Verfahren zur kolorimetrischen Analyse von reduzierende oder oxidierende Substanzen enthaltenden Lösungen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur kolorimetrischen qualitativen oder quantitativen Analyse von Lösungen, die reduzierende oder oxidierende Substanzen enthalten, bei dem der Wertigkeitszustand von Kupfer verändert wird, indem mindestens eine der zu bestimmenden Substanzen im gelösten Zustand unter Bedingungen, unter denen sie die Wertigkeit von Kupfer verändert, mit einem Kupferindikator in Berührung gebracht wird, der bei der Wertigkeitsänderung des Kupfers einem Farbumschlag unterliegt, und bei dem das Mass der Wertigkeitsänderung des Kupfers über die Lichtdurchlässigkeit der Lösung gemessen wird, aus der sich die Konzentration der analysierten Substanz durch Vergleich mit einer Vergleichslösung ergibt, dadurch gekennzeichnet,
dass ein Indikator verwendet wird, der im wesentlichen aus einem Chelat aus nahezu vollständig an ein 2,2-Bichinolin oder ein in 2,9-Stellung substituiertes 1,10-Phenanthrolin gebundenem Kupfer besteht.
Die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens auf Harnsäure enthaltende Essigsäurelösungen sowie auf Glukose enthaltende Carbonat-Blut-Filtrate fällt mangels Eignung nicht in Betracht.
Die verwendeten Verbindungen oder Reagenzien zur Bildung der Phenanthrolin- und Bichinolinchelate sind für Kupfer spezifisch, d. h. sie bilden mit anderen Metallen keine Chelate. Bei den verwendeten Chelaten ist das gesamte Kupfer nahezu vollständig durch den Chelatbildner gebunden, wenn es sich in der Lösung befindet, die die zu analysierende Substanz enthält. Ausserdem werden geeignete Bedingungen geschaffen, unter denen die oxidierenden oder reduzierenden Substanzen die Wertigkeit des gebundenen Kupfers verändern.
Die als Indikatoren verwendeten Chelate zeigen einen ausgeprägten Farbumschlag, wenn das gebundene Kupfer seine Wertigkeit ändert. Ausserdem gehorcht die von ihnen in der Lösung hervorgerufene Farbe wenigstens im interessierenden Bereich dem Beerschen Gesetz. Die Menge der oxidierenden oder reduzierenden Substanz lässt sich daher leicht feststellen, wenn man Bedingungen schafft, unter denen der Kupferphenanthrolin- oder Kupferbichinolin-Indikator von der zu analysierenden Substanz oxidiert oder reduziert wird.
Der Gehalt an oxidierender oder reduzierender Substanz kann dann mit bekannten kolorimetrischen oder äquivalenten Verfahren festgestellt werden.
In einem Ausführungsbeispiel für das erfindungsgemässe Verfahren wird zur kolorimetrischen, quantitativen Analyse von Traubenzucker in entproteinisiertem Blutserum eine vorgewählte Menge entproteinisiertes Blutserum in einer wässrigen alkalischen Lösung mit vorgewähltem Volumen und unter Bedingungen, bei denen das Kupfer reduziert wird, mit einem aus nahezu vollständig an 2,2'-Bichinolin oder 2,9-substituiertem 1,1 0-Phenanthrolin gebundenem zweiwertigem Kupfer bestehenden Chelat-Indikator in Berührung gebracht.
Anschliessend wird diejenige Kupfermenge gemessen, die zum einwertigen Kupfer reduziert worden ist, indem die Lichtdurchlässigkeit der wässrigen Lösung gemessen wird. Durch Vergleich mit einer in ähnlicher Weise auf die zu analysierende Substanz behandelten Traubenzuckervergleichslösung kann dann die Traubenzuckermenge berechnet werden.
Verfahren zur Bestimmung des Bluttraubenzuckers sind etwa seit 1920 bekannt, als Folin und Wu ein laboratoriumsreifes Verfahren entwickelten, welches eines der gebräuchlichsten chemischen Verfahren bei klinischen Versuchen geworden ist. Den wesentlichsten Beitrag zur Traubenzuckerbestimmung in Körperflüssigkeiten liefert dieses Verfahren durch den Nachweis, dass Monosaccharide die Fähigkeit besitzen, gewisse Metallionen in heissen alkalischen Lösungen zu reduzieren und dass die Reduktion mit einer derartigen Genauigkeit gesteuert werden kann, dass diese Eigenschaft der Mo nosaccharide auch medizinisch und industriell venvertbar ist.
Obwohl nachweislich auch andere Metallionen durch Traubenzucker reduziert werden können, werden für diesen Zweck am häufigsten zweiwertige Kupferionen verwendet, wie sich aus den vielen bekannten Varianten des ursprünglichen Verfahrens ergibt. Den meisten Varianten liegt die Hauptaufgabe zugrunde, ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Traubenzucker zu entwickeln, das für Traubenzucker spezifischer ist und eine grössere Stabilität der Reagenzien und der abschliessenden Farbreaktion ergibt. Andere Varianten des ursprünglichen Verfahrens stellen einen Versuch dar, ein bei diesem Verfahren notwendiges, mit einer Einengung versehenes, Prüfrohr unnötig zu machen, das bei den ersten Traubenzuckeranalysen zur Steuerung der Reoxidation des Kupfers diente.
Bisher ist man bei der Traubenzuckeranalyse immer vor das Problem gestellt, das Kupfer in Lösung zu halten und die Reoxidation des Kupfers zu vermeiden.
Hierzu ist es üblich, zusammen mit dem Kupfer ein Tartrat und/oder Sulfat und andere Reagenzien in Lösung zu bringen.
Es ist jedoch auch schon vorgeschlagen worden, das reduzierte Kupfer, ähnlich wie bei einigen der bis dahin verwendeten Stoffe, in einer alkalischen Tartratlösung, die Sulfationen enthält, mit einer Phenanthrolinverbindung zu komplexieren. Diese Verfahrensweise ist in einer Veröffentlichung von Mayo E. Brown, M. S., in der Zeitschrift The Journal of the American Diabetes Association,, Januar/Februar 1961, Band 10, Nr. 1, Seiten 60-62, beschrieben. Danach wird der alkalischen Kupfertartratlösung ununterscheidbar ein Komplexbildner für das Kupfer zugesetzt. Es ergibt sich, dass wegen der Gegenwart des Tartrats und wegen eines tÇberschus- ses an Kupfer-II-Ionen nicht alle Kupfer-II-Ionen an den Komplexbildner gebunden werden.
Ein Überschuss an Kupfer-II-ionen und/oder die Gegenwart von Tartrationen und/oder die Gegenwart von Chiorionen verursachen eine Reoxidation der Kupfer-II-ionen während des primären Reduktionsschrittes.
Folglich kann trotz der unternommenen Anstrengungen zur Unterdrückung der Reoxidation kein gewöhnliches Prüfrohr verwendet werden. Stattdessen sind mit einer Einengung versehene Prüfrohre, die beim Kopfpunkt betrieben werden, und/oder die Gegenwart von Sulfationen notwendig. Trotz allen Vorsichtsmassnahmen sind die Ergebnisse immer noch nicht reproduzierbar genug.
Im erfindungsgemässen Verfahren werden Kupferchelate verwendet, wodurch der Bedarf an Tartrat oder anderen in neuerer Zeit zum Inlösungshalten der zweiwertigen Kupferionen verwendeten Hydroxysäuren vermieden wird. Ausserdem ist es nicht mehr notwendig, der Lösung zur Vermeidung der Reoxidation andere Salze, z. B. Sulfate, zuzugeben. Alles überschüssige Kupfer wird vor der Bestimmung der oxidierenden oder reduzierenden Substanz aus der Lösung entfernt und das verbleibende Kupfer ist nahezu vollständig an den Komplexbildner gebunden.
Beim erfindungsgemässen Verfahren wird daher die bisher stets störende Reoxidation vermieden, so dass die Verwendung eines Prüfrohrs mit geraden Wänden oder eines ähnlichen geeigneten Gefässes möglich ist. Die Steuerung der Reoxidation der einwertigen Kupferionen, wie sie beispielsweise bei der Analyse von Traubenzucker auftritt, erlaubt sehr kurze Siedezeiten im Vergleich zu den bekannten Verfahren. Ausserdem ist der entstehende Farbkomplex fünf Tage oder länger stabil, so dass sich wesentliche Vorteile bei der kolorimetrischen Analyse ergeben.
Zur erfindungsgemässen Analyse geeignet sind beispielsweise alle organischen Verbindungen mit der Gruppierung
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wobei X irgendein organisches Radikal, wie Alkylradikale, z. B. die Methyl- oder Äthylgruppe oder aromatische Radikale, wie der Benzolring sein kann. Die offenen Valenzen der Kohlenstoffatome sind miteinander durch andere Kohlenstoffatome verbunden, so dass sich Ringstrukturen ergeben.
Als Komplexbildner wird vorzugsweise einer der Stoffe Cuproin (2,2'-Bichinolin), Neocuproin (2,9-Di methyl-1 1 0-phenanthrolin), Bathocuproin (2,9-Dime thyl-4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolin) oder eines der wasserlöslichen Salze dieser Stoffe, wie das Hydrochlorid- oder Hydrosulfatsalz, verwendet. Weitere Komplexbildner sind ausserdem z. B. die oben aufgezählten bevorzugten Substanzen mit weiter substituierten Ringen.
Beispielsweise können beim Neocuproin und Bathocuproin in der fünften und/oder sechsten Stellung Alkylgruppen, Hydroxygruppen, Nitrogruppen, Halogenatome oder dergleichen substituiert sein.
Der Kupfer-phenanthrolin- oder Kupferbichinolin Komplex ist in vielen Dingen dem Eisenphenanthrolin Indikatorsystem ähnlich und scheint genau so nützlich wie dieser zu sein, wobei er noch den Vorteil besitzt, dass er dem Farbkomplex in wässriger Lösung besonders bei der Analyse von reduzierenden Substanzen eine grössere Stabilität verleiht.
Im Gegensatz zum Eisenphenanthrolinsystem scheinen die zwei- und einwertigen Kupferionen fest im Chelat gebunden zu sein, und keiner der Komplexe wird in heisser alkalischer Lösung stark angegriffen.
Wenn ausserdem unter diesen Bedingungen ein Teil des Kupfer-II-chelats zum Kupfer-I-chelat reduziert ist, dann ist der entstandene Farbkomplex bei Zimmertemperatur mehr als fünf Tage lang stabil, so dass keine zusätzlichen Stabilisatoren oder andere Komplexbildner notwendig sind, um das zweiwertige Kupferion zu suspendieren. Beim Verbinden des Kupferions mit dem substituierten Phenanthrolin oder Bichinolin in einem Molverhältnis von 1:2 dient das Chelat dann als quantitativer Oxidations- oder Reduktionsindikator, dessen Farbe je nach der Zahl der zweiwertigen oder einwertigen Kupferionen, die entsprechend den Versuchsbedingungen gebildet werden, intensiver oder weniger intensiv wird. Da das Chelat derart fest gehalten wird, tritt eine Reoxidation nicht mehr auf.
Die genannten Indikatoren sind bei der Analyse von oxidierenden bzw. reduzierenden Substanzen aus der flüssigen Phase in weitem Masse verwendungsfähig. Besonders nützlich sind sie zur Analyse von Blut auf verschiedene reduzierende Substanzen. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren können sowohl der zellförmige Teil als auch der Plasmateil des Blutes analysiert werden. Im zellförmigen Teil können mit den verwendeten Indikatoren beispielsweise Glutathion und im Plasmateil, der vorzugsweise in seiner Serumform ver wendet wird, eine Anzahl von Substanzen, z. B. Traubenzucker, Creatinin, Harnsäure und Ascorbinsäure, bestimmt werden.
Die entsprechenden Oxidations- und Reduktionsreaktionen werden bei dem Verfahren der Erfindung normalerweise in der flüssigen Phase durchgeführt, d. h.
z. B. in Wasser oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Aceton, Äthanol, Chloroform, itthyl- acetat, Amylacetat, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol, Dioxan oder dergl. Der Indikator, der aus einem zur Chelatbildung geeigneten Phenanthrolin oder Bichinolin besteht, an das das Kupfer nahezu vollständig gebunden ist, wird dann dem die oxidierende oder reduzierende Substanz enthaltenden Lösungsmittel zugesetzt. Der Indikator kann in fester Form zugegeben werden, doch wird er vorzugsweise in gelöster Form zugegeben, wobei er in einem der geeigneten Lösungsmittel gelöst ist. Eine Indikatorlösung kann ausserdem andere Substanzen, z. B. ein geeignetes Alkali, enthalten.
Das Kupfer wird je nach dem, ob die zu analysierende Substanz oxidierend oder reduzierend ist, in zweiwertiger oder in einwertiger Form verwendet. Anschliessend werden die geeigneten Bedingungen eingestellt, zum Beispiel der genaue pH-Wert und die Temperatur, damit das Kupfer entsprechend reduziert oder oxidiert wird.
Die hier vorgeschlagenen Indikatoren unterliegen beim Übergang vom oxidierten in den reduzierten Zustand oder umgekehrt einer glänzenden und ausgeprägten Farbänderung. Cuproin ist beispielsweise in der Cuproform purpur und in der Cupriform hellgrün. Die Farbänderung der Indikatoren kann auch zur quantitativen Bestimmung der in der Lösung befindlichen oxi- dierenden oder reduzierenden Substanz dienen, indem auf bekannte Weise titriert oder gasometrisch oder kolorimetrisch vorgegangen wird.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, nämlich der Analyse von Traubenzucker im Blutserum, gehört zu den zur Reduktion geeigneten Bedingungen die Gegenwart einer alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von vorzugsweise mindestens etwa 10.
Dies kann durch Zugabe eines Alkalis, z. B. Natriumhydroxid, zur Indikatorlösung geschehen. Vorzugsweise wird jedoch der alkalische Zustand durch Zugabe eines Carbonates wie Natriumcarbonat hergestellt.
Wenn Natriumcarbonat verwendet wird, dann geht die Reduktion des Indikators im allgemeinen schneller vor sich, wenn die Lösung konzentrierter ist, d. h. die Reduktion verläuft in einer 40/oigen Natriumcarbonatlösung schneller als in einer 0,10/obigen Lösung. Zur schnellen Beendigung der Reduktion (in etwa 2,5 Minuten) ist eine etwa 10/obige Natriumcarbonatlösung ausreichend. Die dabei entwickelte Farbe wird nicht zerstört, wenn die Erwärmungszeit grösser als diese Zeit bis zur maximalen Farbentwicklung ist.
Wenn anstelle von Traubenzucker andere oxidierende oder reduzierende Substanzen analysiert werden, die auch in anderen Stoffen als Blut oder Blutserum enthalten sein können, dann sollte der pH-Wert in bekannter Weise eingestellt werden, damit die untersuchte Substanz eine Oxidation oder Reduktion des Kupfers hervorruft. In allen Fällen, auch im Falle der Traubenzuckeruntersuchung, kann eine Erwärmung notwendig sein (z. B. in einem Wasserbad), um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen.
Bei der oben beschriebenen Verfahrensweise wird das Kupferphenanthrolin oder Kupferbichinolin der Prüflösung in einer Menge zugegeben, die zur Abreaktion der gesamten reduzierenden oder oxidierenden Substanz in der Lösung ausreicht, wobei ein Überschuss vorteilhaft ist. Im Falle der Analyse des Traubenzuckers im Blutserum wird der Blutserumprobe eine Indikatorlösung zugesetzt, die etwa 7,5 mg O/o hydratisiertes Kupfersalz enthält. Eine solche Indikatorlösung, die etwa 7,5 mgo/o hydratisiertes Kupfer-II-sulfat enthält, eignet sich daher z. B. zur Reduktion einer Standardlösung mit 300 mgo/o Traubenzucker, wobei die beschriebenen Bedingungen eingestellt werden müssen.
Je nach den zu analysierenden Substanzen ist die im Einzelfall zu verwendende Konzentration veränderbar. Eine zu geringe Indikatorkonzentration sollte jedoch vermieden werden, da bei den sehr geringen Konzentrationen eine Abweichung von der Linearität der Absorptionskurve auftritt. Obwohl daher eine 7,5 mg0/o Indikatorkonzentration des Kupfersalzes bei Verwendung einer 300 mgo/o Standardtraubenzuckerlösung geeignet ist, kann auch bei einer Indikatorkonzentration von 2,5 mgo/o Kupfersalz ein gutes Ergebnis erzielt werden. Bei einer Herabsetzung der Kupfersalzkonzentration auf weniger als 1 bis 1,5 mg0/o tritt jedoch in starkem Masse die Stearinhemmung in Erscheinung.
In jedem Fall muss jedoch genügend Chelatbildner zugegen sein, damit unabhängig von der verwendeten Kupfermenge das Kupfer nahezu vollständig gebunden wird. Das kann leicht ausgerechnet werden, da für jedes Kupferatom zwei Moleküle des Chelatbildners notwendig sind.
Die mit der Luft in Berührung befindliche Flüssigkeitsoberfläche ist im Gegensatz zu den bekannten Verfahren unkritisch, bei denen ein mit einer Verengung versehenes Prüfrohr für den Traubenzucker verwendet oder auf andere Weise verhindert werden musste, dass die einwertigen Kupferionen während des Siedens oder anderer Bedingungen, die zum Reduzieren erforderlich sind, wieder reoxidiert wird. Das hat sich durch Versuche mit drei verschiedenen Siedegefässen ergeben, bei denen verschieden grosse Flüssigkeitsoberflächen mit der Luft in Berührung gebracht werden. Obwohl sich ergibt, dass bei den Gefässen mit kleinerer Berührungsfläche Flüssigkeit-Luft die Farbeinstellung des Indikators schneller erfolgt, führen die Reaktionen in allen Prüfgefässen letzten Endes zur gleichen Farbdichte, wenn man bis zur Beendigung der Reaktion wartet.
Daraus folgt, dass der Unterschied der Geschwindigkeit der Farbentwicklung und der Unterschied, der zur Erwärmung der Lösungen in den verschiedenen Reaktionsgefässen auf die Reduktionstemperatur des Kupfers voneinander abhängig sind, und dass eine noch bemerkbare Reoxidation nicht von der Flüssigkeitsoberfläche abhängt, die der Luft ausgesetzt ist. Diese Eigenschaften ergeben sich aus der Fig. 1, in der drei Proben A, B und C zugrunde gelegt worden sind. Die Probe A wird in einem 13 X 100 mm Prüfrohr, B in einem 17 X 150 mm Prüfrohr und C in einem 30 ml Gefäss mit rundem Boden nach Kjeldahl untersucht. Dabei wird eine 300 ml Traubenzuckerstandardlösung mit geeigneten Vergleichslösungen verwendet. Der Indikator und das angewendete Verfahren sind im anschliessend beschriebenen Beispiel I beschrieben.
Beispiel 1:
Analyse von Traubenzucker mit Kupferneocuproin als Indikator:
Konzentrierte Indikatorlösung
15 mg hydratisiertes Kupfer-II-sulfat werden 50 ml einer wässrigen Lösung zugesetzt, die 100 mg Neocuproinhydrochlorid enthält. Hierzu wird Wasser verwendet, welches frei von Metallionen und reduzierten Substanzen ist. Es entsteht grünes Kupfer-II-chelat. Das Kupfer-II-ion verbleibt in Lösung, wenn man es einem alkalischen Medium zuführt. Das Konzentrat ist bei Zimmertemperatur mindestens zwei Monate stabil.
Das Chelat dient in dieser Form als Indikator bei der quantitativen Reduktion und kann entweder einer alkalischen oder sauren Lösung zugeführt werden, um die Gegenwart oder die Konzentration von reduzierenden Substanzen unter den gegebenen Bedingungen zu bestimmen. Wenn das Kupfer in der einwertigen Form erhalten wird, dann kann es mit einem geeigneten Oxydationsmittel in die zweiwertige Form überführt werden.
Wenn umgekehrt die zweiwertige Form erhalten und der Indikator zum Nachweis von oxydierenden Substanzen verwendet wird, dann kann es durch ein geeignetes Reduktionsmittel in die einwertige Form überführt werden.
Reduktionsmittel für die Analyse von Traubenzucker
5 ml der konzentrierten Indikatorlösung werden 95 ml einer einprozentigen wässrigen Natriumkarbonatlösung zugefügt. Das Reaktionsmittel besitzt eine sehr schwach bläulich-grüne Farbe und bleibt bei Zimmertemperatur einige Tage lang klar, ohne dass eine wesentliche Selbstreduktion der Kupfer-II-ionen eintritt.
Der pH-Wert der Lösung ist 10,8.
Anwendung auf Blutserum
Es wird in der üblichen Weise oxaliertes Blut gesammelt. Es kann z. B. ein Tropfen Blut vom Finger verwendet werden, wenn letzteres sofort in Natriumoder Bariumhydroxyd gegeben wird, um die Proteine auszufällen. Es wird ein Filtrat aus Barium- oder Natriumhydroxyd und Zinksulfat im Verhältnis von 1:200 oder 1:100 hergestellt, wobei die Reaktionsmittel sorgfältig eingestellt werden, damit eine neutrale Lösung entsteht. Die Lösungen werden dazu verwendet, ein entproteinisiertes Filtrat herzustellen, wie es das Verfahren nach N. Somogyi A Method for the Preparation of Blood Filtrates for the Determination of Sugar , J.-Biol. Chem., 86, Seiten 655-663 (1930), angibt.
1. 1 ml eines 1 : 200-Filtrats (oder einer bekannten Traubenzuckervergleichslösung als Äquivalent) wird in einem sauberen Prüfrohr zu 6 ml der Indikatorlösung gegeben. Eine geeignete Vergleichslösung ist ebenfalls vorgesehen.
2. Die Prüfröhrchen werden 2,5 Minuten lang in heftig kochendes Wasser gegeben und dann in Leitungswasser auf Zimmertemperatur abgekühlt.
Es werden spektrophotometrische Messungen in der Nähe der Wellenlänge Maximalabsorption (454 zur durchgeführt. Die Traubenzuckerkonzentration ist proportional der optischen Dichte, wie es die Fig. 2 zeigt.
Wie oben beschrieben, werden die chelierten Indikatoren einfach dadurch hergestellt, dass man das Kupfer vorzugsweise in der flüssigen Phase mit dem Cheliermittel in Berührung bringt.
Beispiel 2:
Analyse von Traubenzucker mit Kupferbathocuproin als Indikator
Konzentrierte Indikatorlösung
50 mg hydratisiertes Kupferr sulfat werden 50 ml einer wässrigen Lösung zugegeben, die 200 mg Bathocuproinnatriumsulfonat enthält. Das Wasser hierzu sollte frei von reduzierenden Substanzen und Metallionen sein. Aus dieser Kombination bildet sich hellgelbes Kupferchelat. Das Kupfer-II-ion verbleibt in Lösung, wenn die konzentrierte Indikatorlösung einem alkalischen Medium zugeführt wird. Das Konzentrat ist bei Zimmertemperatur mehrere Tage lang stabil und kann zur Bestimmung der Gegenwart oder der Konzentration von reduzierenden Substanzen entweder einer alkalischen oder einer sauren Lösung zugeführt werden.
Reaktionsmittel
5 ml der konzentrierten Indikatorlösung werden 95 ml einer einprozentigen wässrigen Natriumkarbonatlösung zugegeben. Das Reaktionsprodukt besitzt einen sehr schwach gelblichen Farbton und zeigt bei Zimmertemperatur in zwei Tagen keine merkliche Selbstreduktion. Der pH-Wert der Lösung ist 10,8.
A nalysierverfahren
Es wird auf bekannte Weise oxaliertes Blut aus einer Vene gesammelt. Dazu kann ein Tropfen Blut von der Fingerspitze verwendet werden, wenn das letztere sofort in das Natrium- oder Bariumhydroxyd gegeben wird, um die Proteine auszufällen. Gemäss dem Verfahren nach Somogyi (siehe Beispiel 1) wird ein Filtrat von Barium- oder Natriumhydroxid und Zinksulfat im Verhältnis von 1: 400 hergestellt, wobei die Reagenzien sorgfältig eingestellt werden, damit sich Neutralität ergibt.
1. 1 ml des Filtrats oder einer bekannten Traubenzuckervergleichslösung wird in einem sauberen Prüfrohr mit 6 ml der Indikatorlösung versetzt. Eine geeignete Vergleichslösung ist ebenfalls vorgesehen.
2. Die Prüfröhrchen werden 2,5 Minuten lang in heftig kochendes Wasser gegeben und anschliessend unter Leitungswasser auf Zimmertemperatur abgekühlt.
3. Es werden spektrophotometrische Messungen in der Nähe der Wellenlänge der Maximalabsorption (479 , > ) durchgeführt. Die Traubenzuckerkonzentration ist proportional der optischen Dichte, wie es in der
Fig. 3 gezeigt ist.
Beispiel 3:
Analyse von Traubenzucker mit Kupfercuproin als Indikator.
Wie in den vorherigen Beispielen wird eine Indikatorlösung hergestellt, wobei jedoch Cuproin als Cheliermittel verwendet wird. Nach dem Verfahren von Somogyi wird Blutserum entproteinisiert und wie in den vorherigen Beispielen auf Traubenzucker analysiert. Die Ergebnisse sind in der Fig. 4 gezeigt.
Bei dem bisher bekannten Verfahren bestand stets das Problem der Reoxidation des Kupfers. Damit die Verwendung eines Prüfrohres mit einer Verengung vermieden werden kann, ist bereits vorgeschlagen worden, der Lösung z.B. in Form von Natriumsulfat Sulfationen zuzugeben. Die Zugabe von mehr als 18 O/o Natriumsulfat dient bei den Indikatoren, die hier beschrieben werden, zur Vergrösserung der Dichte der endgültig erhaltenen Färbung. Das Sulfation wirkt reduzierend, doch ändert sich die Wirkung bei Abwesenheit anderer reduzierender Substanzen mit der Konzentration an Natriumsulfat, d. h. je grösser die Sulfatkonzentration ist, um so grösser ist die reduzierende Wirkung auf den Kupferindikator.
Da erfindungsgemäss die Gegenwart von Sulfationen nicht erforderlich ist, kann auf diese Weise der Traubenzucker im Blutserum genauer als nach den bekannten Verfahren analysiert werden.
Das Verfahren nach der Erfindung hat den Vorteil, dass in Gegenwart von Traubenzucker auch eine Analyse auf Harnsäure und Creatinin möglich ist. Wenn nämlich die zu untersuchende Probe Traubenzucker enthält, dann ist es nur notwendig, eine genügende Menge an Acetationen zuzufügen, damit der pH-Wert auf 5-8 eingestellt wird. Der Traubenzucker kann dann die Bestimmung nicht mehr stören.
Wenn andererseits eine Analyse auf Traubenzucker vorgenommen werden soll und die ursprüngliche Probe Creatinin, Harnsäure und unter Umständen weitere reduzierende Substanzen enthält, dann können diese zweckmässigerweise dadurch entfernt werden, dass man z. B. die Verfahrensweise nach Somogyi wählt. Das Somogyi-Filtrat enthält im wesentlichen Reduktionsmittel für Monosaccharide und nur geringe Mengen anderer Reduktionsmittel. Harnsäure und Creatinin brauchen aus der Lösung, aus der Traubenzucker bestimmt werden soll, nicht entfernt zu werden, wenn die Traubenzuckerbestimmung wie bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel in einer alkalischen Carbonatlösung vorgenommen wird. Wenn Harnsäure und Creatinin in physiologischen Konzentrationen direkt der zu untersuchenden Traubenzuckerlösung zugegeben werden, dann beeinflussen sie die Analyse der Monosaccharide nur unwesentlich.
Das geht aus der Fig. 5 hervor, in der die Versuchsergebnisse eingetragen sind, die sich ergeben, wenn ähnlich wie im Beispiel 1 vorgegangen wird und nur die angegebenen zusätzlichen Reduktionsmittel verwendet werden.
Wenn auf Creatinin und Harnsäure analysiert wird, dann können die Reduktionseigenschaften des einen Stoffes in Gegenwart des anderen dadurch unterschieden werden, dass man verschiedene reduzierende Bedingungen schafft. Wenn beispielsweise die zu analysierende Probe sowohl Harnsäure als auch Creatinin enthält, dann kann sie mit einem Indikator wie im Beispiel 1 kombiniert werden. Bei geeigneter Einstellung der reduzierenden Bedingungen kann dann wahlweise die Reduktion der Harnsäure allein bestimmt werden.
Zur wahlweisen Einstellung der reduzierenden Bedingungen, die vorzugsweise zur Reduktion allein der Harnsäure führen, gehört die Einstellung des pH-Wertes auf 5 bis 6. Bei Erwärmung wird die Reduktion beschleunigt. Wenn der pH-Wert auf 7 bis 8 eingestellt wird, dann verändern sowohl die Harnsäure als auch das Creatinin den Indikator. Die Menge an Harnsäure kann daher zuerst dadurch bestimmt werden, dass ausgewählte Bedingungen geschaffen werden, und wenn dann die Gesamtmenge bestimmt wird, dann erhält man den Anteil an Creatinin aus der Differenz dieser beiden Werte. Die oben beschriebene Einstellung der Bedingungen zur selektiven Reduktion sind nur als Beispiel aufzufassen, und auch Modifikationen können zu gleichen Ergebnissen führen.
Wenn zur Analyse auf Blutzucker Blutserum verwendet wird, dann sollte sich vorzugsweise das Verfahren nach Somogyi zur Entproteinisierung anschliessen.
Bei dieser Verfahrensweise entsteht ein klares Filtrat, welches zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung äusserst geeignet ist. Wenn das Blutserum jedoch auf Harnsäure oder andere reduzierende Substanzen analysiert wird, dann kann das Somogyi-Filtrat nicht verwendet werden, weil es im wesentlichen nur Substanzen zur Reduktion der Monosaccharide enthält. Infolgedessen wird in diesem Fall z. B. ein Filtrat nach dem Verfahren von Folin und Wu hergestellt, welches in J. Biol. Chem. 38, 81 (1919) beschrieben ist und bei dem Wolframsäure verwendet wird. Verglichen mit den Somogyi-Filtraten sind jedoch die Filtrate nach Folin und Wu manchmal etwas trüb. Die Trübung wird jedoch nicht beobachtet, wenn wässrige Standardlösungen von Harnsäure oder Traubenzucker den Indikator- und Acetat- oder Carbonatlösungen zugegeben werden.
Die Trübung kann durch Zugabe eines kationischen, oberflächenaktiven Reagensmittels zum wolframsauren Filtrat vermieden werden. Die zugegebene Menge sollte so gross sein, dass die Lösung klar wird. Zur Klärung des Filtrats kann u. a. beispielsweise einprozentiges Methylbenzethoniumchlorid (Octylcresoxi-äthoxyäthyldimethylbenzylamoniumchlorid-monohydrat) zugegeben werden. In dieser Weise behandelte Filtrate bleiben ohne Trübung und können zur Harnsäurebestimmung oder zur Bestimmung anderer reduzierender Substanzen verwendet werden, z. B. auch zur Bestimmung der Monosaccharide, wenn das Somogyi-Filtrat nicht verwendet wird.
Beispiel 4:
Bestimmung von Harnsäure und Creatinin im Blutserum.
Indikatorlösung
Für die Reaktion kann irgendeines der oben erwähnten substituierten Phenantroline oder Bichinoline verwendet werden. In diesem Beispiel wird das Kupfer-IIchelat von Neocuproinhydrochlorid verwendet und in der gleichen Konzentration wie bei der Analyse von Monosaccharid nach Beispiel I einer einprozentigen Natriumacetatlösung zugegeben.
Filtratreagens
Zur Herstellung eines wolframsauren Filtrats gemäss der Vorschrift von Folin und Wu wird eine 1/12 n Schwefelsäure verwendet, der so viel Methylbenzetho niumchlorid zugegeben wird, bis eine 0,30/oige Lösung entsteht. Ausserdem wird für das wolframsaure Filtrat 100/obiges Natriumwolframat verwendet.
Durchführung der Analyse
Das wolframsaure Filtrat wird hergestellt, indem 8 Vol. /o Schwefelsäurelösung mit einem Volumen Blutserum vermischt werden. Anschliessend wird zur Aus fällung der Proteine 1 ml 100/oiges Natriumwolframat zugegeben. Der Niederschlag wird in bekannter Weise abfiltriert.
1. 2 ml des auf diese Weise hergestellten Filtrats werden mit 5 ml des Farbreagens in Acetatlösung zugegeben. Geeignete Vergleichslösungen werden in ähnlicher Weise behandelt.
2. Die Mischung wird eine Minute lang in kochendes Wasser gegeben und dann auf Zimmertemperatur abgekühlt und in einem Spektrophotometer quantitativ analysiert.
Zwischen der optischen Dichte und der Konzentration der Harnsäure und des Creatinins wird eine lineare Beziehung beobachtet. Unter den besonderen, hier eingestellten Bedingungen, d. h. bei Gegenwart von Acetationen und bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 8, werden die beobachteten Ergebnisse bei Gegenwart von Traubenzucker nicht beeinflusst. Die Harnsäure kann bestimmt werden, indem der pH-Wert auf 5 bis 6 eingestellt wird, wobei weder der Traubenzucker noch das Creatinin stören. Die Creatininkonzentration wird als Differenz der beiden erhaltenen Werte bestimmt.
Beispiel 5:
Bestimmung von Ascorbinsäure
Aus Neocuproin und zweiwertigen Kupferionen in einem Mol-verhältnis von 2: 1 wird ähnlich wie im Beispiel 1) eine Indikatorlösung hergestellt, wobei die Lösung jedoch angesäuert wird. 2 ml Proben einer im Verhältnis 1 : 10 verdünnten Ascorbinsäure-Vergleichslösung in den angegebenen Konzentrationen werden mit 5 ml Teilen des Indikators versetzt. Nach 4 Minuten werden spektrophotometrische Messungen bei 454 u vorgenommen, wobei eine 10-mm-Cuvette verwendet wird. Die Ergebnisse sind in der Fig. 6 gezeigt.