DE3889402T2

DE3889402T2 - Simultanbestimmung von Calcium und Phosphor.

Info

Publication number: DE3889402T2
Application number: DE3889402T
Authority: DE
Inventors: Diane Marian Bates; Robert Leo Czervionke
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1987-09-22
Filing date: 1988-08-24
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2008-08-25
Also published as: AU2245988A; ES2056084T3; JPH01109247A; EP0308670A1; KR890005509A; ATE105415T1; AU610646B2; EP0308670B1; DE3889402D1; CA1324066C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung handelt von der simultanen Bestimmung einer Vielzahl von Substraten mit einem einzigen Reagens durch die Überwachung von Konkurrenzreaktionen, die Änderungen in der Extinktionscharakteristik von elektromagnetischer Strahlung der Probe bewirken. Unter einem Aspekt handelt die Erfindung von der simultanen Bestimmung von Calcium und Phosphor (anorganisches Phosphat) in Blutserum durch die Überwachung von zwei Konkurrenzreaktionen bei zwei oder mehreren verschiedenen Wellenlängen.
Auf dem Gebiet der Diagnostik wurden verschiedene Gehaltsbestimmungen entwickelt, um ein Substrat, das in einem Probenmaterial enthalten sein kann, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Leider ist die Gehaltsbestimmung üblicherweise nur für eine Substratart spezifisch, selbst wenn es wünschenswert wäre, mehr als ein Substrat in einer bestimmten Probe zu diagnostizieren. Dies führt zu mehrfachen Untersuchungen der gleichen Probe, dies steigert die Diagnosekosten und verringert die Effizienz. Es ist daher wünschenswert, ein Diagnoseverfahren zu entwickeln, das in der Lage ist, vielfältige Substrate effizient zu identifizieren oder zu quantifizieren.
Calcium und Phosphor sind zum Beispiel zwei Untersuchungen, die routinemäßig im klinischen chemischen Labor durchgeführt werden. Die Analyse von Calcium durch direkte spektralphotometrische Verfahren beruht generell auf der Bildung eines farbigen Komplexes zwischen Calcium und einem organischen Molekül. Das o-Kresolphthaleinkomplexon wurde für gewöhnlich in den letzten Jahren am meisten verwendet. Es bestimmt quantitativ einen roten Komplex bei 570 bis 575 nm und pH 10 bis 12 und eliminiert die Magnesiuminterferenz mit 8-Hydroxychinolinverbindungen. Alizarin, Arsenazo-III, Chlorphosphonazo-III und Methylthymolblau wurden bei anderen Gehaltsbestimmungen verwendet, um einen farbigen Komplex zu bilden. Die Atomabsorptionsspektroskopie, das Referenzverfahren für Calcium, wird in einigen Labors eingesetzt. (Siehe Kaplan, L. A. und Pesce, A. J., Clinical Chemistry, 1984, p. 1052).
Die Analyse von Phosphor basiert typischerweise auf der Reaktion von Phosphationen mit Molybdat unter Bildung von Phosphomolybdatkomplexen. Die Komplexe werden entweder direkt bei 340 nm und saurem pH-Wert oder nach Reduktion zu Molybdänblau bei 660 nm gemessen. (Kaplan, Seite 1072).
Die oben genannten Gehaltsbestimmungen für Calcium und Phosphor werden mit verschiedenen Reagentien in getrennten Küvetten ausgeführt. Dies ist für das klinische Chemielabor zeitaufwendig und teuer. Durch eine Kombination der beiden Untersuchungen würde das Labor in der Lage sein, die Produktivität zu steigern, und dabei gleichzeitig Kosten zu sparen.
Die Kombination von zwei Untersuchungen ist keine einfache Aufgabe. Bedingungen müssen gewählt werden, die die präzise Messung der beiden Substrate ermöglichen. Zum Beispiel kann die Kombination des Calcium-o-Kresolphthaleinkomplexons (pH 10-12) und des unreduzierten Phosphomolybdatverfahrens (pH etwa 1) wegen der sehr unterschiedlichen pH-Werte nicht verwendet werden. Zusätzlich vereiteln die Chinolinverbindungen, die für die Elimination der Magnesiuminterferenzen bei der Calciumbestimmung verwendet werden, eine Kombination, da sie in der Nähe des Phosphomolybdatkomplexes absorbieren und deshalb die Phosphorbestimmung stören können.
Eine Möglichkeit, zwei Gehaltsbestimmungen in einem einzigen Reaktionsbehälter zu kombinieren, wäre eine sequentielle Gehaltsbestimmung. Bei einer sequentiellen Gehaltsbestimmung wird das Reagens für die erste Gehaltsbestimmung dem Behälter zugesetzt und die Reaktion läuft ab. Kurze Zeit später wird für die erste Komponente eine Konzentration bestimmt. Dann wird ein zweites Reagens, das die erste Reaktion entweder löscht, oder erst zugesetzt wird, nachdem die erste Reaktion abgeschlossen ist, dem Reaktionsbehälter zugesetzt, um eine Reaktion mit der zweiten Komponente auszulösen. Wenige Zeit später wird die Konzentration der zweiten Komponente bestimmt. Diese Reaktionen können entweder bei der gleichen Wellenlänge oder bei verschiedenen Wellenlängen überwacht werden (entweder durch die Benutzung von Filterscheiben oder von Diodenfeldern). U.S. Patent 4425427 nach Luderer offenbart die sequentielle Bestimmung für Glucose und Harnstoff sowie einige simultane Bestimmungen für Analyten jedoch nicht für das Paar Calcium und Phosphor.
Ein automatisiertes Verfahren für die simultane Bestimmung des Serumcalciums (Kresolphthaleinkomplex) und anorganischem Phosphor (Molybdatkomplex) in einem AutoAnalyzer ist aus Chem. Abstr., vol. 79, 1973, no. 50486q bekannt. Ein 3-kanaliges Fließinjektionsverfahren für die simultane Bestimmung von Protein-N, Phosphor (Molybdänblaukomplex) und Calcium (Kresolphthaleinkomplex) wurde in Chem. Abstr., vol. 99, 1983, no. 4165z veröffentlicht.
Ein halbautomatisiertes Verfahren für die simultane Bestimmung von Protein-N, Phosphor (Molybdänvanadiumphosphatkomplex) und Calcium (Kresolphthaleinkomplex) in einem AutoAnalyzer-II-System ist aus Chem. Abstr., vol. 89, 1978, no. 105992r bekannt. Ein halbautomatisiertes Verfahren für die simultane Bestimmung von Protein-N, Phosphor (Molybdänvanadiumphosphatkomplex) und Calcium (Kresolphthaleinkomplex) ist ebenfalls aus Chem. Abstr., vol. 87, 1977, no. 132412s bekannt. Eine kontinuierliche Fließtechnik für die simultane Bestimmung von Calcium und anorganischem Phosphat (Phosphomolybdatmethylgrünkomplex) in Serum und Harn ist aus Chem. Abstr., vol. 81, 1974, no. 165738g bekannt.
U.S. Patent 3925162 beschreibt die simultane Bestimmung der Enzymaktivität in Körperflüssigkeiten. Bei diesem Lösungsansatz wird das Substrat für jedes Enzym, das identifiziert werden soll, einem Reaktionsmedium mit anderen Reagentien zugesetzt und die Änderungen in der Extinktion oder Fluoreszenz des resultierenden Reaktionssystems werden gemessen. Die vorliegende Erfindung nutzt eine Möglichkeit, bei der ein einziges Reagenssystem verwendet wird, um die Substrate durch Überwachung der elektromagnetischen Signale des Reaktionsgemisches zu identifizieren oder zu quantifizieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung zielt auf ein Verfahren für die simultane Bestimmung von Calcium- und Phosphorsubstraten (anorganisches Phosphat) mit einem einzigen Reagenssystem in einem Reaktionsgemisch. Das Verfahren umfaßt die Zugabe eines Reagentiensatzes, der einen Reaktanten für jedes zu bestimmende Substrat enthält, wobei jeder Reaktant so gewählt ist, daß er fähig ist, eine einzige elektromagnetische Strahlungsextinktion für das bestimmte Substrat zu liefern und die Berechnung der beiden Substratkonzentrationen zu ermöglichen. Die Substrate werden mit ihrem entsprechenden Reagens unter solchen Bedingungen umgesetzt, daß die chemischen Reaktionen simultan stattfinden. Die Konzentration der Substrate wird durch Messung der Änderungen in der Extinktion oder Fluoreszens des resultierenden Reaktionsgemischs bei unterschiedlichen Wellenlängen, die charakteristisch für jedes zu bestimmende Substrat sind, bestimmt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die simultane Bestimmung von Calcium- und Phosphorsubstraten mit einem einzigen Reagentiensatz in einer Reaktionsmischung durch die Zugabe eines Reagentiensatzes, der ein Chromophor für jedes zu bestimmende Substrat enthält, wobei jedes Chromophor so gewählt ist, daß es fähig ist, eine einzige Extinktionsbande für ein bestimmtes Substrat zu liefern und die Bestimmung des anderen Substrates ermöglicht. Die Substrate werden mit ihrem entsprechenden Chromophor unter solchen Bedingungen umgesetzt, daß die chemischen Reaktionen simultan stattfinden. Die Konzentration der Substrate wird bestimmt durch Messung der Änderungen in der Extinktion oder Fluoreszens des resultierenden Reaktionsgemisches bei unterschiedlichen Wellenlängen, die charakteristisch für jedes zu bestimmende Substrat sind.
Allgemein besteht ein Reagentiensatz für die simultane Gehaltsbestimmung von Calcium und Phosphor aus einem Azofarbstoff in ausreichender Konzentration, um eine Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, und einer sauren wäßrigen Lösung mit einem Molybdatsalz und einem Detergens in ausreichender Konzentration, um die Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.
Ein Reagentiensatz, der für die Ausführung der vorliegenden simultanen Gehaltsbestimmung geeignet ist, enthält Chlorphosphonazo- III in ausreichender Konzentration, um die Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, und er enthält Natrium- oder Ammoniummolybdat, eine Säure (bevorzugt Schwefelsäure) in ausreichender Menge, um den Reagentiensatz auf etwa pH 2 einzustellen, und ein Detergens in ausreichender Konzentration, um die Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.
Ein weiterer Reagentiensatz, der für die Ausführung der vorliegenden simultanen Gehaltsbestimmung geeignet ist, enthält Chlorphosphonazo-III oder Arsenazo-III in ausreichender Konzentration, um die Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, und er enthält Ammoniummolybdat, Essigsäure/NaOH in ausreichender Menge, um das Reagenssystem auf etwa pH 4 einzustellen, und ein Detergens in ausreichender Konzentration, um Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung handelt von einem Verfahren für die simultane Bestimmung von mehreren Substraten in einer biologischen Flüssigkeit. Das genannte Verfahren besteht aus der Zugabe eines einzigen Reagens zu einer Probe für die Bestimmung jeden Substrates durch die gleichzeitige Überwachung verschiedener elektromagnetischer Signale.
Die elektromagnetischen Signale können gleichzeitig durch ein Spektralphotometer oder ein Spektrofluorometer überwacht werden. Die Messung der Änderungen im Reaktionsgemisch kann mit jedem Meßgerät durch konventionelle Verfahren ausgeführt werden. Die besondere Änderung im System, z.B. die Wellenlänge, ist nicht kritisch, aber es ist wünschenswert, daß die Änderungen oder Differenzen in der Wellenlänge so groß wie möglich sind, vorausgesetzt, daß sie gleichzeitig überwacht werden können.
Bei einer simultanen Gehaltsbestimmung wird ein Reagens mit allen Komponenten für die Reaktion mit den Substraten, die gemessen werden sollen, der Probe zugesetzt und die Reaktionen werden durch das Meßgerät überwacht. Typischerweise wird eine simultane Gehaltsbestimmung in einer einzigen Küvette mit einem einzigen Reagens durchgeführt, was die Notwendigkeit einer zweiten Reagenszugabe oder anderer möglicher Schritte, die allgemein mit Mehrfachsubstratgehaltsbestimmungen verbunden sind, beseitigt.
Ein Schlüssel zum Entwurf einer simultanen Gehaltsbestimmung ist die Auswahl von Reagentien, die die Umsetzungen gleichzeitig ermöglichen, und die die genaue Bestimmung der beiden Analyte im klinisch relevanten Bereich erlauben. Die Reaktanten werden für jedes zu bestimmende Substrat so ausgesucht, daß jeder in der Lage ist, eine einzige elektromagnetische Strahlungsextinktion für ein bestimmtes Substrat zu erzeugen. Ein Reaktant kann ein Chromophor oder ein Indikatorfarbstoff sein, wo die Reaktion über die spektrale Wellenlänge überwacht wird. Durch die Wahl von geeigneten Chromophoren zum Beispiel kann eine Gehaltsbestimmung entwickelt werden, die Calcium und Phosphor simultan, wie unten beschrieben, bestimmt.
Nachdem der geeignete Reaktant ausgewählt worden ist, wird die Probe dem Reagenssystem zugefügt, das die entsprechenden Reaktanten enthält. Reagens und Probe werden so gemischt, daß jedes Substrat mit seinem entsprechenden Reaktant unter solchen Bedingungen zusammengebracht wird, daß die Reaktionen gleichzeitig stattfinden. Die Zugabe und Mischung von Probe und Reaktant wird durch Meßgeräte überwacht, die für die stattfindenden Reaktionen geeignet sind, wie z. B. die Messung der Änderung in der Extinktion oder Fluoreszenz des resultierenden Reaktionsgemisches bei einer Mehrzahl von Wellenlängen, die für jedes zu bestimmende Substrat charakteristisch sind.
Bevorzugterweise wird mit der Überwachung des Reaktionsgemisches sofort begonnen, sobald Reagens und Probe vermischt werden. Dies ermöglicht die Überwachung von Änderungen entweder in der Reaktionsgeschwindigkeit oder der Endpunktreaktion für das überwachte elektromagnetische Signal.
Die genannten Verfahren ermöglichen die simultane Messung von Calcium und Phosphor (anorganisches Phosphat) im Blutserum mit Hilfe eines einzigen Reagens. Die Calcium- und die Phosphorreaktion finden gleichzeitig statt unter Messung der beiden verschiedenen Reaktionen, die bei zwei verschiedenen Wellenlängen durch ein Spektralphotometer überwacht werden. Das Spektralphotometer verwendet einen Diodenfelddetektor, der die Fähigkeit hat, viele Wellenlängen gleichzeitig zu überwachen.
Allgemein besteht ein Reagentiensatz für die simultane Gehaltsbestimmung von Calcium und Phosphor aus einem Azofarbstoff in ausreichender Konzentration, um eine Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, und einer sauren wäßrigen Lösung mit einem Molybdatsalz und einem Detergens in ausreichender Konzentration, um Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.
Unter einem Aspekt erfolgt die Messung von Calcium unter Verwendung eines Azofarbstoffes wie Chlorphosphonazo-III. Das Extinktionsmaximum liegt nahe bei 660 nm mit relativ geringer Extinktionsänderung im Bereich von etwa 330 bis etwa 400 nm. Dies ermöglicht die Kopplung des Calciumreagens mit einem Phosphorreagens bei pH 2 mit einem Molybdatsalz und einem Detergens, das im Bereich von etwa 330 bis etwa 400 nm, ohne Extinktionsänderung bei etwa 660 nm, überwacht werden kann. Außerdem ist der Azofarbstoffcalciumindikator ideal geeignet für die Kombination mit dem Phosphorreagens bei pH 2, da der Farbstoff bei pH 2 bis 5 einen ausreichenden molaren Absorptionskoeffizienten und im wesentlichen keine Interferenzen durch Magnesium aufweist (CRC Handbook of Organic Analytical Reagents, K.L. Cheng, K. Ueno, T. Imamura, CRC Press, Boco Raton, FL, p. 173, Fig. 5, 1982). Dadurch wird es möglich, Magnesiuminterferenzen in der Calciumgehaltsbestimmung durch die Wahl des pH-Wertes und nicht durch Zugabe einer Komponente zu entfernen, die die simultane Phosphorgehaltsbestimmung beeinflussen könnte. Der pH-Wert des Reagenssystems kann durch die Zugabe von einer Säure wie Schwefelsäure eingestellt werden.
Das Molybdatsalz bei der Phosphorbestimmung ist bevorzugt Natrium- oder Ammoniummolybdat. Der Phosphoranteil in diesem Reagentiensatzverfahren zur simultanen Gehaltsbestimmung ist ähnlich wie das Verfahren von Munoz, et al., Clin. Chem. 29:372, (1983), auf das hier verwiesen wird, modifiziert zur Durchführung mit einem Azofarbstoff. Spezifischerweise betrifft die Änderung den Austausch von Salpetersäure durch Schwefelsäure, da Salpetersäure einen Azofarbstoff zersetzen kann (CRC Handbook, p. 171).
In einem anderen Ansatz zur simultanen Gehaltsbestimmung besteht der Calciumteil im Reagentiensatz aus einem Azofarbstoff, bevorzugt Chlorphosphonazo-III oder Arsenazo-III bei etwa pH 4. Die Reaktion wird bei etwa 660 nm überwacht. Es gibt nur eine geringe Änderung in der Extinktion bei 340 oder 364 nm, so daß diese Reaktion den Phosphorteil der Gehaltsbestimmung nicht beeinflussen wird. Wie oben, wurde der pH so gewählt um Magnesiuminterferenzen aufzuheben.
Der Phosphor- oder anorganische Phosphatteil dieses Reagentiensatzes enthält ein Ammonium- oder Natriummolybdat, Detergens und Essigsäure und wird mit NaOH auf pH 4 eingestellt. Typische Detergentien, die verwendet werden können, sind Brij-35, eine Handelsmarke von ICI Americas, Inc., Wilmington, Delaware, für Polyoxyethylen-(23)- laurylether und Natriumdodecylsulfat. Das Phosphorverfahren ist ähnlich wie das Verfahren von Atkinson, et al., Biochemical et Biophysica Acta 320:195 (1973), auf das sich hier bezogen wird, modifiziert durch Erhöhung der Detergenskonzentration zur Lösung der Serumkomponenten. Bevorzugterweise ist das Natriumdodecylsulfat erhöht, um die Serumkomponenten löslich zu machen. Die Reaktion von Phosphat mit Molybdat wird überwacht im Bereich von etwa 330 bis etwa 400 nm, bevorzugterweise von etwa 340 bis etwa 364 nm. Es gibt nur eine unbedeutende Extinktionsänderung bei 660 nm, so daß diese Reaktion den Calciumteil dieser Gehaltsbestimmung nicht beeinflußt.
Um die vorliegende Erfindung näher zu beschreiben, werden die folgenden Beispiele gebracht.

BElSPIEL 1

Simultane Gehaltsbestimmung von Calcium/Phosphor

Das folgende Vorgehen beschreibt ein Verfahren für die simultane Gehaltsbestimmung für Calcium und Phosphor durch die Überwachung der Endpunkte sowohl der Calcium- als auch der Phosphorreaktion. Ein einzelner Reagentiensatz wurde hergestellt durch die Präparation einer wäßrigen Lösung von 20 mM Natriummolybdat und 250 Milliliter je Liter (ml/l) 40%-iges Triethanolaminlaurylsulfat. Die wäßrige Lösung wurde auf einen pH-Wert von 2 mit 17,8 M H&sub2;SO&sub4; eingestellt, mit vollentsalztem Wasser auf Volumen verdünnt, und 0,1 Millimol je Liter (mM) Chlorphosphonazo-III wurde zugefügt.
Eine Serumprobe (human) wurde dem Reagens im Verhältnis 1:25 zugefügt und das ganze gemischt. Nach zwei Minuten wurde die Extinktion für Phosphor bei 340 nm und für Calcium bei 660 nm abgelesen. Eine weitere Gehaltsbestimmung wurde, wie beschrieben, durchgeführt, die Extinktion wurde jedoch für Phosphor bei 364 nm und für Calcium bei 660 nm abgelesen. Die Konzentrationen wurden durch Vergleich mit Standardkurven bestimmt.

BEISPIEL 2

Simultane Gehaltsbestimmung von Calcium/Phosphor

Das folgende Vorgehen beschreibt ein Verfahren für die simultane Gehaltsbestimmung für Calcium und Phosphor durch die Überwachung der Endpunkte sowohl der Calcium- als auch der Phosphorreaktion. Ein einzelnes Reagenssystem wurde hergestellt durch die Präparation einer wäßrigen Lösung von 2,9 mM Ammoniumheptamolybdat und 250 ml/l 40%-iges Triethanolaminlaurylsulfat. Die wäßrige Lösung wurde auf einen pH-Wert von 2 mit 17,8 M H&sub2;SO&sub4; eingestellt, mit vollentsalztem Wasser auf Volumen verdünnt, und 0,1 mM Chlorphosphonazo-III wurde zugefügt.
Eine Serumprobe (human) wurde dem Reagens im Verhältnis 1:25 zugefügt und das ganze gemischt. Nach zwei Minuten wurde die Extinktion für Phosphor bei 340 nm und für Calcium bei 660 nm abgelesen. Eine weitere Gehaltsbestimmung wurde genauso wie beschrieben durchgeführt, die Extinktion wurde jedoch für Phosphor bei 364 nm und für Calcium bei 660 nm abgelesen. Die Konzentrationen wurden durch Vergleich mit Standardkurven bestimmt.

BElSPIEL 3

Simultane Gehaltsbestimmung von Calcium/Phosphor

Das folgende Vorgehen beschreibt ein Verfahren für die simultane Gehaltsbestimmung von Calcium und Phosphor durch die Überwachung der Endpunkte sowohl der Calcium- als auch der Phosphorreaktion. Ein einzelner Reagentiensatz wurde hergestellt durch die Präparation einer wäßrigen Lösung aus
0,1 mM Chlorphosphonazo-III
100 ml/l 4 %-ige Brij-35
100 ml/l 10 %-iges Natriumdodecylsulfat
250 ml/l (1,3 %-iges) Ammoniumheptamolybdat
550 ml/l 0,17 M Essigsäure, mit NaOH auf pH 4 eingestellt.
Eine Serumprobe (human) wurde dem Reagens im Verhältnis 1:25 zugefügt und das ganze gemischt. Nach 2 Minuten wurde die Calciumreaktion bei 660 nm abgelesen und Phosphor wurde bei 340 nm bestimmt. Eine weitere Gehaltsbestimmung wurde wie beschrieben durchgeführt, die Extinktion wurde jedoch für Phosphor bei 364 nm und für Calcium bei 660 nm abgelesen. Die Konzentrationen wurden durch Vergleich mit Standardkurven bestimmt.

Claims

1. Ein Verfahren für die simultane Bestimmung der Konzentration von Calcium- und Phosphorsubstraten in einer einzelnen Testprobe mit einem einzigen Reagentiensatz, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:

Zufügen des einzigen Reagentiensatzes, bestehend aus einem Reaktanden für jedes Calcium- und Phosphorsubstrat, zu der Testprobe in einem einzigen Schritt, wobei jeder Reaktant so gewählt ist, daß er in der Lage ist, ein diskretes elektromagnetisches Strahlungssignal für das entsprechende Calcium- oder Phosphorsubstrat zu liefern, wobei die Calciumbestimmung die Phosphorbestimmung nicht beeinflußt, und die Phosphorbestimmung die Calciumbestimmung nicht beeinflußt;

Umsetzung der Testprobe mit dem Reagentiensatz, wobei die Calcium- und Phosphorsubstrate gleichzeitig mit ihrem entsprechenden Reaktanden reagieren;

Überwachung der Änderungen der Extinktion oder der Fluoreszenz des resultierenden Reaktionsgemisches bei zwei oder mehreren Wellenlängen, von denen mindestens eine charakteristisch für das Calciumsubstrat und mindestens eine charakteristisch für das Phosphorsubstrat ist, wodurch die Berechnung der beiden Substratkonzentrationen ermöglicht wird.

2. Ein Verfahren für die simultane Bestimmung der Konzentration von Calcium- und Phosphorsubstraten in einer einzelnen Testprobe mit einem einzigen Reagentiensatz, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:

Zufügen des einzigen Reagentiensatzes, der ein Chromophor für jedes Calcium- und Phosphorsubstrat umfaßt, zu der Testprobe in einem einzigen Schritt, wobei jedes Chromophor so gewählt ist, daß es in der Lage ist, einen Beitrag zu einem elektromagnetischen Strahlungssignal des entsprechenden Calcium- oder Phosphorsubstrates zu liefern, wobei die Calciumbestimmung die Phosphorbestimmung nicht beeinflußt, und die Phosphorbestimmung die Calciumbestimmung nicht beeinflußt;

Umsetzung der Testprobe mit dem Reagentiensatz, wobei die Calcium- und Phosphorsubstrate gleichzeitig mit ihrem entsprechenden Chromophor reagieren;

Überwachung der Änderungen der Extinktion oder der Fluoreszenz des resultierenden Reaktionsgemischs bei zwei oder mehreren Wellenlängen, von denen mindestens eine charakteristisch für das Calciumsubstrat, und mindestens eine charakteristisch für das Phosphorsubstrat ist, wodurch die Berechnung der beiden Substratkonzentrationen ermöglicht wird.

3. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Reagentiensatz einen Azofarbstoff in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, und eine saure wäßrige Lösung mit einem Molybdatsalz und einem Detergens in einer ausreichenden Konzentration, um die Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.

4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Reagentiensatz Chlorphosphonazo-III in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, und Natrium- oder Ammoniummolybdat und Schwefelsäure in einer ausreichenden Menge, um den Reagentiensatz auf etwa pH 2 einzustellen, und ein Detergens in einer ausreichenden Konzentration, um die Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.

5. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Reagentiensatz Chlorphosphonazo-III in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, und Ammoniummolybdat und Essigsäure/NaOH in einer ausreichenden Menge, um den Reagentiensatz auf etwa pH 4 einzustellen, und ein Detergens in einer ausreichenden Konzentration, um die Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.

6. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Reagentiensatz Arsenazo-III in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, und Ammoniummolybdat und Essigsäure/NaOH in einer ausreichenden Menge, um den Reagentiensatz auf etwa pH 4 einzustellen, und ein Detergens in einer ausreichenden Konzentration, um die Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.

7. Ein Reagentiensatz für die simultane Bestimmung von Calcium und Phosphor, umfassend einen Azofarbstoff in einer ausreichenden Konzentration, um die Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen und eine saure wäßrige Lösung, die Molybdatsalz und Detergens in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.

8. Ein Reagentiensatz nach Anspruch 7 mit Chlorphosphonazo-III in einer ausreichenden Konzentration, um die Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, der Natrium- oder Ammoniummolybdat und Schwefelsäure in einer ausreichenden Menge enthält, um den Reagentiensatz auf etwa pH 2 einzustellen, und der ein Detergens in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.

9. Ein Reagentiensatz nach Anspruch 7 mit Chlorphosphonazo-III in einer ausreichenden Konzentration, um die Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, der Ammoniummolybdat und Essigsäure/NaOH in einer ausreichenden Menge enthält, um den Reagentiensatz auf etwa pH 4 einzustellen, und der ein Detergens in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.

10. Ein Reagentiensatz nach Anspruch 7 mit Arsenazo-III in einer ausreichenden Konzentration, um die Endpunktbestimmung von Calcium zu ermöglichen, der Ammoniummolybdat und Essigsäure/NaOH in einer ausreichenden Menge enthält, um den Reagentiensatz auf etwa pH 4 einzustellen, und der ein Detergens in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Serumkomponenten zu lösen und eine Endpunktbestimmung von Phosphor zu ermöglichen.