DE2804117A1

DE2804117A1 - Verfahren zur bestimmung von bakterienkonzentrationen durch lumineszenz

Info

Publication number: DE2804117A1
Application number: DE19782804117
Authority: DE
Inventors: Chris J Plakas
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-01-31
Filing date: 1978-01-31
Publication date: 1978-08-03
Also published as: GB1601031A; GB1601032A; US4144134A

Description

DIPLOM-CHEMIKER

DR. ERICH O. E. UMLAUF

PATENTANWALT D-8 MÜNCHEN 6O. POSTFACH ΊB U 4 1

Dr. Erich O.E. Umlaut, D-8 München 60, P.O.Box «8

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2329 D-8 München 60

Dinkelsbühler Str. 27

31. Januar 1978

Anwaltsakte-Nr.: 2329

CHRIS J. PLAKAS Alexand? i a, Virginia / USA

Verfahren zur Bestimmung von Bakterienkonzentrationen

durch Lumineszenz

C/E

809831/0911 — Ο mm

(089) 878082 87125 26

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Postscheckkonto: München 22 49-803

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Mikroben-Zellen in einer Probe, und insbesondere betrifft die Erfindung ein neues Verfahren zur Bestimmung von mikrobiellem, reaktionsfähigen Material durch Biolumineszenz- oder Chemilumineszenz-Analyse.

Die zur Zeit verwendeten Verfahren zur Bestimmung von mikrobiellen Gehalten durch Lumineszenz-Analyse umfassen im allgemeinen die Inkubation und Extraktion von Mikroben-Zellen in 0,1- bis 1 ml-Volumina einer wässerigen Probe in einer Küvette, Injektion eines als Reagens dienenden Materials in die Probe oder umgekehrt, und Bestimmung der nachfolgenden Lumineszenz durch Photoemissionsdetektoren. Wenn die Probe sowohl mikrobielle als auch nicht-mikrobielle Zellen enthält, wird das Verfahren zur Bestimmung von mikrobiellen Zellen komplizierter. Der schwerwiegendste Nachteil aller Volumen-Reaktionssysteme besteht darin, daß sie zu unempfindlich sind, da diese Verfahren lediglich die Bestimmung von mehr als 10 mikrobiellen Zellen pro 0,1 ml-Probe ermöglichen. Offensichtlich ist dies auf die Verdünnung des reaktionsfähigen Materials in der wässerigen Probe, das begrenzte Angebot an Sauerstoff, der eine notwendige Komponente in dem Reaktionsverfahren ist, und die Anwesenheit von anderem reaktionsfähigen Material in der Probe zurückzuführen. Ein Volumen-Reaktionssystem ist in der

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2 b Ü Λ 1 1 ?

US-Patentschrift 3 7^5 090 beschrieben. Ferner lehren die US-Patentschriften 3 69Ο 832 und 3 940 250, sowie die US-Patentanmeldung 659 53^ die Bestimmung von reaktionsfähigem Material aus Zellen durch Lumineszenz-Reaktion. Die Verfahren der beiden zuletzt genannten US-Patentschriften, sowie der vorstehend erwähnten US-Patentanmeldung, lassen eine Bestimmung von unterhalb etwa 10 Mikroben-Zellen pro 0,1 ml nicht zu, noch ermöglichen sie die Bestimmung einer relativ kleinen Anzahl von Mikroben-Zellen bei Anwesenheit einer großen Anzahl von nicht-mikrobiellen Zellen, wie beispielsweise im Falle von verunreinigenden Mikroben unter den gewünschten Zellen von Milch oder Blut.

Die vorliegende Erfindung überwindet diese Schwierigkeiten der bekannten Methoden und Vorrichtungen und schafft ein Verfahren zur Bestimmung von reaktivem mikrobiellen Material in einer Probe durch Lumineszenz bei einem sehr weiten Bereich der mikrobiellen Konzentration, einschließlich von Gehalten unterhalb solcher Gehalte, bei welchen die von den Reagentien selbst emittierte Lumineszenz (d.h. endogenes Licht) die durch Wechselwirkung von reaktivem Material und Reagens emittierte Lumineszenz übertrifft.

Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme der Vorrichtungen des Standes der Technik, indem sie ein Verfahren

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für ein selektives öffnen und Aufbrechen der nicht-mikrobiellen Zellen in der Probe und ein Wegspülen dieser Anteile der nicht-mikrobiellen Zellen schafft, die mit dem Reagens reagieren könnten, bevor die mikrobiellen Zellen aufgebrochen worden sind. Auf diese Weise wird das reaktionsfähige, nicht-mikrobielle Material aus der Probe entfernt, bevor die Untersuchungen in Angriff genommen werden, wie sie in den zuletzt genannten drei Veröffentlichungen beschrieben wurden.

Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Einführen von Reaktionskomponenten in dünne Schichten, um ein adäquates Sauerstoffangebot für die Reaktion sicherzustellen. Sie schafft ferner ein Verfahren für den Abbau und zum Herausfiltern von nicht-mikrobiellem, reaktiven Material in Milch, Säften und anderen Getränken, festen Nahrungsprodukten, Petroleumprodukten, Körperflüssigkeiten und anderen Flüssigkeiten und Feststoffen. Der Ausdruck "Abbau" umfaßt das Spalten von größeren festen Strukturen und das Aufbrechen der Zellwände des gesamten nicht-mikrobiellen zellulären Materials.

Die anliegende Zeichnung gibt die Beziehung zwischen der Lumineszenz-Intensität und der mikrobiellen Konzentration für Proben von E. coli wieder.

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Die Gegenwart einer relativ kleinen Anzahl von mikrobiellen Zellen in einer Probe, die hauptsächlich nicht-mikrobielle Zellen enthält, kann bestimmt werden, indem man die Probe zur Spaltung von irgendwelchen in der Probe vorhandenen Feststoffen behandelt, die Zellwände der gesamten nicht-mikrobiellen Zellen für eine Extraktion des darin enthaltenen, nicht-mikrobiellen, reaktiven Materials aufbricht, die Probe filtriert, um das gesamte extrahierte Material wegzuspülen, die Zellwände der Mikroben-Zellen zur Extraktion des darin enthaltenen, mikrobiellen, reaktiven Materials aufbricht, vorzugsweise das mikrobielle, reaktive Material als unverdünnten Rückstand auf der Filteroberfläche zurückhält, ein Lumineszenz-hervorrufendes Reagens zur Sättigung des extrahierten, mikrobiellen, reaktiven Materials einführt, vorzugsweise während sich ein Rückstand auf der Filteroberfläche befindet, und die durch Reaktion zwischen dem Reagens und dem mikrobiellen, reaktiven Material emittierte kennzeichnende Lumineszenz-Intensität bestimmt und aufzeichnet. In den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Zellwände des nicht-mikrobiellen Materials durch den Einsatz eines Enzyms aufgebrochen, das so ausgewählt ist, daß es die besonderen, nicht-mikrobiellen Zellen, die vorhanden sind, angreift, während es eine minimale Wirkung auf mikrobielle Zellen hat.

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Es werden zum Abbau der festen Teile der Probe und zur Freisetzung von nicht-mikrobiellem,* reaktiven Material ohne Beschädigung der mikrobiellen Zellen ausgewählte Chemikalien und hydrolysierende Enzyme eingesetzt. Eine kleine Menge Dioctylnatriumsulfosuccinat, Octylphenoxypolyathoxyäthanol oder irgendeines anderen grenzflächenaktiven Mittels wird der Probe zur Herabsetzung der Oberflächen- und Grenzflächenspannung für eine erleichterte Filtration durch ein Membranfilter, gewöhnlich ein solches mit einer mittleren Porengröße von Oj45 Mikron j zugesetzt. Falls erforderlich, werden nach der Filtration zur vollständigen Entfernung von nichtmikrobiellem, reaktiven Material Spülflüssigkeiten verwendet. Die auf dem Filter zurückgebliebenen Mikroben-Zellen werden dann für eine Extraktion des mikrobiellen, reaktiven Materials aufgebrochen. Es gibt zahlreiche Extraktionsvorrichtungen; beispielsweise kann eine Extraktion bewirkt werden, indem man Dämpfe von flüchtigen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Äther oder Aceton, durch die Filtereinheit hindurchpreßt. Nicht-chemische Mittel der Extraktion, wie beispielsweise Ultraschall und Wärme, können ebenfalls angewandt werden. Eine in die Austrittsplatte der Filtrationseinheit eingeführte Heizwendel extrahiert die Zellen zufriedenstellend. Die in der derzeitigen Technik besonders brauchbaren Extraktionsmittel sind Methylenchlorid, Salpetersäure und Dioctylnatriumsulfosuccinat.

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Die Menge an eingesetztem, flüssigen Extraktionsmittel variiert von 0,010 bis 0,025 ml, je nach der Größe der für die Extraktion verwendeten Pilterflache. Für Filterflächen mit Durchmessern zwischen 10 und 20 ram sind 0,015 ml an extrahierendem Medium ausreichend. Ein Teil der Extraktionsflüssigkeit verdampft von dem Filter, und ein Teil davon wird in einigen wenigen Sekunden von dem Filter absorbiert, wodurch das extrahierte reaktive Material unverdünnt auf der Filteroberfläche belassen wird.

Das Reagens wird dann auf die Filteroberfläche zur Sättigung der Reaktionsfläche aufgesprüht. Das unverdünnte reaktive Material reagiert unmittelbar mit dem Reagens. Für eine Biolumineszenz-Analyse ist das bevorzugt eingesetzte Reagens eine Luciferase/Luciferin-Mischung, die in gefriergetrocknetem Zustand von der Firma Du Pont und anderen Zulieferern erhalten werden kann. Die Konzentration beträgt 0,71 mMol Luciferin und 100 Einheiten Luciferase, verdünnt in 0,5 ml bis 0,75 ml TRIS-Puffer mit zugesetzten Mg⁺⁺-Ionen. Der TRIS-Puffer kann ein TRIS-Mg-Puffer von der Firma Fisher Scientific Co. oder ein TRIZMA-Puffer T3753 von der Firma Sigma Co. sein.

Für eine Chemilumineszenz-Analyse ist das bevorzugte Reagens eine Luminol-Lösung mit Natriumperborat oder Wasser-

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stoffperoxid. Gleiche Teile der Luminol-Lösung ( 5 x 10 Mol oder stärker) und Natriuraperborat (3>846 g pro Liter Wasser) werden gemischt oder ausreichend Wasserstoffperoxid zu der Luminol-Lösung zugegeben, um diese auf eine Konzentration von 1 % zu bringen.

In Volumen-Reaktionssystemen, wo reaktive Materialien und Reagens in eine Küvette eingebracht werden, ist die Empfindlichkeit beim unteren Ende auf 10 bis 10^ mikrobielle Zellen pro Probe begrenzt. Dies ist dem durch die Reagens-Materialien emittierten endogenen Licht zuzuschreiben. Beispielsweise lumineszieren Luciferase/Luciferin-Enzym (in der Biolumineszenz-Analyse eingesetzt) und Luminol (in der Chemilumineszenz-Analyse verwendet) in ihrem natürlichen Zustand. Der so emittierte Lumineszenzbetrag ist äquivalent der Reaktion von etwa 10 bis 10-³ mikrobiellen Zellen pro Analyse nach Extraktion und Umsatz mit diesen Reagentien. Die Ursache dieser Hintergrund-Lumineszenz konnte noch nicht eindeutig bestimmt werden. Es wurden bisher einige Arbeitsweisen verwendet, um die Intensität dieser Lumineszenz herabzusetzen, jedoch wurden bis jetzt keine signifikanten Verbesserungen erzielt. Die Bestimmung von reaktivem Material, das Licht in Mengen von unterhalb der Mengen an endogenem Licht emittiert, wird gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht, wenn unverdünntes reaktives Material

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direkt mit der Reagens-Lösung reagiert. Das mikrobielle, reaktive. Material wird aus den Zellen durch chemische oder andere Mittel extrahiert, welche die Zellen zur Freisetzung des mikrobiellen, reaktiven Materials aufbrechen, ohne dieses zu entfernen oder zu verdünnen. Wenn unverdünntes, mikrobielles, reaktives Material mit dem in Überschuß zugeführtem Reagens gemischt wird, reagieren alle Moleküle des reaktiven Materials, wodurch die quantitative Genauigkeit erhöht wird.

Da der Filter der Luft ausgesetzt wird, ist, wenn sich das Reagens fortschreitend zur Bedeckung der das reaktive Material tragenden Fläche ausbreitet, Luft zugegen, um den von den reagierenden Molekülen benötigten Sauerstoff zur Verfügung zu stellen. Die Dicke der Reaktionsschicht liegt im Bereich von 0,05 bis 0,5 mm, was eine adäquate Sauerstoffzufuhr zu allen reagierenden Molekülen ermöglicht und demzufolge läuft die Reaktion vollständig ab.

Da in dem vorliegenden Verfahren kleine Mengen an Reagens eingesetzt und nicht-mikrobielle, reaktive Materialien entfernt werden, ist die Reaktionskurve der mikrobiellen Konzentration gegen die Lumineszenz-Intensität linear. Der niedrigste Punkt der Linearität fällt annähernd mit dem Wert des durch das Reagens-Material emittierten endogenen

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Lichts zusammen und hängt von den Eigenschaften des Reagenses und seiner Herstellung ab. Annähernd 0,05 ml eines jeden der in dieser Arbeitsweise verwendeten Reagentien emittiert eine Lumineszenz, die äquivalent der Reaktion von 500 bis 1000 mikrobiellen Zellen (E. coli) ist. Wenn auch das Reagens zur Verringerung der endogenen Lichtmenge gereinigt sein kann, ändert sich die Reaktionskurve in ihrer Steigung, wie immer auch die endogene Lichtmenge sein mag, und verläuft linear zur Konzentration Null, wie dies in der anliegenden Zeichnung gezeigt wird. Dieses Phänomen tritt auf, weil die Lichtintensität der Reaktion unterhalb der normalen Intensität des endogenen Lichts liegt und gleichzeitig eine Herabsetzung der endogenen Lichtmenge infolge der Neutralisation des Reagenses durch das mikrobiel-Ie, reaktive Material in der Reaktion im Bereich zwischen Null und der normalen endogen Lichtmenge vorliegt. Demzufolge steuert eine Erhöhung oder eine Verringerung des mikrobiellen, reaktiven Materials in dem Bereich unterhalb der normalen endogenen Lichtmenge die aktive Menge des Enzyms, das seinerseits die Intensität des endogenen Lichts beeinflußt, welches als ein Indikator der Menge des in die Reaktion einbezogenen mikrobiellen, reaktiven Materials verwendet wird. Da die Werte der Lumineszenz-Intensität in Konzentrationen in der Nähe von derjenigen des endogenen Lichts doppelt bewertet sein können (d.h. die Konzentra-

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tionskurve zweimal kreuzen), wird eine Doppelprobe-Filtration oder eine Doppelprobe-Verdünnung (vgl. Beispiel 12) die Steigung und die Richtung der Konzentrationskurve zeigen und so das Auftragen der Kurve erleichtern.

Zur Durchführung einer bakteriologischen Analyse von verschiedenen Nahrungsmittel-Produkten müssen die Proben abgebaut und durch ein Membranfilter gepreßt werden, das mikrobielle Zellen zur Prüfung zurückhält. Eine Anzahl von Chemikalien und Enzymen wurden für den Abbau und die Hydrolyse von verschiedenen Proben untersucht, jedoch sind lediglich einige wenige für die Filtration von für Lumineszenzversuche hergestellten Proben wirksam.

Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von niedrigen Gehalten an mikrobiellen Zellen in Proben von Flüssigkeiten und abgebauten Feststoffen. Die nicht-mikrobiellen, reaktiven Materialien in einer Probe werden durch selektive Verwendung von Enzymen löslich gemacht und die Probe zur Entfernung des flüssigen Teils der löslich gemachten Materialien filtriert, wobei die Mikroben-Zeilen auf dem Filter zurückgehalten werden. Die Mikroben-Zellen werden dann aufgebrochen, um unverdünntes, reaktives Material freizulegen, welches dann auf dem Filter mit einem Reagens-Material in Kontakt ge-

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bracht wird, um eine Lumineszenz-Reaktion hervorzurufen. Die Stärke der resultierenden Lumineszenz wird als Maß der Konzentration der Mikroben-Zeilen in der Probe gemessen.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Diese nichteinschränkenden Beispiele sind für gewisse Ausführungsformen erläuternd, die dem Fachmann zeigen sollen, wie die vorliegende Erfindung praktisch durchgeführt wird und die die beste Verfahrensweise aufzeigen.

Eine geeignete Vorrichtung für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung ist in der US-Patentanmeldung 659 534, sowie in den US-Patentschriften 3 69Ο 832 und 3 940 250 beschrieben.

Bevor die Bestimmung der Mikroben-Konzentrationen in der Probe durchgeführt wird, ist es erforderlich, für jede von den Herstellern erhaltene Enzymlieferung die Wirksamkeit der Enzyme zu bestimmen (vgl. Beispiel 11). Die so bestimmte Enzymwirksamkeit zeigt die notwendige Enzymkonzentration für die Mikroben-Bestimmung an.

Die Bestimmung durch Chemilumineszenz-Analyse wird unter Verwendung einer Luminol-Lösung durchgeführt. Das Luminol-

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Reagens wird durch Auflösen von 0,855 g Luminol (Luminol ist 5-Amino-2,3-dihydro-l,4-phthalazindion) pro 50 ml einer I,5n-Natriumhydroxid-Lösung (l,5n-NaOH = 60 g NaOH pro Liter Wasser).

Die Bestimmung durch Biolumineszenz-Analyse ist ähnlich wie die Chemilumineszenz-Analyse, mit der Ausnahme, daß Luciferase/Luciferin-Enzymlösung anstelle der oben beschriebenen Luminol-Lösung verwendet wird. Luciferase/Luciferin ist von der Firma Du Pont Company erhältlich.

Beispiel 1 Milch-Analyse

Vor Beginn der Analyse müssen dii in der Milch vorkommenden freien Porphyrine und irgendwelche Spuren von Eisen aus den Milchbehältern entfernt werden. Dies geschieht wie folgt:

Zur Porphyrinentfernung werden 1 Volumprozent Wasserstoffperoxid zu der Milchprobe zugegeben und diese 2 bis 5 Minuten zum Abbau stehengelassen.

Zur Entfernung des löslichen Eisens gibt man 1 Teil einer EDTA-Lösung zu 9 Teilen Milch hinzu. Die EDTA-Lösung enthält 16,8 g Äthylendiamintetraessigsäure in 250 ml Wasser. Zur Erleichterung der Filtration kann TRITON X-IOO (Octylphenoxypolyäthoxyäthanol), ein grenzflächenaktives Mittel,

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das von der Firma Rohm und Haas Corporation bezogen werden kann3 zu der Milchprobe zugesetzt werden. Für eine Probe von 1 ml Milch werden 0,1 ml einer Ivolumprozentigen Lösung von Triton X verwendet. Dioctylnatriumsulfosuccinat kann ebenfalls als grenzflächenaktives Mittel verwendet werden.

Verfahren
Die Analyse der Milchprobe wird wie folgt durchgeführt:

(1) Der p^-Wert der Milch wird durch Zusatz von Salpetersäure zur Erniedrigung des p_H-Wertes oder durch Zusatz von Natriumhydroxid zur Erhöhung des p^-Wertes auf 8 eingestellt.

(2) Zur Beschaffung von Bakterien-Zellen, die frei von in der Milch enthaltenen nicht-bakteriellen Zellen (weiße Zellen und Proteine) sind, wurde die Probe mit Rhozyme 4l-Protease-Lösung gemischt. Rhozyme 4l ist von der Firma Rohm und Haas Corporation zu beziehen. Die Rhozyme 4l-Lösung wird wie folgt hergestellt: 5 nil Wasser werden zu 1 g Rhozyme 41 zugegeben und 12 Stunden bei 10° C zur vollständigen Durchmischung stehengelassen. Die Mischung wird bei 12 000 RCF χ G zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch ein 0,2-Mikron-Filter filtriert. 1 ml dieser Rhozyme-Protease-Lösung wird mit einer 9 ^ml Milchprobe gemischt und 10 Minuten lang zum Abbau stehengelassen. Der Abbau-Prozeß bricht die nicht-bakteriellen Zellen auf. Die

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Probe kann dann zur Erzielung einer besseren Filtration in 4 oder 5 Teilen Wasser verdünnt werden.

(3) Die Probe wird dann zur Entfernung des flüssigen Teils der Probe, der die vorausgehenden Inhalte der aufgebrochenen, nicht-bakteri&len Zellen enthält, filtriert. Die bakteriellen Zellen, die durch das Rhozyme nicht beeinflußt wurden, werden auf dem Filter zurückgehalten. Bei dieser Filtration wird der Filterstempel abgedichtet und dann 1 bis 5 ml der abgebauten und verdünnten Milchprobe durch die Filtereinheit gepreßt.

(4) Der Filter wird dann mit 1 bis 5 ml Wasser gespült.

(5) Dann wird zur Entfernung der gesamten Flüssigkeit von dem Filter Luft mit einer Injektionsspritze aus Plastik durch das Filter geblasen.

(6) 0,015 ml eines 0,In-HNO,-Extraktionsmittels wird auf das Filter (für einen Filterbereich von 10 mm) mit einer 0,05 ml Injektionsspritze unter Verwendung einer Nadellänge von 52 mm aufgebracht, um ein Durchstoßen des Filters zu vermeiden. Für die Extraktion ist 1 Minute vorgesehen. Diese Extraktion bricht die bakteriellen (Mikroben-)Zellen auf und legt reaktives, bakterielles Material, wie beispielsweise ATP (Adenosintriphosphat) und Hämoglobin frei.

(7) Das Filterband wird bis zur Reaktionsstellung bewegt.

(8) Das Instrument wird auf Null eingestellt und der Photoelektronen-Vervielfacher-Verschluß geöffnet.

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(9) Eine 0,05 ml-Injektionsspritze, enthaltend 0,04 ml Luminol-Reagens wird in den Reagens-Durchlaß eingeschoben und vorsichtig gedrückt, bis der Gummistopfen durchstoßen ist. Das Luminol-Reagens wird sehr ruhig und allmählich auf das Filter gespritzt, wobei die Taste für den Beginn der Lumineszenz-Messung gedrückt wird und so eine Bestimmung der Bakterienzahl erfolgt.

Dieses in den vorstehenden Stufen (1) bis (9) beschriebene Verfahren wird so viele Male wiederholt, wie es erforderlich ist, mit verschiedenen Verhältnissen der Enzym-Lösung zur Probe in der obigen Stufe (2), um sicherzustellen, daß das Lumineszenz-Ergebnis innerhalb eines geeigneten Bereiches für eine genaue Bestimmung an der Vorrichtung liegt. Das geeignetste Verhältnis von Enzym-Lösung zur Probe wird für die Bestimmung der Mikroben-Zahl in der zu analysierenden Probe verwendet.

Bestimmungen I bis IV

Das vorstehend in den Stufen (1) bis (9) beschriebene Verfahren wurde fünfmal durchgeführt. Die Mikroben-Zahl wurde bestimmt und ein Durchschnitt der fünf Zahlen genommen. Die mikrobielle Konzentration der Probe wurde auf Basis des Durchschnittswertes berechnet.

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Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Verwendung einer Luminol-Perborat-Lösung anstelle des Luminol-Reagenses in Stufe (9) durchgeführt. In dieser Lösung wurde 1 Teil Luminol-Lösung mit 1 Teil Natriumperborat-Lösung (3,846 g NaBO, pro Liter Wasser) gemischt.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Verwendung einer Luminol-Peroxid-Lösung anstelle des in der Stufe (9) verwendeten Luminol-Reagenses durchgeführt. In dieser Lösung wurde 1 Gewichtsprozent Wasserstoffperoxid-Lösung zu der Luminol-Lösung zugesetzt.

Beispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde bis zur Stufe (8) durchgeführt. Die mikrobielle Konzentration in der Probe wurde durch Biolumineszenz-Analyse bestimmt.

Luciferase/Luciferin-Mischung, die von der Firma Du Pont Company bezogen werden kann, wird als Lumineszenz-Reagens anstelle der Luminol-Lösung verwendet. Die angewandte Konzentration war 0,71 mMol Luciferin mit 100 Einheiten Luciferase, verdünnt in 0,5 bis 0,75 ml TRIS-Puffer. Die Stufe (9) wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt.

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Beispiel 5

Bei der Analyse von Fleisch- und Fischprodukten zur Bestimmung der mikrobiellen Konzentration in der Probe kann ein ähnliches Verfahren wie dasjenige für die Milchanalyse verwendet werden, da die Proteine von Fleisch- und Fischprodukten ebenfalls durch Proteasen aufgebrochen werden. Es wird das Verfahren von Beispiel 1 angewandt, wobei die Verdünnung der Protease zur Probe, bezogen auf das Gewicht, zwischen 0,5 und 5 % für Protease von 1000 Verflüssigungseinheiten lag. Wahlweise können die Verfahren der Beispiele 2, 3 oder 4 angewandt werden.

Beispiel 6

Die im Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise zum Bestimmen von in einer Probe vorhandenen Mikroben-Zellen durch die Verfahren des Probenabbaus, der Filtration, Extraktion und Reaktion von unverdünntem, reaktiven Material auf einer Filtermembran kann auf viele Proben angewandt werden, einschließlich Nahrungsmittel und Molkereiprodukte, Getränke, Petroleumprodukte, Alkohole und Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Urin, Blut etc. Körperflüssigkeiten enthalten verschiedenartige, nicht-bakterielle Zellen, wie beispielsweise Glykoproteine und rote und weiße Blutzellen, die durch Proteasen in einer ähnlichen Weise wie die weißen Zellen in der Milch abgebaut werden können. Die mikrobielle

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Konzentration in diesen Beispielen kann ebenfalls unter Verwendung der Verfahren der Beispiele 2, 3 oder 4 gemessen werden.

Beispiel 7

Natürliche Fruchtsäfte können mit Pektin-Enzymen zur Erleichterung der Filtration behandelt werden. Pektin-Enzyme brechen die Zellularstruktur der in den Säften suspendierten Fruchtstücke auf und setzen so Mikroben-Zellen frei, ohne deren Struktur zu schädigen. Pektin-Enzyme sind kommerziell verfügbar und werden von der Firma Rohm und Haas Company unter der Handelsmarke Pectinol und von anderen Herstellern unter verschiedenartigen Handelsnamen auf den Markt gebracht. Der p_H-Wert der Säfte sollte auf einen Wert zwischen 3 und 4,5 eingestellt werden und die Verdünnung des Pektin-Enzyms zur Probe sollte auf Gewichtsbasis 0,2 % und 1 % sein. Vor der Einführung der Pektin-Enzyme in die Saftprobe wird 1 Gewichtsteil Pektin-Enzympulver in 10 Teilen Wasser verdünnt und zur vollständigen Auflösung etwa 10 Stunden bei 10° C stehengelassen. Die Verdünnung wird dann durch ein 0,2-Mikron-Filter filtriert und 1 Teil mit 10 Teilen Natursaft gemischt und eine Zeitlang zur Hydrolyse stehengelassen, wobei der Zeitraum von der zellulären Konzentration der Säfte abhängt. Die Verfahren der Filtration, Extraktion und Reaktion können wie in den Bei-

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spielen I₃ 2, 3 oder 4 für Milchproben beschrieben, durchgeführt werden.

Beispiel 8 Gemüse und Früchte

Pektin-Enzyme brechen die Zellularstruktur der meisten Früchte und Gemüse auf und setzen so Mikroben-Zellen frei, ohne deren Struktur nachteilig zu beeinflussen. Pektin-Enzyme können für jede Probenart auf Standard-Werte eingestellt werden. Die Verdünnung von Pektin-Enzymen für Früchte und Gemüse ist ähnlich derjenigen, wie sie für Fruchtsäfte in. Beispiel 7 beschrieben wurde. Da Fasern von Gemüsen und Früchten nicht immer abbaubar sind, kann eine Vorfiltration vor der Untersuchung des flüssigen Teils der Probe notwendig sein. Die Verfahren der Filtration, Extraktion und Lumineszenz-Reaktion sind ähnlich denjenigen, wie sie in den Beispielen 1, 2, 3 oder 4 beschrieben wurden.

Beispiel 9

Um Stärkeprodukte abzubauen und Mikroben-Zellen in Präparaten für die Filtration freizusetzen, werden Diastasen und Amylasen, die Enzyme mit Stärke-verflüssigender Aktivität sind, zum Angriff auf die a-l,4-glucosidischen Bindungen der Stärke zur Umwandlung in Glucose, Maltose und Dextrine, eingesetzt. Beide Enzyme werden unter verschiede-

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nen Handelsnamen hergestellt und in den Handel gebracht, wie beispielsweise die Amylase als Tenase durch die Firma Miles Laboratories, und die Diastase als Rhozyme H-39 von der Firma Rohm und Haas Company. Tenase hat eine optimale Aktivität bei einem p^-Wert von 6 und einer Temperatur zwischen 20° und 90° C. Rhozyme H-39 hat eine optimale Aktivität bei einem p„-Wert von 6,1 und einer Temperatur von etwa 70° C.

Aus Stärkematerial hergestellte Nahrungsmittel-Produkte, wie beispielsweise Feingebäck und Brote können auf eine mikrobielle Konzentration durch Filtration, Extraktion und Reaktxonsverfahren überprüft werden, wenn das Stärkematerial hydrolysiert werden kann. Der ρ .-Wert der Probe muß vor dem Mischen mit der verflüssigenden Lösung auf einen Wei't von eingestellt werden. 1 Gewichtsteil Diastase oder Amylase wird mit 10 Teilen Wasser gemischt und 2 Stunden lang bei 10° C für eine Durchmischung stehengelassen. Die Verdünnung wird durch ein 0,2 Mikron-Filter zur Entfernung von irgendwelchen Mikroben-Zellen filtriert. 1 Gewichtsteil der Verdünnung wird mit 100 Teilen der Stärkeprobe gemischt. Die Trockenkonzentration von Enzym zu Stärke, beispielsweise zu Mehl, sollte 0,05 g zu 100 g sein. Da die erfindungsgemäße Arbeitsweise bevorzugt für eine rasche quantitative Bestimmung von Mikroben-Zellen Verwendung findet, ist die

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Zeit, die für eine totale Verflüssigung erforderlich ist, nicht verfügbar. Anstelle der totalen Verflüssigung wird die Mischung gut gerührt und der flüssige Anteil durch ein 0,45 Mikron-Filter filtriert. Wenn das 0,45 Mikron-Filter zu fein ist, wird die Mischung durch ein 10 Mikron-Filter vorfiltriert, um feste Teilchen abzutrennen. Der Verlust von irgendwelchen Bakterien durch dieses Verfahren wird bei der endgültigen Ablesung ausgeglichen. Die Verfahren für die Extraktion und die Reaktion sind ähnlich denjenigen, wie sie in den Beispielen 1, 2, 3 oder 4 beschrieben wurden.

Beispiel 10

Eine Lösung von quaternärem Ammoniumhydroxid kann ebenfalls zum Aufbrechen von Proteinen und nicht-mikrobiellen Zellen verwendet werden. 1 ml einer Ι,Οη-Lösung solubilisiert bis zu 250 mg einer Probe. Nach dem Mischen der Probe und der Lösung läßt man die Mischung zum Abbau bei 50° C 2 Stunden lang stehen. Die Probe wird dann durch ein 0,5 Mikron-Filter filtriert, das Mikroben-Zellen für die Extraktion und die Reaktion zurückhält.

Das Lumineszenz-Reagens wird eingeführt und in der gleichen Weise eingesetzt, wie dies in den Beispielen 1, 2, 3 oder beschrieben wurde.

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Beispiel 11

Um eine Lieferung eines Lumineszenz-Reagenses für den Einsatz bei diesen Untersuchungen zu eichen, wird eine Bakterien-Stammprobe , wie beispielsweise von E. coli, gezüchtet. Unter Verwendung eines Mikroskops wird die Anzahl der Bakterien pro Volumeinheit der Stammprobe durch Abzählen bestimmt. Die Stammprobe wird dann mit derjenigen Menge Wasser verdünnt, die erforderlich ist, um eine Standard-

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probe mit einem Gehalt von 10 Bakterien pro ml Standard-

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probe herzustellen. Dann wird eine Einheit der 10 -Standardprobe entnommen und mit 9 Einheiten Wasser zur Herstellung einer zweiten Standardprobe gemischt, die dann 10° Bakterien pro ml Standardprobe enthält. Dieses Verfahren wird entsprechend wiederholt und 9 weitere Standardproben mit Gehalten von ΙΟ⁸, ΙΟ⁷, ΙΟ⁶, ΙΟ⁵, 10**, 10³, 10², 10¹ und 10° Bakterien pro ml Standardprobe erhalten. Der p„-Wert einer jeden Standardprobe wird auf 8 eingestellt. 1 ml

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der 10 -Standardprobe wird auf das Filter gebracht und die Stufen (5) bis (9) wie in Beispiel 1 durchgeführt, um die Lieferung des in Stufe (9) verwendeten Luminol-Reagenses zu eichen. Der Versuch wird für 4 weitere 1 ml-Versuchsproben

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der 10 -Standardprobe wiederholt und die Ergebnisse der fünf Untersuchungen der 10 -Standardprobe gemittelt, um so einen Lumineszenz-Intensitätswert für die 10 -Standardprobe zu erhalten. Dieser Durchschnittswert der Lumineszenz-In-

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tensität wird auf einem Kurvenblatt mit logarithmischer Einteilung beider Achsen gegen die Mikroben-Konzentration aufgetragen. Die 5 Versuche werden für jede der 10 zusätzlichen Standardproben wiederholt und die erhaltenen Durchschnittswerte in das doppelt-logarithmische Kurvenblatt eingetragen. Die Kurve in der anliegenden Abbildung zeigt die Ergebnisse der Eichung einer derartigen Reagens-Lieferung. Diese Eichkurve wird für die anderen Versuche benützt, die mit der gleichen Reagens-Lieferung durchgeführt werden, um die Werte für die Bakterienzahl den verschiedenen Werten für die Lumineszenz-Intensität zuzuordnen.

Beispiel 12

Eine Probe einer unbekannten Konzentration wird untersucht, indem man eine 1 ml-Probe auf ein Filterpapier bringt und die Stufen (5) bis (9) von Beispiel 1 durchführt, den Test viermal wiederholt und nach Mittelwertsbildung in Stufe (9) einen Wert für die Lumineszenz-Intensität von 3»0 χ 10 erhält, was einer Mikroben-Konzentration von entweder

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1,0 χ 10 oder 7,0 χ 10 Mikroben pro ml entspricht. Bei einem zweiten durchgeführten Versuch unter Verwendung von 2 ml der gleichen Probe wurde ein Wert für die Lumineszenz-Intensität von 2,5 x 10 erhalten, was anzeigt, daß der Wert für die Konzentration von 1,0 χ 10 richtig war. (Hätte der zweite Versuch einen Wert für die Lumineszenz-Inten-

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sität von 4,00 χ IO ergeben, wäre der Wert von 7,0 χ 10 der richtige Wert für die Konzentration gewesen.)

In all den vorstehenden Beispielen, in welchen Parallelversuche durchgeführt und Durchschnittswerte genommen werden, können zahlreiche statistische Arbeitsweisen angewandt werden. So kann eine abweichende Anzahl von Proben eingesetzt, und Proben, die ziemlich weit vom Durchschnittswert abweichen, verworfen werden. Anstelle von 5 Untersuchungen könnten 7 Untersuchungen vorgenommen werden, wobei der höchste und der niedrigste Wert nicht berücksichtigt wird und die restlichen Werte gemittelt werden.

Bei Versuchen, bei denen mehr als ein Typ von nicht-mikrobiellen Zellen zugegen ist, wie beispielsweise bei Pleisch- und Gemüsesuppe, kann es notwendig sein, die Komponenten nacheinander gemäß ihrer ansteigenden Empfindlichkeit gegenüber der Extraktionsflüssigkeit zu eliminieren. Es wird erforderlich sein, Fleisch (Protein), Kartoffeln (Stärke) und Tomaten (Frucht) vor der Untersuchung einer derartigen Suppe auf Mikroben zu entfernen.

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Claims

IB J U 1 1 7 Patentansprüche

1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Zellen eines ersten Typs in einer Probe, die eine Mischung von Zellen des ersten Typs mit Zellen eines zweiten Typs enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man

(A) die Zellwände der Zellen des zweiten Typs aufbricht, um das darin enthaltene reaktive Material zu extrahieren,

(B) das aus den Zellen des zweiten Typs extrahierte Material entfernt,

(C) die Zellwände der Zellen des ersten Typs zur Extraktion des darin enthaltenen reaktiven Materials aufbricht,

(D) das aus den Zellen des ersten Typs extrahierte reaktive Material mit einem Lumineszenz-bewirkenden Reagens in Kontakt bringt, um Licht als Funktion der Menge des so in Kontakt gebrachten reaktiven Materials zu erzeugen, und

(E) die Menge des so erzeugten Lichtes bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Aufbrechens der Zellwände des zweiten Typs das In-Kontakt-bringen der Probe mit einem Enzym einschließt, welches die Zellwände der Zellen des zweiten Typs angreift.

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3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Entfernens des aus den Zellen des zweiten Typs extrahierten reaktiven Materials das Placieren der Probe auf ein Filter von geeigneter Porengröße für ein Zurückhalten der Zellen des ersten Typs, und das Auswaschen und Spülen des extrahierten reaktiven Materials durch das Filter umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Aufbrechens der Zellwände der Zellen des ersten Typs die Stufe des In-Kontakt-bringens der Zellen des ersten Typs mit einem Extraktionsmittel umfaßt, das aus der Gruppe bestehend aus Äther, Aceton, Methylenchlorid, Salpetersäure und Dioctylnatriumsulfosuccinat, ausgewählt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Aufbrechens der Zellwände der Zellen des ersten Typs die Stufe der Ultrabeschallung der Zellen des ersten Typs einschließt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Aufbrechens der Zellwände der Zellen des ersten Typs die Stufe des Erhitzens der Zellen des ersten Typs einschließt.

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7. Verfahren zur Verwendung einer Lumineszenz-Reaktion für die optische Bestimmung der Anwesenheit von Mikroben-Zellen in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mischung von Mikroben-Zellen und nicht-mikrobischen Zellen den nachfolgenden Stufen unterwirft :

(A) Abbau irgendwelcher Feststoffe in der Probe, um die Filtration zu erleichtern, die Mikroben-Zellen freizulegen und das reaktive Material aus den nieht-mikrobiellen Zellen der Probe ohne Beschädigung der Mikroben-Zellen zu extrahieren,

(B) Filtration der Probe auf einer Filteroberfläche zur Eliminierung des reaktiven Materials aus den nicht-mikrobiellen Zellen und zur Herstellung eines die Mikroben-Zellen enthaltenden Rückstandes,

(C) Aufbrechen der Mikroben-Zellen in dem Rückstand auf der Filteroberfläche zur Extraktion von unverdünntem, mikrobiellen, reaktiven Material auf der Filteroberfläche,

(D) In-Kontakt-bringen von unverdünntem, mikrobiellen, reaktiven Material und Reagens-Material zwecks Reaktion und anschließender Lichtemission, und

(E) Bestimmen und Aufzeichnen der so emittierten Lichtmenge als Anzeige der Menge des in der Probe vorhandenen mikrobiellen, reaktiven Materials.

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INSPECTED

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8. Verfahren nach Anspruch 7₃ dadurch gekennzeichnet, daß der Abbau der Feststoffe in der Probe und das Extrahieren von reaktivem Material aus den nicht-mikrobiellen Zellen durch Mischen der Probe mit einem hydrolysierenden Mittel bewirkt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch g e kennzei chnet, daß die Probe Früchte oder pflanzliche Produkte enthält und das hydrolysierende Mittel aus der Gruppe der Pektin-Enzyme ausgewählt ist, um die in den Zellularstrukturen derartiger Früchte oder pflanzlicher Produkte vorhandenen Pektine abzubauen und so die Mikroben-Zellen freizulegen und die Filtration zu erleichtern.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Stärke enthält und das hydrolysierende Mittel aus der Gruppe der Diastase-Enzyme ausgewählt wird, um derartige Stärkeproben abzubauen und so die Mikroben-Zellen freizulegen und die Filtration zu erleichtern.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Stärke enthält und das hydrolysierende Mittel aus der Gruppe der Amylase-Enzyme ausgewählt wird, um derartige Stärkeproben abzubauen und so

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die Mikroben-Zellen freizulegen und die Filtration zu erleichtern.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Proteine enthält und das hydrolysierende Mittel aus der Gruppe der Protease-Enzyme ausgewählt wird, um derartige Proteine zu solubilisieren und so irgendwelches nicht-mikrobielles, reaktives Material freizulegen.

13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Proteine enthält und das hydrolysierende Mittel quaternäres Anunoniumhydroxid ist, um derartige Proteine zu solubilisieren und so nichtmikrobielles, reaktives Material freizulegen.

14. Verfahren nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Aufbrechens der Mikroben-ZeIlen in dem Rückstand auf der Filteroberfläche durch Einführen von extrem kleinen Volumina an Extraktionsmittel zum Aufbrechen der Mikroben-Zellen bewirkt, dieses Extraktionsmittel verdampft und von dem Filtermaterial absorbiert wird und so keine Flüssigkeit zur Verdünnung des extrahierten Materials zurückgelassen wird.

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15· Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufbrechen der Mikroben-Zellen in dem Rückstand auf der Filteroberfläche durch Einführen von Gas und Dämpfen in die Filtrationseinheit zum Aufreißen der Mikroben-Zellen in einer trockenen Umgebung bewirkt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 7j dadurch gekennzeichnet daß die Stufe des Filterns der Probe auf einer Filteroberfläche die Filtration zur Entfernung aller flüssigen Anteile der Probe und das Spülen des Rückstands zur Entfernung des gesamten, nicht-mikrobiellen, reaktiven Materials umfaßt, damit auf der Filteroberfläche ein Probenrest zurückbleibt, der Mikroben-Zellen enthält.

17- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Aufbrechens ferner aufeinanderfolgende Stufen für das Aufbrechen von verschiedenartigen Zellen gemäß ihrer fortschreitenden Empfindlichkeit gegenüber extrahierender Flüssigkeit umfaßt.

18. Verfahren nach Anspruch "J₃ dadurch g e kennzei chnet, daß das In-Kontakt-bringen des mikrobiellen, reaktiven Materials und des Reagens-Materials das gleichmäßige Aufbringen des flüssigen Reagenses über

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das von dem Filter getragene, unverdünnte, reaktive Material einschließt.

19. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das In-Kontakt-bringen von mikrobiellem, reaktiven Material und Reagens-Material ferner das Einführen von Reagens und mikrobiellem, reaktiven Material in dünnen Schichten einschließt, um den Zutritt von Sauerstoff zu allen reaktiven Molekülen während der Reaktion und eine totale Reaktion von mikrobiellem, reaktiven Material zu ermöglichen und so eine Bestimmung der Mikroben-Konzentration unterhalb des Viertes des endogenen Lichts des Reagenses zu erlauben.

20. Verfahren zur Bestimmung von reaktivem Material aus Zellen in einer Probe durch Aufbrechen der Zellen, Extrahieren von reaktivem Material aus einer Probe, und In-Kontakt-bringen des reaktiven Materials mit einem Lumineszenzhervorrufenden Reagens zur Erzeugung von Licht mit einer Intensität, die eine Funktion der Menge des reaktiven Materials ist, gekennzeichnet durch eine Verbesserung für die Anwendung, wobei die Kurve der Funktion zwei zweideutige Werte der Menge des reaktiven Materials für niedrige Lichtintensitäten liefert, wobei man

(A) einen ersten Versuch mit einer gegebenen Probenmenge

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zur Bestimmung der Lichtintensität durchführt,

(B) falls die Lichtintensität im niedrigen und daher zweideutigen Bereich liegt, die Menge der Probe verändert und einen zweiten Versuch durchführt,

(C) den niedrigeren der beiden zweideutigen Werte aufzeichnet, falls die Versuche eine negative Steigung der Änderung in der Menge des Materials zur Intensitätsänderung haben, und den höheren der zwei Werte aufzeichnet, falls eine positive Steigung vorhanden ist.

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