden war, gewaschen.

Das entstandene Agarosegel wurde in einen 100 ml Becher gegeben, und es wurde die in Teil B hergestellte kalte Ureaselösung sofort ohne Rühren zugesetzt. Das Urease/Agarose-Gel wurde dann rasch gefroren und 5 Minuten lang in diesem Zustand belassen. Danach wurde es über 20 Stunden auf 0°C gehalten, wobei mit einem Magnetrührer leicht gerührt wurde.

Das entstandene immobilisierte zusammengesetzte Urease/Agarose-Gel wurde auf einem Trichter aus gesintertem Glas unter Ansaugen filtriert und zuerst mit einer 0,5 M Natriumchloridlösung und danach mit destilliertem, deionisiertem Wasser gewaschen, bis die Filtratspülungen frei von Urease waren, was durch das NichtVorhandensein einer Absorption bei der charakteristischen Wellenlänge von 272 nm angezeigt wurde. Das immobilisierte zusammengesetzte Urease/Agarose-Gel wurde in 0,05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung(pH 7,5)bei0—5°Cgelagert.

Teil D

Die Aktivität des immobilisierten Urease-Agarose-GeIs von Teil C wurde bestimmt, indem eine bekannte Menge Gel mit einer 0,15 M Harnstofflösung, die 0,005 molar in Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und 1,0 χ 10-³ molar in Dinatriumäthylendiamintetraessigsäure ist, vermischt und die Änderung des pH-Wertes mit der Zeit gemessen wurde. Die Änderungsrate des pH-Wertes wurde mittels des Verfahrens von L Jakobsen.K. Lindstrom-Lang, M. Ottesen und D. Glick Ed. in »Methods of Biochemical Analysis«, Vol. IV, Interscience Publishers, N. Y, 1957, Seite 171, in Enzymaktivität umgewandelt

Diese analytische Technik liefert eine Akiivität für die Urease von 1000 1. U./ml Gel, die nach Lagerung des Gels über 2 Monate bei 0-4⁰C in 0,05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan auf etwa 400 I. U./ml absinkt.

Teil E

Aus einer 75 mm Borosilikatglaskapillarröhre wurde eine Glasröhre mit einem Innendurchmesser von 2,8 mm und einem AuBendurchmesser von 6 min hergestellt. An einem Ende der Röhre wurde eine Nylonscheibe (400 mesh) befestigt. Die Röhre wurde mit dem immobilisierten Urease/Agarose-Gel von Teil C gefüllt. Das Urease/Agarose-Gel verdichtete sich in der Röhre durch die Schwerkraft. Nachdem die Röhre mit dem Urease/Agarose-Gel gefüllt worden war, wurde auch das andere Ende der Röhre mit einer 500 mesh Nylonscheibe versehen.

Die Röhrenenden wurden dann mit T-förmigen Kunststoffrohrverschraubungen zur Probeneinführung ausgestattet. Die T-Stücke waren mit einer Kunststoffmembran zur Probeneinführung mit einer hypodermischen Nadel versehen.

Teil F

Die oben beschriebenen Lösungen aus dem abgepufferten Verdünnungsmittel und der Base wurden durch die in F i g. 1 beschriebene Vorrichtung mit jeweils 1,0 ml/Minute gepumpt. 10 Mikroliter Doppelproben mit den oben beschriebenen Harnstoffkonzentrationen wurden mit einer hypodermischen Nadel durch die Injektions-T-Stücke in die Röhre mit dem immobilisierten Enzym injiziert, wie in F i g. 1 gezeigt ist. Die Analyse wurde wie in Verbindung mit der Zeichnung beschrieben durchgeführt. Es wurden folgende Ablesungen in Millivolt erhalten:

Konzentralion des	Änderung der elektromotorischen
Harnstoffes in	Krall (in Millivolt) am
Wasser	plI-Mettgeriit
0,1 M	1<M,5
	I¹M₁O
0,01 M	138,5
	137,5
0,001 M	78.0
	78.(1

Es wurde ein Eichdiagramm hergestellt, in dem die Änderung der elektromotorischen Kraft in Millivolt gegen den Logarithmus der Harnstoffkonzentration aufgetragen wurde. Dieses Diagramm ist im wesentlichen eine Gerade, die Nernstsches Verhalten anzeigt.

Es wurde eine Blutserumprobe unbekannter Harn-Stoffkonzentration analysiert, indem Proben von 10 Mikroliter unter Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens in die Röhre injiziert wurden. Etwa eine Minute nach Injektion der Probe wurde eine maximale Ablesung in Millivolt erhalten. In Intervallen von etwa einer Minute wurden weitere Proben in die Röhre injiziert. Eine Gesamtmenge von 50 Proben des Serums führte zu einer Änderung der elektromotorischen Kraft von 130+1,0 Millivolt. Diese Änderung der elektromotorischen Kraft entspricht in dem oben beschriebenen Eichdiagramm einer Konzentration von 7,50 χ 10~^! molar Harnstoff. Diese Konzentration entspricht einem Blut-Harnstoff-Stickstoff-Wert von 21,0 ±0,8 mg Stickstoff/100 ml Serum.

Ähnliche Analysenergebnisse wurden gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten, das ein Enzymbett aus einem vernetzten Polydextran, erhältlich von der Firma Pharmacia Fine Chemicals Inc. unter der Warenbezeichnung Sephadex G-200, hergestellt wurde. Man ließ ein Gramm des vernetzten Polydextrans, 4 g Cyanbromid, 6,5 ml 6 N-Natriumhydroxid und 200 mg Urease gemäß dem oben beschriebenen Verfahren reagieren und erhielt ein immobilisiertes Urease/Polydv.xtran-Gel mit einer Aktivität von etwa 400 I. U./ml Gel. Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn als hydrophobe, ammoniakpermeable Membran ein Copolymerisat aus- Acrylnitril und Vinylchlorid, das bei der Firma Gelman Instrument Company unter der Warenbezeichnung Acropor ANH-3000 erhältlich ist. anstatt der Membran aus mikroporösem Polypropylen verwendet wird.

Beispiel 2

Dreizehn 20 Mikroliter-Proben eines Serums, das gemäß chemischer Analyse, welche auf herkömmliche klinische spektrophotometrische Art durchgeführt wurde, 15,9 mg Blut-Harnstoff-Stickstoff/100 ml enthielt, wurden gemäß den Verfahren des Beispiels 1 analysiert. Als Ergebnis wurde ein Blut-Harnstoff-Stickstoff-Wert von 16,1 mg/100 ml mit einer Standardabweichung von 0,2 mg/100 ml erhalten. Ähnliche genaue Resultate wurden erhalten, als die Analyse mit chemisch analysierten Proben, die 49 mg Blut-Harnstoff-Stickstoff/100 ml enthielten, wiederholt wurde.

Beispiel 3
Teil A

20 ml destilliertes Wasser wurden mit 10 ml (etwa 1 g) der in Beispiel 1 verwendeten Agarose zur Bildung einer Agarose-Suspension vermischt. Dieser Agarose-Suspension wurden 10 ml einer lOgewichtsprozentigen Lösung aus Cyanbromid zugesetzt, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 3,0N-NaOH auf 11,0 eingestellt, wobei die Temperatur der Agarose-Suspension bei etwa 22 bis 27°C, gegebenenfalls unter Zugabe von Eis, gehalten wurde.

Nach der Einstellung des pH-Wertes wurde die Agarose durch Vakuumfiltration schnell mit etwa einem Liter einer kalten, wäßrigen 0,2 M Natriumborat-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8,5 gewaschen. Eine Hälfte der entstandenen, durch Cyanbromid »aktivierten« Agarose wurde einer Ureaselösung zugesetzt, die durch Lösen von 20 mg Urease (92 internationale Einheiten/mg) in 5 ml der oben beschriebenen 0,2 M Natriumboratpufferlösung, die auf 0⁰C gekühlt worden war, hergestellt worden war. Die entstandene Urease/ Agarose-Suspension wurde bei 0—3°C über Nacht gerührt, um die Immobilisierungsreaktionen zu vervollständigen.

Die Aktivität der entstandenen immobilisierten Urease wurde mit einem Labor-pH-Wert-Meßgerät (Modell pHR, erhältlich bei der Firma Sargent-Welch) und einer geeichten Elektrode für einwertige Kationen (Beckman Model 39 137), die auf eine Standard-Calomel-Elektrode bezogen war, bestimmt. Die Aktivität der immobilisierten Urease wurde mit etwa 500 internationalen Einheiten pro Gramm Urease/Agarose-Gel bestimmt.

1,5 ml des immobilisierten Urease/Agarose-Gels wurden in eine Glasröhre mit einem Innendurchmesser von 4 mm eingebracht, und die Glasrohre wurde an jedem Ende init einer Nylonscheibe (400 mesh) zur Bildung einer kleinen Säule aus immobilisierter Urease versehen. Danach ließ man destilliertes Wasser durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/Minute dringen, um die immobilisierte Urease in Form eines Bettes hydraulisch zu verdichten.

Die Röhre, die das immobilisierte Urease/Agarose-Gel enthielt, wurde wie das immobilisierte Ureasebett des Beispiels 1 angeschlossen. Es wurde eine geeichte Ammoniak-Elektrode verwendet, die eine hydrophobe ammoniakpermeable Membran und eine pH-Elektrodenzelle (erhältlich von der Firma Orion Corporation als Elektrode Model 95-10) enthielt.

Sechs Blutserumproben von sechs verschiedenen menschlichen Patienten wurden in einem Krankenhauslabor chemisch analysiert. Wie durch die Analyse festgestellt wurde, wiesen drei der Proben einen Blut-Harnstoff-Stickstoff-Wert von 5,0 mg/100 ml und drei der Proben einen Wert von 17,0 mg/100 ml auf. Diese Serumproben wurden in 0,i M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung im Verhältnis 1 :25 verdünnt, und die verdünnten Serumproben wurden piit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml/Minute in die Röhre mit der immobilisierten Urease dieses Beispiels eingeführt. Um den pH-Wert auf 13 einzustellen, wurden etwa 1 ml/Minute 0,2 N Natriumhydroxid zugesetzt.

Unter diesen Bedingungen wurde chemisches Gleichgewicht erzielt, und die Änderung der elektromotorischen Kraft (in Millivolt) wurde gemessen. Der entsprechende Blut-Harnstoff-Stickstoff-Wert wurde aus dem Eichdiagramm bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.

Seriim-	UIuI-I l;irnstolT-	lilut-l l.i mstulT-
p ro be	Slickslolf-Wert	SliekstolT-Werl
	aus ehem. Anah^e	aus erfinilungsgem
		Verführen
	(mg IiI IS/IOD ml	(mg liHS/llNl ml
	Serumprcihe)	Sv-TlI111 I
1	14	13.8
2	14	14.(1
3	14	13.0
4	17	17.0
S	17	Κι,Ι
(ι	17	Ui.8

"* Be i s ρ i e I 4

Urease wurde auf einem partikelförmigen porösen Aluminiumoxidträgermaterial immobilisiert, in dem 100 mg Urease und 1,0 g des partikelförmigen Aluminiumoxides in 200 ml 0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (mit HCl auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt) bei 40⁰C und einstündigem Rühren vermischt wurden. Das partikelförmige Aluminiumoxid wies eine Partikelgröße von —50 bis +100 mesh

ho (US-Maschensieb) und einen durchschnittlichen Porendurchmesser von etwa 0,1 bis 0,2 μ auf. Das immobilisierte Urease/Aluminiumoxid-Reaktionsprodukt ließ man bei 0⁰C über Nacht stehen.

Das Reaktionsprodukt wurde danach auf einem Trichter aus gesintertem Glas vakuumfiltriert und zuerst mit 500 ml 0,5 M NaCl gewaschen, wonach es mit 1 bis 2 1 destilliertem Wasser gewaschen wurde. Das gewaschene immobilisierte Urease-Reaktionsprodukt

wurde bis zur Verwendung von 10—20 ml einer 0.01 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethjn-Pufferlösung gelagert. Die Aktivität des immobilisierten Urease/Aluminiumoxid-Produktes wu: de mit 1500 I. UVcm^J bestimmt.

Diese Aktivität fiel nach der Verwendung bei der > Harnstoffhydrolyse infolge des Auslaugens der Urease aus dem Aluminiumoxidträgermaterial rapide ab. Das Material besitzt daher eine relativ kurze Lebensdauer, wenn es für die Harnstoffanalyse gemäß Beispiel 1 eingesetzt wird. ι ο

Beispiel 5

Es wurde eine Lösung von 1,2-Dibromäthan hergestellt, indem 0,25 ml 1,2-Dibromäthan in 20.0 ml Methanol gelöst wurden. Dieser Dibromälhanlösung wurden 200 ml einer Tris-(hydroxymethy!)-aminomethan-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,2 zugesetzt. Der pH-Wert der entstandenen Lösung wurde durch tropfenweise Zugabe von l,0M HCl auf 8,2 eingestellt und auf diesem Wert gehalten.

Der abgepufferten Dibromäthanlösung wurden unter Rühren, während die Temperatur bei 40⁰C gehalten wurde, 100 mg Urease und 1,0 g poröses Aluminiumoxidpulver (das gleiche Aluminiumoxidpulver wie in Beispiel 4) langsam zugesetzt. Dieses Reaktionsgemisch wurde eine Stunde lang bei 4O⁰C gerührt, wonach man es über Nacht bei 0°C stehenließ. Nach dem Filtrieren und Waschen wurde die immobilisierte Urease/Aluminiumoxid-Zusammensetzung untersucht, wobei festgestellt wurde, daß sie eine Aktivität von 618 I. U./cm^J .v> aufwies. Die Aktivität dieser Zusammensetzung fiel während des Grbrauches nur sehr langsam ab und wies in bezug auf die Harnstoffanalyse gemäß Beispiel 1 eine verbesserte Lebensdauer auf. Offensichtlich wirkt das Dibromäthan als Netzmittel bei der Immobilisierung der Urease auf dem porösen Aluminiumoxid.

Beispiel 6

Teil A

Urease wurde auf porösem Aluminiumoxid wie in Beispiel 5 immobilisiert, mit der Ausnahme, daß 0,25 ml 1,3-Dibrompropan als Netzmittel anstelle des 1,2-Dibromäthan verwendet wurden. Die immobilisierte Urease/AIuminiumoxid-Zusammensetzung besaß eine Aktivität von etwa 10001. U./cm³.

Diese immobilisierte Urease/Aluminiumoxid-Zusammensetzung wurde in eine Röhre gepackt und zur Analyse von Harnstoff proben gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 verwendet. Es wurde ein Eichdiagramm hergestellt, indem die Änderung der elektromotorischen Kraft (in Millivolt) gegen die Harnstoffkonzentration von drei Serumproben mit 14, 28 und 70 mg Blut-Harnstoff-Stickstoff/100 ml Serum aufgetragen ss wurde. Diese Serumproben verursachten eine durchschnittliche Änderung von 70,90 und 111 Millivolt.

Teil B

Zwei Blutserumproben, die gemäß einer Kranken- (.0 hausanalyse 12,2 und 30,7 mg Blut-Harnstoff-Stickstoff/ 100 ml Serum enthielten, wurden gemäß dem Verfahren von Teil A dieses Beispiels analysiert. Auf der Basis des Eichdiagrammes zeigte die potentiometrische Reaktion an, daß die Serumproben 12,2±0,4 und 30,8±0,6mg (>s Blut-Harnstoff-Stickstoff/100 ml Serum aufwiesen.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei dem oben beschriebenen Verfahren zur Blut-Harnstoff-Stickstoff-Analyse erhalten, wenn als immobilisiertes Enzymbett ein Urease/Acrylamid-Gel eingesetzt wurde, das nach dem Verfahren des Artikels von Hicks und Updike, der vorstehend erwähnt wurde, hergestellt worden war. Ein derartiges zusammengesetztes Gel kann hergestellt werden, indem man 1,0 ml einer man 0,1 ml einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 400 mg Acrylamid enthält. 4,0 ml einer Lösung der gleichen Puffersubstanz, die 23 mg N,N-Methylen-bis-(acrylamid) enthält, 1,0 ml der gleichen Pufferlösung, die 10 mg Urease enthält, und 0,03 mg Riboflavin sowie 0,03 mg Kaliumpersulfat zum Katalysieren einer Photopolymerisationsreaktion reagieren läßt. Dieses Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad gerührt, während es mit einem Anstrahler photolysiert wurde. Die Gelbildung tritt in etwa 10 Minuten ein. Das Gel wurde auf mechanischem Weg dispergiert und mit 0,1 M Phosphatpufferlösung gewaschen, bevor es gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 eingesetzt wurde.

Ähnliche Ergebnisse bei dem oben beschriebenen Verfahren zur Blut-Harnstoff-Stickstoff-Analyse wurden erhalten, wenn das immobilisierte Enzymbett aus einer Urease/Kaolinit-Zusammensetzung hergestellt worden war, die nach dem Verfahren des Artikels von Sundaram und Craok, der vorstehend erwähnt wurde, zubereitet wurde. Eine derartige Zusammensetzung kann hergestellt werden, indem man 200 g pulverisiertes Kaolinit (durchschnittliche Partikelgröße kleiner als 0,1 μ), das in 8 ml Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung suspendiert ist, mit 12 mg Urease in einem Reaktionsgefäß bei 30°C unter Rühren 20 Minuten reagieren läßt. Die entstandene immobilisierte Urease/ Kaolinit-Zusammensetzung wurde gewaschen, um die restliche lösliche Urease zu entfernen, bevor die Zusammensetzung in das Verfahren von Beispiel 1 eingeführt wurde.

Ähnliche Ergebnisse in dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Blut-Harnstoff-Stickstoff-Analyse wurden erhalten, als das immobilisierte Enzymbett nach dem vorstehend erwähnten US-Patent 35 19 528 hergestellt wurde. Eine derartige Zusammensetzung kann hergestellt werden, indem man Urease chemisch an 96%iges Quarzglaspulver (etwa 100 mesh) mit einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 0,1 μ bindet. Daher wurden 1,0 g des porösen Glanzes mit 50 ml einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthosilan in Toluol kombiniert. Dieses Gemisch wurde über Nacht unter kontinuierlichem Rückfluß gerührt, filtriert und mit Aceton gewaschen. Nach weiterer Reaktion mit p-Nitrobenzoesäure und Reduktion der eingearbeiteten Nitrogruppe und deren nachfolgender Diazotierung ließ man das auf diese Weise aktivierte poröse Glas mit 10 mg Urease in 10 ml 0,05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung (pH-Wert 7,5) reagieren. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 5°C gerührt, abfiltriert und mit einer Pufferlösung gewaschen, bevor es in dem Verfahren von Beispiel 1 eingesetzt wurde.

Ähnliche Ergebnisse bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Blut-Harnstoff-Stickstoff-Analyse wurden erhalten, wenn als immobilisiertes Enzymbett eine Urease-Nylon-Zusammensetzung eingesetzt wurde, die nach dem Verfahren des vorstehend erwähnten Artikels von Inman und Hornby hergestellt worden war. Bei dem Nylonmaterial handelte es sich um ein Typ 6-Polymerisat mit niedrigem Molekulargewicht in Pulverform (120—150 mesh). Die Vorbehandlung des Nylonmaterials mit Glutaraldehyd wurde ausgeführt,

indem 250 mg des pulverisierten Nylons in 10,5 ml von 12,5°/oigem (Gewicht pro Volumen) Glutaraldehyd suspendiert wurden. Die zuletztgenannte Reagenz wurde in einer 0,1 M Natriumborat-Pufferlösung, deren pH-Wert auf 8,5 eingestellt worden war, gelöst Das Nylon-Glutaraldehyd-Gemisch wurde 20 Minuten lang schnell bei 0°C gerührt und dann auf einem Trichter aus gesintertem Glas abfiltriert und mit einer 0,2 M Natriumboratpufferlösung gewaschen. Das gewaschene aktivierte Nylonpulver wurde in 5 ml einer Ureaselö-

sung, die 10 mg Urease enthielt, 25 Mikromol Äthylendiamintetraessigsäure und 5 Mikromol Mercaptoäthanol in 0,05 M KrkPCVPufferlösung, die mit verdünntem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt war, suspendiert Das Urease/Nylon-Gemisch wurde 16 Stunden lang bei etwa 1°C gerührt Die Suspension der immobilisierten Urease/Nylon-Zusammensetzung wurde mit einer 0,2 M Natriumchloridlösung zur Entfernung der nichtreagierten Urease gewaschen, wonach sie in

ίο das Verfahren von Beispiel 1 eingeführt wurde.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Harnstoffbestimmung in einer wäßrigen Probe, bei dem Harnstoff mittels Urease s hydrolysiert, der entstandene Ammoniak nach Diffusion durch eine hydrophobe Membran bestimmt und anschließend die Ammoniakwerte in die äquivalente Probenharnstoffmenge umgerechnet werden, dadurch gekennzeichnet, daß die n> Probe über in einer Hydrolysezone immobiliersierte Urease geleitet und in dieser Zone unter Bildung von Ammonium-Ionen hydrolysiert wird, daß die Hydrolysemischung aus der Hydrolysezone entfernt und ihr pH-Wert auf mindestens etwa 11 angehoben ι s wird, am die Ammonium-Ionen enthaltende Mischung in eine wäßrige Ammoniaklösung zu überführen, und daß der durch die Membran diffundierte Ammoniak in einem Elektrolyten gelöst und der daraus entstandene Anstieg des pH-Wertes i<> im Elektrolyten potenliometrisch bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige, Harnstoff enthaltende Probe eine wäßrige Lösung ist, die auf einen pH-Wert von etwa 5 bis 9 abge^uffert ist. ^

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß als Elektrolyt eine verdünnte wäßrige Lösung von Ammoniumchlorid verwendet wird.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens \n nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch

a) eine einen Probeneinlaß und einen Auslaß für das Hydrolyseprodukt aufweisende Hydrolysekammer, die immobilisierte Urease enthält, vs

b) eine mit dem Auslaß für das Hydrolyseprodukt verbundene Mischkammer mit einem Einlaß für eine Base, einem Mischer zum Vermischen des Hydrolyseproduktes mit der Base und einem Auslaß für das entstandene Gemisch,

c) eine hydrophobe, ammoniakgaspermeable Membran, deren eine Fläche in innigem physikalischem Kontakt mit der aus dem Auslaß der Mischkammer strömenden Flüssigkeit steht und deren gegenüberliegende Fläche einen Teil eines Reservoirs an flüssigem Elektrolyten derart bildet, daß sich der Elektrolyt in innigem physikalischem Kontakt mit dieser gegenüberliegenden Fläche befindet,

d) eine pH-sensitive Elektrode, die in den Elektrolyten eingetaucht und elektrisch so geschaltet ist, daß sie auf ein Ansteigen des pH-Wertes in dem Elektrolyten anspricht.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Urease in der Hydrolysekammer auf einem Bett aus einem festen Trägermaterial immobilisiert ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischer magnetisch betätigt werden kann.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran eine dünne Lage aus porösem Kunststoff mit einer Stärke von etwa 0,1 bis etwa 10 mil, einer Porosität von etwa 10% bis etwa 85% und einem durchschnittlichen Porendurchmesser von etwa 0,05 bis etwa 10 μ ist.