DE2144136A1

DE2144136A1 - Mittel und verfahren zur bestimmung von calcium

Info

Publication number: DE2144136A1
Application number: DE2144136A
Authority: DE
Inventors: Roland Dipl Chem Dr Helger
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1971-09-03
Filing date: 1971-09-03
Publication date: 1973-03-15
Also published as: GB1361149A; ZA725126B; FR2151995A5; IL40019A0; NL7209978A; IL40019A; BE788232A; US3798000A; JPS4834592A; IT983160B; DD99661A5

Description

Merck Patent Gesellschaft 1. September 1971

rail; beschränktec ■ia.i.'tur.g

Darnstadt 2144136

lJittel ur-d Vorfahren zur Bestimmung von Calcium

Die vorliegende Erfindung- betrifft ein Mittel und ein Verfahren zur kolorimetriscnen Bestimmung von Calcium. Die exakte Bestimmung des Calciuingehaltes ist vor allem in biologischen Flüssigkeiten, wie Blutserum, Blutplasma, Harn, Liquor usw., für die Diagnostik von Bedeutung.

Der Caloiumspiegel ist normalerweise in den meisten Körperflüssigkeiten auf einem relativ konstanten Hiveau. Veränderungen der Calciumkonzentration im Serum geben Hinweise auf einige pathologische Zustände, z. B. tritt Hypercalcämie bei Überfunktion der Nebenschilddrüsen und der Schilddrüsen, bei Sarkoidose und einigen metastasierenden Carcinomen auf. Hypocalcämie ist u. a. verbunden mit Osteoporose und osteoplastischen Carzinomen, mit akuter Pankreatitis und Acidosen.

Eine Reihe von chemischen und iihysikalischen Methoden für die Bestimmung von Calcium in biologischem Material sind bekannt. Von größtem Interesse für das Kliniklabor und den praktischen Arzt sind solche Methoden, die ausreichende Empfindlichkeit und Spezifität mit größtmöglicher Einfachheit in der Durchführung verbinden. Als besonders geeignet erweisen sich die direkten colorimctrischen Verfahren, bei denen auf eine Eiweißfullung und auf die Ausfüllung des Calciums und eine

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anschließende gravimetrisch© oder titrimetrifiche Bestimmung verzichtet werden kann. Aus der Literatur sind Farbstoffe bekannt, die mit Calcium farbige Komplexe bilden, wie z. B. Eriochromblau SE, Glyoxal-bis(2-hydroxya,nil), Alizarin, Plasmacorinth B, Kernechtrot oder Hurexid.

B.C. Ray Sarkar und U.P.S. Chauhan (Anal. Jiochem. £0, 155 (1967)) publizierten eine Methode für die Caloiumbesti.jfim.ung im Serum unter Verwendung von Phthaieinpurpur, bei welcher ein Ammoniak/Ammoniumchlorid-Puff er vom pH 10,5 verwendet wird.

Die vorbekannten Methoden ha.ben jedoch erhebliche Machteile, und das Ziel, eine besonders einfache Durchführung der Oaleiuiabestimmung zu ermöglichen, war mit diesen Methoden noch nicht erreicht;. Z. ß. liegt nach der Bestiinmungsmethode von .Ray Sarkar und Chauhan erst nach 6 Pipettierschritten eine zur photometrisehen Kessung geeignete Losung vor. Die Jahl des

NH-z/BH,, Cl-Puffers ist nicht optimal; im unteren Bereich resul- J 4

tiert eine gekrümmte Eichkurve. Außerdem ist das Arbeiten mit einem aminoniakhaltigen Pxxffer unangenehm, insbesondere aber ist der Puffer schlecht geeignet für die Herstellung eines Reagenziensatzes. Mchtlineare Eichkurven und ungleichartiger Reaktiorisablauf im Serum einerseits und in wäßriger Standardlösung andererseits führen zu Fehlresultaten.

Es wurde nun gefunden, daß die geschilderten Nachteile weitgehend vermieden werden können, wenn die kolorimetrische Calciumbesbimmung in einem neuen Puffersystem durchgeführt wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Mittel zur lcoloriins fcrischen Bestimmung von Gale ium, vorzugsweise in biologischen Flüssigkeiten, enthMl. fccjnd ein in Gegenwart von

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BAD OBKSfNAl.

Komp3. cxe bildendes I.·¹ ar broaden a und ein luffer-Gyütcüi. di-.i. dadui'Cii ,^okeimsGiehnet ist, daß da ο 'Putferaysi:eai au ο einem Giaiii uca von Amido «ulf onr;L>ui^ve , IJinatriiimtetraborat und Alkiüiov-ri.oriat bu::teht.

ferner umfuftt der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Beotiiu/uung von Calcium, vorzugsweise in biologischen Flüssigkeiten, durch 1.': es sung der LiontaQ.sorption des aus einer calciumhaltigen }?robe und einem mit Galoiuraionen Komplexe bildendem ^arbreageriz in einem Puffersystem gebildeten Komplexes, das dadurch gekonnte ic hnet ist, daß da.s Paffersystem aus einem Gemisch von Amidooulfonsäure, Dinatriumtetraborat und Alkalicarbonat besteht.

Als Reagensien zur Komplexierung von Calcium nach der Erfindung sind! z. B. Phthaleinpurpur oder Eriochromblau SE, Alizarin und andere bekannte Komplexbildner geeignet. Phthaleinpurpur hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Es hat sich als zweckmäßig herausgestellt, zur Maskierung der bei der Bestimmung störenden Magnesiumionen, dem Reagenz außerdem noch 8-Hydroxychinolinsulfat zuzugeben.

Überraschenderweise konnte im Gemisch Amidosulfonsäure/Dinatriumtetraborat/Alkalicarbonat ein Puffer gefunden werden, der leicht zu handhaben ist, der haltbar ist und der die Bestimmung von Calcium mit Komplexbildnern wie Phthaleinpurpur sowohl aus wäßrigen Lösungen als auch aus biologischen Flüssigkeiten in reproduzierbarer Weise ermöglicht. Me Eichkurve ist linear, eine Enteiweißung ist nicht nötig.

Als Alkalicarbonate kommen Natrium- und Kaliumcarbonat, insbesondere Natriumcarbonat infrage.

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Vorzugsweise verwendet man einen ^nidos'ulfcmüäirre-Borax-Ilatriutncarbonat-Puffer vom pH 9,9, welcher pro Liter ζ. Β,

4,4 g Amidosulfonsäure

0,65 g Dinatriumtetraborat . 10 H₂O (Borax) und 10,44 g H atriumc arb onat

enthält. Der pH-Wert kann durch entsprechende Veränderung der Menge Natriumcarbonat variiert v/erden zwischen 8,5 vmd 12v vorzugsweise soll er zwischen 8,9 und 10,0 liegen _t

Die Molarität des Puffers kann variiert werden durch gleichzeitige Erniedrigimg oder Erhöhung der Mengen aller 3 Bestandteile um das 0,5- bis 2,Ofache. Hit steigender Molarität nehmen der pH~»Yert und der Blindwert zu.

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform besteht das Farbreagenz aus einer Lösung von Koinplexbildnern, insbesondere Phthaleinpurpur und 8-Hydroxychinolinsulfat in dem genannten Puffer. Eine gute Empfindlichkeit im Normalbereich (9 - 11 mg Calcium/ 100 ml) erzielt man ζ. B. bei einer Phthaleinpurpurkonzentration von 20 - 80 mg/1000 ml, vorzugsweise von 60 mg/1000 ml. Bei höheren Farbstoffkonzentrationen wird das Verhältnis Blindwert zu Analysenwert zunehmend ungünstiger. Bei einer Hydroxychinolin-sulfat-Menge von 500 - 3000 mg, am besten· 1000 - 1200 mg pro 1000 ml ist die Maskierung von Magnesium optimal. Anstelle von 8-Hydroxychinolinsulfat kann auch die äquivalente Menge 8-Hydroxychinolin eingesetzt werden.

Komplexbildner wie Phthaleinpurpur mid 8-Hydroxychinolinsulfat lösen sich sehr leicht in diesem Puffer. Besonders einfach läßt sich eine Bestimmung durchführen, wenn man das j^arbreagenz zusammen mit der Amidosulfonoäure und evtl. einer,

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inerten Substanz, wie ζ. B. Lactose, Stärke, Talk, Polywachne usw., in vordosierten Mengen in Tabletten ve*rpreßt. Diese werden in einem bestimmten Volumen Pufferlösung gelöst, welches die notwendigen Mengen der übrigen Pufferbestandteile, Borat und Alkalicarbonat, insbesondere Natriumcarbonat, enthält. Nach Auflösung kann die Probe zupipettiert und die Extinktion der Reaktionslosung gemessen werden. Man kommt so mit nur zwei Pipettierungen pro Bestimmung aus.

Gegenüber den bisherigen aufwendigen Methoden zur Calciumbestimmung handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um eine einfache Technik, die es erlaubt, große Serien von Analysen in kurzer Zeit durchzuführen. Das neue Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß es exakte und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Die Fehlerquellen sind weitgehend ausgeschaltet, zumal lediglich zwei Pipettierungen erforderlich sind.

Eine auf den Calciumgehalt zu untersuchende Probe wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit der gepufferten Farbreagenzlösung versetzt und gemischt. Nach 5 bis 45 Minuten, vorzugsweise nach 20 bis 30 Minuten, wird, bei 560 - 580 nm die Extinktion gegen eine Blindprobe gemessen, die anstelle der Probe Wasser enthält. Die gemessene Extinktionsdifferenz ist proportional der in der Probe enthaltenen Calciummenge. Die Meßtemperatur ist nicht kritisch. Es empfiehlt sich, die Bestimmung bei e
durchzuführen.

Stimmung bei etwa 10 - 40⁰C, vorzugsweise bei 20 - 25°G,

Bevorzugt wird das Mittel nach der Erfindung zur Bestimmung von Calcium, mit dem das vorstehend beschriebene Verfahren ausgeführt werden kann, in Form einer Testpaekung ange-

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wandt. Diese Tostpackung entbii.1b eine gebrauchsfertige Pufferlösung oder ein Konzentrat hiervon, eine wäßrige Standardlösung "und Tabletten, die neben vordosierten Mengen von Phthaleinpurpur, Amidosulfonsäure und 8-Hydroxyehinolinsulfat noch Hilfsstoffe enthalten, die an der Komplexbildungsreaktion nicht teilnehmen, wie z. Bo Lactose, Stärke, Talk, Polywaohse usw.

Die CalciumbeStimmung nach der vorliegenden Erfindung läßt sich auch an Analysenautomaten durchführen. Dazu werden die calciumhaltigen Proben über einen Probensammler einem Analysensystem zugeführt, in welchem den einzelnen Proben das Farbreagenz zugegeben wird. Mach Mischung und Ablauf der Komplexierung wird die Reaktionslb'sung einem Kolorimeter zugeführt und gemessen.

Weben der Bestimmung von Calcium in biologischen Flüssigkeiten, wie Blutserum, Blutplasma, Harn, Liquor usw. ist die erfindungsgemäiSe Methode auch für die Industrie, insbesondere die Lebensmittelindustrie von großer Bedeutung. CalciumbeStimmungen sind z. B. von Interesse bei der Analyse von Backpulver, Brot, Mehl, Gesichtspuder, Früchten, Getreide_? Mineralwasser, Salz, Gevräraen, Vitaminen usw.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert .

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Beispiel 1

Das Parbrcagenz enthält pro Liter Pufferlösung

60 ing EhOhaleinpuriHir und
1120 iag e-Hydroxychinolinsulfat.

Die Pufferlösung enthält pro Liter V/asser

4»4 g AraidoDulfonüäure
0,65 g Dinatriumtetraborat · 10 HpO und 10,44 g Natriumcarbonat (bzw. 13,8 g Kaliumcarbonat).

0,1 ml Serum, Plasma oder Harn werden mit 5 ml Parbreagenzlösung versetzt, gemischt und nach 20 Minuten wird hei 560 580 mn (d = 1 cm) die Extinktion gegen eine Blindprobe gemessen, die anstelle der Probe Wasser enthält.

Eine Mikrobestimmung kann mit 1/5 bis 1/10 der genannten Mengen durchgeführt werden.

Die Berechnung erfolgt über einen Standard, der analog behandelt wird. Bei einem Calciuragehalt von mehr als 15 mg/100 ml wird die Probe in geeigneter Weise, z. B. 1+1 mit physiologischer NaCl-Lösung verdünnt und das Ergebnis mit 2 multipliziert.

In einer Variante wurden an Stelle von Phthaleinpurpur die Komplexbildner Alizarin und Eriochrorablau SE eingesetzt. Bei der Verwendung von Alizarin wurde die Messung bei 490 - 610 nm, insbesondere bei 530 nm durchgeführt, während der Meßbereich bei der Verwendung von Eriochromblau SE zwischen 570 und 650 nm, insbesondere bei 600 nm liegt.

Beispiel 2

2 g Gewürz worden in einer Platinnchale bei 550° im Muffelofen vera.soht. llaoh ca. '?. Stunden wird dor Rückstand mit heißer 10 fAf/iX- iJol.znäure digeriert, zur !l'rockno eingeengt, mit verdünn i.'-r V>'-x\ ^rHiU¹.. ;nj^nf mich U; i, und orneut zur /JProokiio eilige— flfjiiijji'i;, I)'/- J{ücl;:.l and wird mit 5 ml 10 '/.■}[·/·..ν V>n±'/,r,!'mv<> und

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50 ml ,"/asser versetzt und einige Minuten in einem siedenden Wasserbad erhitzt. Danach wird filtriert und der unlösliche Rückstand mit Wasser gewaschen. In den vereinigten Filtraten und Waschlösungen wird mit verdünnter Natronlauge ein pH-V/ert von 10,0. eingestellte

In einem aliquoten Teil dieser Lösung wird der Galciumgehalt analog Beispiel 1 bestimmt und über eine Standardlüsung berechnet.

Beispiel 3

1 ml Milch wird mit 9 ml destilliertem Wasser verdünnt. In W 0,1 ml dieser Lösung wird der Calciumgehalt analog Beispiel 1 bestimmt und das Ergebnis mit 10 multipliziert.

Beispiel 4

0»1 g Spinatblätter werden gewaschen, bei 100 - 105⁰O getrocknet und bei 55O⁰C ca. 2 Stunden verascht. Der Rückstand wird in 0,01 N Salzsäure gelöst und auf 10 ml mit destilliertem vfasser aufgefüllt, 0,1 ml dieser Lösung werden analog Beispiel 1 analysiert.

Beispiel 5 · .

Eine Testpackung zur Ausführung von etwa

' 2 χ 10 Analysen,

2x2 Blindwerten und
2x2 Standardlösungen

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enthält die folgenden Bestandteile:

150 ml gebrauchsfertige Borat-Garbonat-Lösung,

1 ml wäßrige Standardlösung (10 mg Ga /100 ml) und 15 Tabletten.

Jede Tablette enthält folgende Bestandteile:

0,60 mg Phthaleinpurpur,
11,20 mg 8-Hydroxychinolinsulfat, 43,98 mg Amidosulfonsäure,
42,22 mg Lactose.

Die gebrauchsfertige Borat-Carbonat-Lösung enthält 45,3*10 Mol/l Dinatriumtetraborat·10 HpO und 0,1 Mol/l Natriumcarbonat.

Zur Herstellung des Parbreagenzes werden 10 Tabletten in 100 ml Pufferlösung gelöst. 0,1 ml einer auf den Galciumgehalt zu untersuchende Probe werden mit 5 ml dieser Farbreagenzlösung versetzt und analog Beispiel 1 das Galcium bestimmt.

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Claims

21U136 Patentansprüche

1. !Mittel zur lcolorimetri sehen Bestimmung von Calcium, vorzugsweise in biologischen Flüssigkeiten, enthaltend ein in Gegenwart von Calciumionen Komplexe bildendes Farbreagenz und ein Puffersystem, dadurch gekennzeichnet, daß das Puffersystem aus einem Gemisch von Amidosulfonsäure, Dinatriumtetraborat und Alkalicarbonat besteht.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Amidosulfonsäure und das Farbreagenz in Form von Tabletten vorliegen.

3. Verfahren zur Bestimmung von Calcium, vorzugsweise in biologischen Flüssigkeiten, durch Messung der Lichtabsorption des aus einer calciumhaltigen Probe und einem mit Calciumionen Komplexe bildendem Farbreagenz in einem Puffersystem gebildeten Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß das Puffersystem aus einem Gemisch von Amidosulfonsäure, Dinatriumtetraborat und Alkalicarbonat besteht.

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