DE2759961C2

DE2759961C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnstoff

Info

Publication number: DE2759961C2
Application number: DE2759961A
Authority: DE
Inventors: Jerry Williams Carmel Ind. Denney
Original assignee: AMERICAN MONITOR CORP INDIANAPOLIS IND US
Current assignee: AMERICAN MONITOR CORP INDIANAPOLIS IND US
Priority date: 1976-11-10
Filing date: 1977-10-31
Publication date: 1984-08-09
Also published as: JPS5360694A; US4105408A; DE2748857A1; FR2370978A1; DE2759967C2; DE2759962C2; CA1102226A; FR2370978B1; IT1088032B; US4074972A; US4131425A; US4131430A; DE2748857C2; JPS6147382B2; BE860620A; US4131429A

Description

OR,

15

21)

Ri = - H oder - CHj und R₂ = -H, - OH oder - OCHj

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chromogene Verbindung 1-Hydroxy- oder 1,3-Dihydroxynaphlhalln verwendet wird. .ίο

3. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, bestehend aus einer sauren Lösung €.nex chromogenen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß die chromogene Verbindung unter den Naphthalinderivaten ausgewählt Ist, die durch die folgende allgemeine Formel mit den ihnen zugeordneten Symbolen dargestellt werden:

OR₁

41)

R₁ -R₂ =

- H oder - CHj und -H, - OH oder - OCH₃

50

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnstoff In einer flüssigen Probe durch Behandeln der Probe mit einer sauren Lösung des o-Phthalaldehyds und einer sauren Lösung einer chromogenen Verbindung, die mit dem Reaktionsprodukt des Harnstoffs und o-Phihalaldehyds einen Chromophor bildet, und durch Messen der Extinktion der so gebildeten gefärbten Lösung sowie ein Reagenz zur Durchführung dieses Verfahrens. Das Verfahren und 6« das Reagenz sind Insbesondere zur quantitativen Analyse von Harnstoff In Blutflüssigkeiten, wie Blutplasma. Serum. Urin und Markflüssigkeit, geeignet.

Harnstoff ist das hauptsächliche Endprodukt des proteinabbauenden Stoffwechsels im menschlichen ft5 Körper und sorgt primär für die Entfernung toxischer Mengen von Ammoniak aus dem System. Harnstoff stellt ein Produkt dar, das grundsätzlich In der l.cbcr

gebildet und über die Nieren ausgesondert wird.

Somit liefern Messungen des Harnstoffs in verschiedenen Körperflüssigkelten dem klinischen Mediziner sehr wertvolle diagnostische Anzeigen.

Eine frühzeitige Harnstoffmessung war die von Marshall vorgeschlagene (Marshall, E. K., Jr.: J. Biol. Chem. 15:847 (1913), S. 4). Bereits 1913 benutzte Marshall das Enzym Urease als Mittel zur Bestimmung des Harnstoffs Im Blut. Die Methode besteht aus einer Inkubation des Blutes mit Urease, einem Enzym, das Harnstoff in ein Molekül Kohlendioxid und zwei Moleküle Ammoniak spaltet, im Isolieren des so durch Durchlüftung freigesetzten Ammoniaks und quantitativen Bestimmen des Ammoniaks mittels Titration als ein Maß für die Harnstoffmenge.

Nesslers Reagenz (Gentzkow. C. J.: J. Biol. Chem. 143:531 (1942), S. 5) war wahrscheinlich -das am meisten gebräuchliche Reagenz unter denjenigen, die zur Bestimmung von vorliegenden Ammoniumionen (NH₄') verwendet wurden. Jedoch zeigt das Nesslersche Verfahren die nachteilige Beschränkung der photometrischen Ablesung der entwickelten Farbe Innerhalb einer Zeitdauer von einer Minute, wofür die Bildung von Farbe durch mit dem Reagenz reagierende andere Bestandteile als NH₄*-Ionen verantwortlich Ist, was zu einer möglichen Ungenauigkeit führt, die wiederum auf eine Überbewertung der Hamstoffmenge zurückgeht.

Nachfolgend nach dem Verfahren von Marshall ist ein Übermaß neuer Verfahren vorgeschlagen und erprobt worden, um der zunehmenden Kenntnis über die grundlegende Bedeutung genauer, zuverlässiger und reproduzierbarer Harnstoffmessungen und der Tatsache Rechnung zu tragen, daß keines sämtliche Nachteile überwindet, ohne daß neue auftreten.

Diese Verfahren besaßen die Gemeinsamkeit des Einsatzes des Enzyms Urease und unterschieden sich lediglich in der Art und Weise der Bestimmung des gebildeten Ammoniaks.

Möglicherwelse war die am häufigsten verwendete cnzymatlsche Methode diejenige, die die Berthelot-Reaktion ausnutzt (Henry, R. J.: Clinical Chemistry: Principles and Techniques, New York, Harper & Row (1968) S. 513), bei dem Serum während etwa 15 Minuten mit Urease behandelt wird. Anschließend werden zu dieser Mischung zwei zusätzliche Reagenzien gegeben und wiederum für etwa 5 bis 10 Minuten bei erhöhter Temperatur einer Inkubation unterzogen, um die gewünschte Indikatorrcaktlon ablaufen zu lassen. Jedoch bestanden auch hler Nachteile und Schwierigkeiten bei der gesamten Klasse von Verfahren, die das cnzymatlsche Spalten von Harnstoff ausnutzen. Die Hauptnachtciie bestanden In den ausgedehnten Inkubationszeiten, die erforderlich waren, um den Harnstoff In der Probe vollständig umzusetzen, und In den Stabilltätsschwlerigkclten des Reagenssystems. Vielleicht war der am schwersten wiegende Nachteil die Tatsache, daß diese Methoden nicht sehr gut zum Messen von Im Urin enthaltenen Harnstoff geeignet waren, da große Mengen an freiem Ammoniak In diesen Proben vorliegen können und somit eine fehlerhafte Messung des Harnstoffs bewirken, was wiederum eine Überbewertung und folglich eine falsche Diagnose und Behandlung nach sich zieht.

Obwohl die enzymatlschen Methoden mit Nachtellen behaftet waren, beruhten die Verfahren des Standes der Technik viele Jahre trotz der Ihnen Innewohnenden Nachtelle auf dieser Grundlage. Da die Vorteile der Harnsioffunlcrsuchungcn bereits lange bekannt waren.

so war man doch der Auffassung, daß sogar nachteilige Untersuchungen besser als gar keine sind. Jedoch fuhr man mit den Versuchen fort, eine vorteilhafte Harnstoffbestimmung bzw. -untersuchung aufzufinden.

1939 löste sich Fearon (Fearon, W. R.: Blochem J.: 33:902 (1939), S. 7) von der Methodcnlehre des Ureaseenzyms und zeigte, daß Harnstoff mit Dlacetylmonoxlm bei erhöhten Temperaturen in Gegenwart einer starken Säure und eines Oxydationsmittels reagiert, um ein Chromogen zu erzeugen. Ormsby H) (Ormsby, A. A.: J. Blol. Chem.; 146:595 (1942), S. 7) wandte 1942 die Fearon-Reaktion an, um Blut und Urinharnstoff in einer proteinfreien Losung zu messen. Obwohl diese Methodenlehren, die auf der Anwendung der Fearon-Reaktion beruhen heutzutage eine ziemlich is weite Anerkennung gefunden haben, insbesondere in. ' Verbindung mit der Verwendung eines automatischen chemischen Analysator, zeigen sie ein oder mehrere Nachteile: Erstens: die entwickelte Farbe 1st lichtempfindlich, so daß es erforderlich ist, daß der Versuch unter geregekw und minimaler Lichteinstrahlung durchgeführt wird; Zweitens: es mangelt an der Übereinstimmung mit dem Beerschen Gesetz, so daß die Verwendung einer Vielzahl von Standards erforderlich Ist; Drittens: die Reagenzien zeigen eine unangenehme Natur, Viertens: die Reaktion Ist nicht vollständig spezifisch für Harnstoff, was zu ungenauen Untersuchungen führt, wenn störende Substanzen anwesend sind; in vielen und möglicherweise sogar in der Mehrzahl der Fälle wird der Techniker sich nicht Ober das 3U Vorliegen dieser Substanzen im klaren sein und keine Ursache der U"genauigkeit der Messung vermuten; Fünftens: eine strenge Temperatureinregelung bzw. -kontrolle und die Anwendung senr erhöhter Reaktionstemperaturen sind erforderlich.

Obwohl das Fearon-Verfahren derzeit vielleicht das am häufigsten verwendete Verfahren darstellt, stellt die Anwendung erhöhter Reaktionstemperaturen und die saure Natur der Reagenzien eine besondere Gefahr dar, wenn es in einer kontinuierlichen Fllcßanalyseneinrich- -to lung angewandt wird, was auf einen Druckaufbau und die gleichzeitige Möglichkeit des ZcrrciUens von Leitungen zurückgeht, wodurch das Hlriausschlcudcrr heißer Säure in die Luft und schwerwiegende Folgen für das Augenlicht des Bedienungspersonals hcrvorrufen werden.

Nach 1942 wurden von verschiedenen Forschern noch weller andere Änderungen oder Methoden zur HarnscofTmessung vorgeschlagen, einschließlich manometrischer Techniken (Messung des Drucks von Gasen, die in der Rcaktionsfolge freigesetzt werden). Dennoch hat kein einziges Verfahren breite Anerkennung gefunden, was möglicherweise auf solche Nachteile zurückgeht, wie die Komplexität des Verfahrens oder das Erfordernis einer teueren und schwierig zu handhabenden Einrichtung.

Somit wurde viele Jahre auf verschiedenen Wegen und mit unterschiedlichen Versuchen darum gerungen, ein erwünschtes Harnstoffmeßverfahren aufzufinden.

Andere bekannte Versuche Im Verlaufe des langen Ringens um eine zufriedenstellende und erfolgreiche Harnstoffbestimmung haben lange den Versuch umfaßt, die Reaktion zwischen Harnstoff und Aldehyd auszunutzen und ein gefärbtes Reaktionsprodukt oder ein Reaktionsprodukt zu erhalten, das bei der Reaktion mit ('5 einem Chromogen gefärbt wird.

Eines der ersten Verfahren, bei denen die Verwendung eines Aldehyds versucht wurde, stammte offen sichtlich von Brown, der eine Harnstoffbestimmung unter Anwendung dieser Reaktion mit p-Dimethylarnlnobcnzaldehyd (DMAB) versuchte [Brown, H.H., Anal. Chem. 31:1844 (1959), S. 9].

Jedoch waren trotz der Arbeiten vieler Forscher [Roijers, A.F.M. und Tas, M.M., CHn. Chem. Acta, 9:197 (1964), S. 10] Probleme bei der Methode von Brown geblieben. Die Probleme waren die eventuellen Störungen dieser Verfahren durch die üblicherweise verwendeten Arzneimittel (mit der begießenden Möglichkeit der Fehldiagnose) und die Empfindlichkeit der entwickelten Entfärbung gegen Temperaturschwankungen (mit der Notwendigkeit des Einsatzes teurer Laborausrüstungen, um die Farbstabilität wäkjend des Messens der Absorption bzw. der Extinktion sicherzustellen).

Während es noch 1973 versucht wurde, eine verbesserte, auf der Aldehydreaktion basierende Bestlm- , mungsmethode zu finden, schlugen Morln u-ad Prox [Morin, L. G. und Prox, J., Clin. Chem. Acta, 47:27 (1973), S. 10] ein auf der Umsetzung zwischen Harn-

StGn lind dein Aldehyd p-Olmcthyl&nilOübcnZEi-

dehyd (DMAB) beruhendes Verfahren vor, wobei sie versuchten. Harnstoff direkt durch Messen der Extinktion des durch den Aldehyd hervorgebrachten Chromophors quantitativ zu erfassen, ohne daß die Notwendigkeit bestand. Protein aus der Probe zu entfernen. Obwohl die Ausschaltung der Notwendigkeit der Proteinemfernung eine Verbesserung darstellte, l!tt das Verfahren von Morln und Prox dennoch unter dem Problem der Störung durch Üblicherweise verwendete Arzneimittel.

Nach Jung und Mitarbeiter [Jung et al. ClIn. Chem. 21:1136 (1975), S. 10] und dem US-PS 38 90099 von Jung wurde Harnstoff mit einem anderen Aldehyd, nämlich dem o-Phthalaldehyd, umgesetzt. Sie gingen dann einen Schritt weiter und kuppelten das Produkt dieser Reaktion mit N-(l-Naphthyl)-äthylendiamlndlhydrochlorid. Obwohl der Vorschlag von Jung gegenüber dem Stand der Technik gev;fcse Vorteile bot. Indem zumindest keine erhöhten Temperaturen zur Entwicklung des Chromophors erforderlich waren, zeigte er dennoch die nachfolgend wiedergegebenen Nachtelle.

Zunächst erforderte das Verfahren nach Jung N-(I-NaphthyD-äthylendlamlndihydrochlorld. Hierbei handelt es sich um eine aus ar-Naphlhylamin synthetisiertes Material. Somit kann es wahrscheinlich mindestens Spuren an a-Naphthylamln enthalten, d. h. einer Verbindung, die nach allgemeiner Kenntnis «In starkes Karzinogen darstellt (ein krebserregendes Mittel) [Merck Index. 8. AuHage. S. 717, Merck (1969), S. 11].

Des weiteren Ist als eine mögliche Gefahr und als ein Nachteil des Verfahrens von Jung das erforderliche N-d-NaphthyD-äthylendlamlndlhydrochlorld wegen dessen unbekannter Wirkungen bei der Lagerung In der Im Reagens erforderlichen Säure zu sehen, wobei das N-( 1 -NaphthyD-äthylendlamlndlhydrochlorld zerfallen kann, wobei das vorgenannte karzinogene «-Naphthylamln anfällt.

Des weiteren gibt es die mögliche Gegenwart von cr-Naphthylamln In den Laborräumen mit den damit verbundenen Risiken der unmittelbaren oder langzeitigen Einwirkung auf die Gesundheit des Laborpersonals.

Darübcrhlnaus zeigt das Verfahren von Jung die bedeutsame Störung durch eine Klasse von Arzneimitteln, insbesondere den Sulfa-Arznelmitteln, die gewöhnlich verwendet werden, um spezielle Krankheltszu-

stände zu behandeln, bei denen die HarnstofTmessung als ein entscheidender diagnostischer Test durchgeführt wird. Hierbei wird bis zu einem gewissen Ausmaß Infolge der Gegenwart dieser Arzneimittel der Harnstoff fehlerhaft überbewertet, was diese Harnstoffmessung unzuverlässig und ungenau macht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die oben genannten Nachteile der bekannten Verfahren möglichst weitgehend zu beheben.

Dlie Erfindung löst diese Aufgabe ausgehend von to einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch, daß die chromogene Verbindung unter den Verbindungen ausgewählt wird, die durch die folgende allgemeine Formel mit den Ihnen zugeordneten Symbolen dargestellt werden:

OR₁

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R, = - H oder - CH₃ und
R₂ = -H, - OH oder - OCH₃

Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich deutlich von den verschiedenen Lehren nach dem Stand der Technik und Oberwindet viele Nachtelle desselben. Ganz besonders hat es sich gezeigt, daß bei der Erpro- ⁱⁿ bung der vorliegenden Erfindung die Reagenzien stabil bleiben, die Farbreaktion dem Beerschen Gesetz über einen weiten Harnstoffkonzentrationsbereich gehorcht, nicht die Anwendung erhöhter Reaktionstemperaturen oder einer unüblichen Laboreinrichtung erforderlich Ist, und daß sie eine beachtliche Störfestigkeil, die älteren Lehren anhaftet. Insbesondere gegen durch Arzneimittel hervorgerufene Störungen, zeigt und extrem schnell verläuft, da weniger als S min zur vollständigen Analyse erforderlich sind. *o

Das erfindungsgemäß verwendete Chromophor ist nicht lichtempfindlich und ermöglicht ein stabiles Reagenz für die Untersuchung.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß Harnstoff und nicht freie Ammoniumionen gemessen werden, so daß *5 das Verfahren ohne durch die Vorbehandlung einer Probe hervorgerufenen Kosten und Zeitaufwand zur Messung von aus Urin stammendem Harnstoff geeignet ist.

Dadurch, daß wie erwähnt die der Erfindung zugrundeüiegende Reaktion dem Beer'sehen Gesetz über einen weiten Harnstoffkonzentrationsbereich genügt, d. h. die Konzentratlons/Extlnktlons-Ablesungen in direkt linearem Verhältnis stehen, wird die Fehlermöglichkeit vermindert und damit das wiederholte Durchfohren von Analysen verringert, wodurch der klinische Mediziner mit einem Minimum an Kostenaufwand verläßlichere Ergebnisse erhält.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Probe einer Körperflüssigkeit, die Harnstoff enthält. In ein Reaktionsrohr gegeben. Dazu werden eine saure Lösung des o-Phthalaldehyds und eine saure Lösung der chromogcnen Verbindung gegeben. Die Bildung des Chromophors beginnt Sofort. Die Geschwindigkeit der Farbbildung kann, wenn gewünscht, durch Inkubation der Reaktlonsmis<ihung bei 37' C beschleunigt werden. Innerhalb einer ZeUdauer von 3 bis 5 Minuten lsi genug Farbe gebildet worden, so daß das üblicherweise in klinischen Labors vorhandene Photometer verwendet werden kann, um die gebildete Farbmenge zu vermessen. Die Menge des in der ursprünglichen Probe vorhandenen Harnstoffs wird durch Vergleich der Extinktion bzw. der Absorption der Probe des Patienten mit der Extinktion berechnet, die eine In gleicher Welse behandelte Standardlösung des Harnstoffs zeigt, deren genaue Konzentration bekannt ist.

Das o-Phthalaldehyd-Reagenz wird hergestellt, indem 200 bis 2000 mg o-Phthalaldehyd zu einer aliquoten Menge einer nährungsweise 3,75 η Schwefelsäure gegeben werden. Zu dieser Mischung wird zweckmäßigerweise eine solche Menge eines Polyoxyäthylenlauryläthers (z. B. BRIJ 35) oder eines Alkylarylpolyäthers (z. B. TRITON) oder eines anderen nlcht-ionlschen grenzflächenaktiven Mittels gegeben, so daß die endgültige Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels etwa 1 bis 3% (Gew./Vol.) ist. Die Mischung wird dann auf das endgäftige Volumen von einem Liter gebracht.

Die Konzentration des o-PhthalLrfehyds kann innerhalb der hier gegebenen Parameter schranken, was von dem besonderen Anwendungsbereich des Reagenzsystems abhängt. So führt z. B. die Erhöhung der Konzentration des o-Phthalaldehyds in diesem Reagenz zu einem bedeutenden Anstieg der Geschwindigkeit der Farbbildung. Somit würde es für den Laboranalytiker, der einen Hochgeschwindigkeitsanalysator zur Bestimmung chemischer Verbindungen besitzt, erstrebenswert sein, die Konzentration des Reagenzes zu erhöhen, so daß die Farbe schnell gebildet und gemessen werden kann, wodurch die Produktivität und der Durchlauf der Analysen erhöht wird. Wenn jedoch das Verfahren manuell durch einen Labortechniker betrieben wird, wird es umgekehrt erstrebenswert sein, die Konzentration dieses Reagenzes zu erniedrigen, um genügend Zeit für die Analyse zu haben, um die Schritte zu vollziehen, die zur Behandlung einer Vielzahl von Proben in einer planmäßigen Art und Welse erforderlich sind.

Somit dürfte ersichtlich sein, daß die endgültige Konzentration des eingesetzten Reagenzes von dem jeweiligen besonderen Anwendungsgebiet abhängen wird, obwohl alle Konzentrationen innerhalb der gegebenen Parameter zu einer genauen und richtigen Untersuchung führen.

Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare chromogene Verbindungen sind:

(a) 1,3-Dihydroxynaphthalln und

(b) 1-Hydroxynaphthalin

Das chromogene Reagenz wird durch Auflösen einer ger'gneten Menge der zu verwendenden chromogenen Verbindung In einer Lösung hergestellt, die etwa 4 Mol/l Schwefelsäure und zweckmäßigerweise eiwa 80 Mol/l Borsäure und ein grenzflächenaktives Mittel, wie Polyoxyälhylenlauryläther (z. B. BRIJ 35) oder Alkylarylpolyäther (z. B. TRITON) oder ein anderes nlcht-lonlsches grenzflächenaktives Mittel, in einer endgültigen Konzentration von etwa 1 bis 3% enthält. Die genaue Menge der zu verwendenden chromogenen Verbindung wird durch die Molarltät des o-Phthalaldehyd-Reagenzes, das für den besonderen Anwendungszweck vorgesehen Ist, bestimmt. Als allgemeine Richtlinie kann gfelten, daß die Molarltät der chromogenen Verbindung Idealerweise etwa bei 0,1 bis 1,0 mal so viel wie die Konzentration des o-Phthalaldehyds In der endgültigen bzw. fertigen Reaktionsmischung sein

sollte. Im allgemeinen können höhere molare Verhilllnlsse von chromogener Verbindung zu Aldehyd verwendet werden, wenn die chromogene Verbindung keine freie Amlnogruppe besitzt.

Vorstehend Ist die Herstellung des o-Phlhalaldehyd-Reagenzes In einer 3,75 η Schwefelsäurelosung beschrieben worden. Eine derartige Konzentration der Schwefelsaure In diesem Reagenz führt zu einer optimalen Abstimmung zwischen der angestrebten Reaktionsgeschwindigkeit und der Verwendung dieser starken in Säure In Form von Schwefelsäure. Es Ist jedoch erfindungsgemäß nicht notwendig, diese exakte Konzentration der Säure einzuhalten. Vielmehr sind auch Abweichungen von dieser exakten Konzentration der Säure möglich, ohne den Erfindungsgedanken zu verlassen.

Bei den oben beschriebenen Ausgestaltungen wird die chromogene Verbindung In einer 8 η Schwefelsäurelösung eingesetzt. Jedoch kann man von der genauen Normalität der vorstehend erläuterten bevorzugten Ausgestaltung auch abweichen. Als allgemeine Richtllnie fQr die Säurekonzentrationsabweichungen gilt, daß entweder das Erhöhen oder Vermindern der Säurekonzentration des Reagenzes zu einer Verminderung der Geschwindigkeit der In der fertigen Reaktionsmischung beobachteten Farbbildung führt. Während beträchtliche » Schwankungen der Säurekonzentration toleriert werden können, können ziemlich große Abnahmen der Säurekonzentration zu einer beträchtlich verminderten Farbblldungsgeschwlndlgkelt führen. Ziemlich große Erhöhungen der Säurekonzentration können zu einer verminderten Stabilität und zu unerwünschten Auswirkungen auf das Laborpersonai und die Ausrüstung, die den starken Säuren ausgesetzt werden, führen.

Als allgemeine Richtlinie für die Herstellung des vorstehend beschriebenen Reagenzes gilt, daß beide zweckmäßigerweise die Verwendung eines nicht-Ionischen grenzflächenaktiven Mittels einschließen. Dieses gfciiz-fiäehcnaktive MiUei kann zwei Zwecken dienen, was von der verwendeten besonderen chromogenen Substanz abhängt. Z. B. verleiht Im allgemeinen der w Einschluß eines grenzflächenaktiven Mittels dem Reaktionssystem bessere Fließeigenschaften, wodurch ein aktzeptableres Reagenz für jene analytischen Verfahren zur Verfügung steht, bei denen die Extinktion In einem Photometer abgelesen wird, das mit einer Fließzelle versehen ist (z.B. ein System, bei dem eine Elnzelzclle verwendet wird, um alle Extinktionen mittels eines automatischen Mittels zum Folien und zum Entleeren des Gehalts der Zelle messen).

Die zweite Aufgabe des verwendeten grenzflächenaktiven Mittels Ist darin zu sehen, das Auflösen der verwendeten besonderen chromogenen Verbindung zu erleichtern. Durch die Wahl einer geeigneten Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels Ist es möglich, die Löslichkeit zu beeinflussen und das Auftreten einer Trübung in der fertigen Reaktionsmischung zu verhindern.

von 1,8 g l,3-l)lhydroxynuphlhalln In I Liter Sn Schwefelsäure hergestellt, die 15 ml/l TRITON X-IOO enthält.

Analytisches Verfahren

Es werden 20 Mlkrollter (0,02 ml) einer Körperflüssigkeit mit einem nicht bekannten Gehalt an Farbstoff In ein 3,0 ml Aldehydreagenz enthaltendes Rohr gegeben und gemischt. 1,0 ml des chromogenen Reagenzes, 1,3-Dlhydroxynaphthalln, wird zugegeben und gemischt. Die erhaltene Mischung wird dann bei 37° C 10 min einer Inkubation unterzogen und die entstandene Extinktion mit einem Spektralphotometer gegen ein Bllndrcagenz gemessen, das 20 Mlkrollter Wasser, 3 ml des Aldehydreagenzes und 1,0 ml des 1,3-Dlhydroxynaphthallnreagenzes enthält, das In der entsprechenden Welse behandelt worden war, wobei das Vermessen von einer Wellenlänge von 470 nm erfolgt. Die Extinktion der unbekannten Probe wird dann mit der Extinktion verglichen, die in einer Standardlösung des Harnstoffstickstoffs auftrat, wobei diese Standardlösung In gleicher Weise wie die unbekannte Lösung zwecks Berechnung des Harnstoffgehalts der unbekannten Probe behandelt worden war.

Beispiel 1 Herstellung des Reagenzes

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Das o-Phthalaldehydreagenz wird durch Lösen von etwa 2 g Phthalaldehyd in 1 Liter einer 3,5 η Schwefelsäure hergestellt, die 4 ml/l TRITON X-100 und 1 ml/1 Fulyoxyälhyienläuryläiher (z. B. BRU 35), wobei es sich in beiden Fällen um grenzflächenaktive Mittel handelt, enthält. Das chromogene Reagenz wird durch Lösen

Claims

Palentansprüche:

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnstoff in einer flüssigen Probe durch Behandeln der Probe mit einer sauren Lösung des o-Phthalaldehyds und einer sauren Lösung einer chromogenen Verbindung, die mit dem Reaktionsprodukt des Harnstoffs und des o-Phthalaldehyds einen Chromophor bildet, und durch Messen der Extinktion der so gebildeten gefärbten Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die chromogene Verbindung unter den Naphthalinderivaten ausgewählt wird, die durch die folgende allgemeine Formel mit den ihnen zugeordneten Symbolen dargestellt werden: