DE2530036B2

DE2530036B2 - Verfahren zur Bestimmung von Harnstoff in Flüssigkeiten

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Publication number: DE2530036B2
Application number: DE2530036A
Authority: DE
Inventors: David H. Indianapolis Ind. Jung (V.St.A.)
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1974-07-05
Filing date: 1975-07-04
Publication date: 1978-03-02
Also published as: DE2530036A1; DE2530036C3; JPS5442796B2; JPS5119590A; AU8121075A; US3890099A; CA1044583A

Description

Harnstoff ist das Hauptendprodukt des Eiweißstoffwechsels im Körper. Die Bedeutung der Harnstoffkonzentration im Blut liegt darin, daß sie ein Indikator für die Nierenfunktion ist. Eine Erhöhung der Harnstoffkonzentration im Blut zeigt eine unzureichende Nierenfunktion an und obwohl der Harnstoff selbst harmlos ist, werden unweigerlich auch toxische Substanzen im Blut mit festgehalten in einer Menge, die grob gesagt derjenigen des Harnstoffs entspricht. Aus diesem Grund ist ein hoher Gehalt an Nicht-Eiweiß-Stickstoff oder Blut-Harnstoff-Stickstoff ein Grund zu ernster Besorgnis für den Mediziner. Die Harnstoff konzentration im Blut wird jedoch durch die Nahrung beeinflußt, so daß viele Menschen, die schlecht ernährt sind oder die eine eiweißarme Nahrung zu sich nehmen, Blut-Stickstoff-Gehalte haben können, die keine genaue Anzeige für die Nierenfunktion sind.

Die üblichste Ursache für hohe Blut-Harnstoff-Werte (Urämie) sind Nierenerkrankungen, die entweder akut oder chronisch sein können. Alle entzündlichen, degenerativen, kongenitalen oder neoplastischen Erkrankungen, die die Niere beeinflussen, können zur Urämie führen und der Grad der Urämie ergibt einen groben Hinweis auf die Schwere der vorliegenden Erkrankung.

Es sind verschiedene Verfahren bekannt, die routinemäßig zur Bestimmung von Harnstoff in biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Plasma oder Urin angewandt werden. Bei dem üblichsten Verfahren wird Harnstoff zu Ammoniumcarbonat hydrolysiert mit Hilfe des Enzyms Urease in Gegenwart einer Pufferlösung. Ammoniak wird aus dem Carbonat durch Zugabe von Natriumhydroxid freigesetzt und dann in 0,05 η Salzsäure destilliert. Die vorhandene Stickütoffmenge wird dann colorimetrisch bestimmt. Dieses Verfahren ist im einzelnen in Manual of Clinical Laboratory Methods, 4. Ausgabe von Opal Heffler Verlag von Charles Thomas, Springfield, Illinois, beschrieben.

Andere Verfahren zum Nachweis von Harnstoff in verschiedenen Körperflüssigkeiten sind in der klinischen Chemie bekannt. Bei einem derartigen Verfahren wird die chemische Hydrolyse angewandt, und es sind spezielle Vorrichtungen erforderlich, die in einem Labor zur Durchführung von Routineuntersuchungen nicht immer zur Verfugung stehen. Bei einem anderen Verfahren wird eine direkte colorimetrischc Reaktion von Harnstoff in einem proteinfreien Filtrat mit einem organischen Reagens wie Diacetylmonoxim angewandt. Ein weiteres Verfahren umfaßt einen Test, bei dem mit Hilfe des Enzyms Urease Harnstoff in ein Ammoniumsalz umgewandelt wird, das durch Titra-

tion oder mit Hilfe von Nessler's Reagens (nesslerization) bestimmt wird. Diese bekannten Verfahren besitzen den Nachteil, daß sie alle ein hohes Maß an Erfahrung und Vertrautheit mit komplizierten Laborverfahren erfordern. Außerdem sind bei einigen dieser bekannten Tests teilweise instabile Reagentien oder die Anwendung von hohen Temperaturen, üblicherweise im Bereich von mehr als 90° C, erforderlich.

Zu den typischen bekannten Bestimmungsverfahren gehört die Farbreaktion mit Diacetylmonoxim, die zuerst von Fearon, Biochemistry Journal, 33, 902 (1939) beschrieben worden ist. Verschiedene Verbindungen, die Ureidogruppen enthalten, ergeben im allgemeinen eine meßbare Gelbfärbung mit Diacetylmonoxim. Bei dem Verfahren von Fearon wird die Probe mit Diacetylmonoxim in saurer Lösung unter Bildung eines gefärbten Produktes behandelt. Die Intensität der entstehenden Farbe kann dann colorimetrisch gemessen werden und ergibt einen Wert, der zu der Konzentration von Harnstoff-Stickstoff in der Probe in Beziehung steht. Die Diacetylmonoxim-Analysen haben typischerweise zwei Reagientien erfordert. Ein erstes Reagens, umfassend das Diacetylmonoxim und ein zweites Reagens, umfassend eine wäßrige Säure oder andere Bestandteile. Thiosemicarbazid wurde angewandt, um die Farbe und Farbänderung von gelb zu rot zu intensivieren (Coulombe et al, Clinical Chemistry, 9, 102-8 (1963). Die Reaktion ist weiter modifiziert worden, indem man die Diacetylmonoxim-Harnstoff-Reaktion in schwach saurer Lösung durchführte, enthaltend Thiosemicarbazid und Eisen-III-ionen (Marshetal, Clinical Chemistry, 11, 624-7 (1965).

Allgemein wurde der quantitative Nachweis von Harnstoff lange Zeit als unersetzliches Mittel bei der Analyse von Krankheiten angesehen. Bisher haben Versuche, den Blutharnstoffgehalt zu bestimmen, jedoch an gewissen Unzulänglichkeiten gelitten. Hierzu gehört das Erfordernis von hohen Temperaturen im Bereich von 90° C, die Anwendung von üblicherweise instabilen Reagentien, die Einführung von merklichen Ungenauigkeiten auf Grund falscher Farbbildung durch Wechselwirkung von Reagentien, die Unmöglichkeit, Proben schnell zu bestimmen und schließlich das Erfordernis von hochspezialisierten Ausrüstungen und sehr erfahrenem Personal zur Bedienung dieser Ausrüstungen.

Diese und andere Nachteile besitzen die bekannten Verfahren, wie sie angegeben sind in der US-PS 3718543, US-PS 3511611 und US-PS 3119751.

In der US-PS 3718432 ist angegeben, Ammoniak und organische Aminoverbindungen, insbesondere Aminosäuren, unter Verwendung von o-Phthalaldehyd zu bestimmen. Dabei wird in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie eines Alkaliborhydrids, bei einem pH-Wert von 6 bis 13 gearbeitet. Bei diesem Verfahren, das sowohl auf Aminosäuren als auch auf freien. Ammoniak anspricht, entsteht ein fluoreszierendes Produkt, das zum Nachweis der Aminoverbindungen dient. Auf die Anwendung dieses Verfahrens zur Bestimmung von Harnstoff findet sich kein Hinweis. Nach der US-PS 3 375 079 wird N-(1-Naphthyl)-äthylendiamin-dihydrochlorid als Reagens zur Bestimmung von gasförmigem Stickstoffdioxid als Reagens zur Bestimmung von gasförmigen Stickstoffdioxid in der Luft verwendet. Nach diesem Verfahren wird in Gegenwart von Stickstoffdioxid unter Anwen-

dung veischiedener spezifischer Reagentien ein Diazofarbstoft gebildet, der das Vorhandensein von Stickstoffdioxid in der Luft anzeigt.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung des Harnstoffgehaltes in Flüssigkeiten zu entwickeln, bei dem keine hohen Reaktionstemperaturen und aufwendigen Apparaturen erforderlich sind, stabile Reagentien angewandt werden können und das leicht an automatische und manuelle Systeme angepaßt werden kann und das auch in Gegenwart von Ammoniak zu zuverlässigen Ergebnissen führt.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zur Bestimmung von Harnstoff in Flüssigkeiten, wobei man die Probe mit o-Phthalaldehyd vermischt und nach einer bestimmten Zeit die entstehende Farbe colorimetrisch mißt, erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man zusätzlich N-(l-Naphthyl)-äthylendiamin-dihydrochlorid verwendet.

Im Rahmen dieser Beschreibung ist der Ausdruck »Flüssigkeiten« so zu verstehen, daß er Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Blutplasma, Urin, Knochenmarkflüssigkeit sowie wäßrige Lösungen, enthaltend Harnstoff, umfaßt. Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise auf Blutserum angewandt wird, kann es selbstverständlich auch auf alle anderen Flüssigkeiten angewandt werden.

Die bisherigen Verfahren zur Bestimmung von Blutharnstoffkonzentrationen umfaßten im allgemeinen die Messung von Blutstickstoff, aus dem der Blutharnstoffgehalt berechnet werden konnte, und nicht die günstigere direkte Messung von Harnstoff. Die indirekte Messung von Harnstoff durch Messung von Blut-Stickstoff führt zu Problemen mit der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf Grund des fast ständigvorhandenen Ammoniaks, der natürlich zu erhöhten Stickstoffgehalten führt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Harnstoffgehalt von Blutserum direkt gemessen und als Reagentien werden o-Phthalaldehyd und N-(1-Naphthyl)ä£hylendiamin-dihydrochlorid angewandt. Diese Reagentien sind im Handel erhältlich und insofern vorteilhaft, als sie sehr stabil sind und im Gemisch miteinander nicht nennenswert miteinander in Wechselwirkung treten und dadurch zu einer Verfärbung führen, die sich von der durch Wechselwirkung mit dem Blut entstehenden unterscheidet.

Das erste Reagens ist o-Phthalaldehyd, von dem eine Lösung folgendermaßen hergestellt werden kann: Die im folgenden angegebenen speziellen Gewichte und Volumina sind selbstverständlich nicht kritisch und die Reagentien können in anderen Mengen je nach Wunsch miteinander vermischt werden. Ungefähr 100 bis ungefähr 700 mg o-Phthalaldehyd und ungefähr 0,75 ml 30%iger Polyoxyäthylen(23)lauryläther werden in ungefähr 1000 ml 0,1 η Schwefelsäure gelöst. Das ergibt die gewünschte Konzentration an dem ersten Reagens, o-Phthalaldehyd. Das zweite Reagens ist N-(1-Naphthyl)äthylcndiamin-dihydrochlorid, das in Lösung hergestellt wird durch Vermischen von ungefähr .5 g Borsäure mit ungefähr 600 ml Wasser und unge'ähr 220 ml konzentrierter Schwefelsäure. Das entstehende Gemisch wird auf ungefähr Raumtemperatur abgekühlt und zu ungefähr 100 bis 700 mg N-(1-Naphthyl)äthylendiamin-dihydrochlorid und ungefähr 0,75 ml 30% Polyoxyäthylen(23)lauryläther zugegeben. Zu diesem Gemisch wird ausreichend Wasser zugegeben, daß 11 entsteht. Der bei der Herstellung der beiden Reagentien angewandte, als 30%iger Polyoxyäthylen(23)!auryläther bezeichnete Bestandteil ist ein handelsübliches Netzmittel, das leicht zur Verfügung > steht.

Eine Vorstufe für das erfindungsgemäße Verfahren besteht in der Herstellung einer Flüssigkeitsprobe. Flüssigkeitsproben wie Blutserum können nach irgendeinem bekannten Verfahren erhalten werden und

¹⁽¹ Standardverfahren sind in der Literatur beschrieben. Die Flüssigkeitsprobe wird mit dem o-Phthalaldehydreagens vermischt. Die relativen Mengen an Flüssigkeit und o-Phthalsäurenaldehyd sind nur in dem Maße wichtig, daß der Grad der entwickelten Farbe durch

i> das jeweils angewandte Gerät zur colorimetrischen Bestimmung gemessen werden kann. Zum Beispiel muß um so mehr Flüssigkeit, bezogen auf die Reagentien angewandt werden, eine je stärkere Farbe erforderlich ist, zum Beispiel in weniger empfindlichen

-·' Meßvorrichtungen.

Zu der Lösung aus der zu bestimmenden Flüssigkeit und o-Phthalaldehyd wird das zweite Reagens, N-( 1 Naphthyl)äthylendiamin-dihydrochlorid zugegeben. Nach Zugabe von N-(l-Naphthyl)-äthylendiamin-dihydrochlorid beginnt die Farbreaktion. Bei den meisten Farbreaktionen entwickelt sich die Farbe nach und nach. Daher wäre - obwohl es möglich ist, die Farbentwi-klung sofort zu messen — eine außerordentlich empfindliche Vorrichtung hierfür erforder-

ifi lieh. Obwohl nach dem Vermischen von o-Phthalaldehyd, der Flüssigkeit und N-(1-Naphthyl)äthylendiamin-dihydrochlorid ein Erhitzen nicht erforderlich ist, wird es als günstig angesehen, das Gemisch in einem Inkubator auf ungefähr 37° C zu erwärmen. Das

i> ergibt optimale Ergebnisse und kann bequem mit Hilfe von Standard-Laborausrüstungen durchgeführt werden. Es hat sich als bevorzugt erwiesen, die Reaktionsteilnehmer zu inkubieren und die Reaktion eine vorbestimmte Zeit in der Größenordnung von unge-

4« fähr 2 bis 30 min ablaufen zu lassen und dann die Farbe nach Entnahme aus dem Inkubator zu messen. Die Notwendigkeit dieser Stufe wird jedoch durch die relative Empfindlichkeit der colorimetrischen Meßvorrichtung bestimmt.

Es wird häufig eine Blindprobe angewandt, um ei-

ti^ii τ cigti^t^n Lui t,iut* auouiuit vwivji iiiivu iat*ui* ηυιι,-sung zu ergeben. Diese Blindprobe kann entweder jedesmal durchgeführt werden, wenn eine Flüssigkeitsprobe bestimmt wird, oder einmal am Tag, um einen

^r)0 üblichen Standard zu ergeben, oder jeweils wenn ein neuer Ansatz von Reagentien hergestellt wird. Die tatsächliche Anwendung von Blindproben hängt von der Person ab, die das Verfahren durchführt. Eine Blindprobe wird hergestellt, indem man nur die beiden Reagentien o-Phthalaldehyd und N-(I-Naphthyl)äthylendiamin-dihydrochlorid vermischt und dann die nach einer vorher bestimmten Zeit, die mit der Reaktionszeit des Tests übereinstimmen sollte, entwickelte Farbe mißt.

Obwohl das grundlegende Testverfahren oben beschrieben ist, sind viele Ausführungsformen bei der jeweiligen Messung möglich. Als erstes kann der Test gegebenenfalls automatisiert werden und verschiedene Vorrichtungen, die im Handel erhältlich sind,

bj sind für die automatische Durchführung colorimetrischer Bestimmungen von Blindprober. und/oder zu untersuchenden Proben nach vorher bestimmten Zeiträumen erhältlich. Außerdem kann die Messung

manuell durchgeführt werden. Dabei folgt man natürlich einfach den Verfahrensvorschriften und bestimmt die Farbe der Lösung ni.ch einer bestimmten Zeit mit Hilfe verschiedener Laborvorrichtungen. Ein anderes Verfahren zur colorimetrischen Bestimmung von Pro- "' ben und Blindproben ist das kinetische Verfahren. Bei dem kinetischen Verfahren werden viele Einzelablesungen oder kontinuierliche Ablesungen durchgeführt, während die Reaktion abläuft und die Farbe sich entwickelt. Dabei wird die Farbe natürlich im ^l(1 Laufe der Zeit intensiver. Die vielen Ablesungen können dann angewandt werder, um den Endpunkt der Reaktion zu extrapolieren.

Die. bei diesem Verfahren angewandten Reagentien o-Phthala!dehyd und N-(1-Naphthyl)äthylendiamin-dihydrochlorid sind beide bei üblichenTemperaturen sehr stabil. Das ist natürlich ein deutlicher Vorteil gegenüber bestimmten bekannten Verfahren zur direkten Messung von Blutharnstoff, bei denen bestimmte übliche Reagentien im allgemeinen instabil -'■' sind. Außerdem stellt es einen deutlichen Vorteil dar, daß ein Erhitzen auf ungefähr 90° C nicht erforderlich ist. Bei vielen bekannten Verfahren war ein Erhitzen auf ungefähr 90 bis 100° C, das heißt die Siedetemperatur, erforderlich. Das ist selbstverständlich zeitrau- -'-· bend und teuer. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind keine speziellen Temperaturen erforderlich, und es kann bei jeder Temperatur durchgeführt werden, bei der sich der physiologische Zustand der Reagentien in Flüssigkeiten nicht ändert. Außerdem ist ^J0 die Farbentwicklung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in ungefähr 30 min abgeschlossen. Daher steht es demjenigen, der das Verfahren durchführt, frei, die Probe entweder kontinuierlich colorimetrisch zu messen oder nach 30 min oder in einzelnen Abstän- ^ > den innerhalb eines Zeitraumes von 30 min oder zu irgendeinem vorher bestimmten Zeitpunkt nach der Zugabe von N-(l-Naphthyl)äthylendiamin-dihydrochlorid. Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch eine sehr große Genauigkeit und Reproduzier- -»o barkeit und zeigt eine lineare Abhängigkeit der Absorption von der Konzentration, wodurch die mathematische Berechnung stark vereinfacht wird. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß nur sehr kleine Probengrößen erforderlich sind. Die Probengröße kann von so geringen Mengen wie 1 μΐ bis zu der gewünschten Menge variieren. Das ist natürlich ein deutlicher Vorteil, da Blutproben, die untersucht werden sollen, häufig sehr schwierig zu erhalten sind. >o

Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Eine o-Phthalaldehyd-Reagenslösung wurde folgendermaßen hergestellt:

200mgo-Phthalaldehyd und 0,75 ml 30%iger Polyoxyäthylen(23)lauryläther wurden in 1000 ml 0,1 η · Schwefelsäure gelöst. Jeweils 2,5 ml der o-Phthalaldehydreagenslösung wurde in zwei Reagensgläser ge- bo geben. Das erste Reagensglas wurde als Blindprobe (»the blank Unitube«) bezeichnet und das zweite als Probe (»the sample Unitube«).

500 μΐ Blutserum wurden zu der Probe zugegeben und keines zu der Blindprobe.

Eine Reagenslösung von N-(1-Napthyl)äthylendiamin-dihydrochlorid wurde folgendermaßen herge-5 g Borsäure, 600 ml Wasser und 222 ml konzentrierte Schwefelsäure wurden vermischt. Anschließend wurde das entstehende Gemisch auf ungefähr Raumtemperatur abgekühlt und 600 mg N-(I-Naphthyl)äthylendiamin-dihydrochlorid und 0,75 ml 30%iger Polyoxyäthylen(23)lauryläther zugegeben. Zu diesem Gemisch wurde Wasser auf 1 1 zugegeben. 2,5 ml des N-(1-Naphthyl)äthylendiaminreagenses wurden dann in jedes Reagensglas gegeben. Die Reagensgläser wurden mit Kappen verschlossen, gemischt und 30 min in einen Inkubator bei 37° C gegeben. Nach 30 min wurden sie aus dem Inkubator entnommen und 10 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Zu diesem Zeitpunkt wurden sie in ein Spektrophotometer gegeben und Ablesungen bei 540 nm durchgeführt. Die Blindprobe ergab eine Absorption von 0,120 und die Probe eine Absorption von 0,636. Das zeigt, daß die Probe 80 mg Harnstoff/dl enthielt. Das ist ein abnorm hoher Gehalt und zeigt eine Disfunktion der Niere an.

Beispiel 2

Eine o-Phthalaldehydreagenslösung wurde hergestellt durch Lösen von 400 mg o-Phthalaldehyd und 0,75 ml 30%igen Polyoxyäthylen(23)lauryläther in 100 ml 0,1 η Schwefelsäure. 2,0 ml der o-Phthalaldehydreagenslösung wurden in jedes von zwei Reagensgläsern gegeben. Das erste Reagensglas wurde als Blindprobe und das zweite als Probe bezeichnet. 97,5 ml einer Blutserumprobe wurden dann zu der Probe zugegeben und kein Serum zu der Blindprobe. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Reagenslösung von N-(I-Naphthyi)äthylendiamin-dihydrochlorid auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt und 2,0 ml des Reagensgemisches in jedes Reagensglas gegeben. Die Reagensglär.er wurden 5 min bei 37° C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde 1 Tropfen 1 % Mercaptan zugegeben und gemischt und 5 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Proben wurden mit Hilfe des Meßgerätes bei 540 nm gemessen. Man erhielt eine Absorption für die Blindprobe von 0,017 und für die Probe von 0,30. Das zeigt einen Blutharnstoffgehait von 40 mg/d! Blut an. Das ist ein erhöhter Harnstoffgehalt, der eine Disfunktion der Niere anzeigt.

Beispiel 3

Es wurden sechs o-Phthalaldehyd-Reagenslösungen hergestellt und zwar unter Verwendung von 100, 200,300, 400, 500 und 600 mg o-Phthalaldehyd und 0,75 ml 30%igem Polyoxyäthylen(23)lauryläther in ungefähr 1000 ml 0,1 η Schwefelsäure. Es wurden sechs getrennte Versuche durchgeführt für jede der oben angegebenen Konzentrationen an o-Phthalaldehyd in der Reagenslösung. Jeder der sechs einzelnen Versuche wurde folgendermaßen durchgeführt: 1 ml o-Phthalaldehydreagenslösung wurde in das Reagensglas gegeben. 20 μΐ einer Blutserumprobe wurden in das gleiche Reagensglas gegeben. Es wurde die gleiche Blutserumprobe für alle sechs Versuche verwendet. Die Reagensgläser, die die o-Phthalaldehydreagenslösung und die Blutserumprobe enthielten, wurden 5 min bei 37° C inkubiert. Nach dieser Zeit wurde 1,0 ml N-(l-Naphthyl)äthylendiamin-dihydrochlorid-Reagens-Lösung, wie in Beispiel 1 hergestellt, zugegeben. Die entstehende Lösung wurde dann in eine Küvette gegeben. Die Küvette wurde in eine erwärmte (37° Ci optische Aufnahmevorrich-

tung eines Coleman 124 Spektrophotometers gegeben. Die Reaktion wurde dann kontinuierlich bei einer Wellenlänge von 540 nm 5 min mit Hilfe eines Schreibgerätes verfolgt. Die Absorption nach 2 min wurde von der Absorption nach 5 min abgezogen. Dieser Wert wurde durch drei dividiert und ergab die Änderung der Absorption pro Minute. Es ergab sich eine Änderung der Absorption von 0,015/min, die einen Blutharnstoffgehalt von 50 mg/dl in der Probe anzeigte. Das war ein erhöhter Gehalt und zeigte eine Disfunktion der Niere an. Das oben angegebene Verfahren wurde mit den o-Phthalsäurereagenskonzentrationen von 200, 300, 400, 500 und 600 mg/ml wiederholt. Man erhielt die folgenden Änderungen pro Minute:

200 mg = 0,030

300 mg = 0,043

400 mg = 0,060

500 mg = 0,063

600 mg = 0,072

Bei all diesen Konzentrationen ergibt sich ebenfalls ein erhöhter Harnstoff gehalt, der eine Disfunktion der Niere anzeigt.

Beispiel 4

Es wurde eine o-Phthalaldehydreagenslösung wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt, wobei 200 mg o-Phthalaldehyd verwendet wurden. 0,5 ml der o-Phthalaldehydreagenslösung wurden in jede von 3 Kiivetten gegeben. Zu der ersten Küvette wurden 0,1 ml Wasser, zu der zweiten 10 μΐ eines Harnstoff-Standards enthaltend 15 mg/dl und 90 μΐ Wasser und zu der dritten 10 μΐ einer unbekannten Probe und 90 μΐ Wasser gegeben. Zu jeder der drei Kiivetten wurden 0,5 ml N-(l-Napthyl)äthylendiamin-dihydrochloridreagenslösung zugegeben (das Reagens war wie in Beispiel 3 hergestellt worden). Die drei Kiivetten wurden dann 10 min bei 37° C inkubiert. Die Ablesung der Absorption wurde bei 540 nm in einer Schnellanalysiervorrichtung (fast analyzer) durchgeführt. Eine Absorption von 0,00 wurde für die Küvette 1 erhalten. Eine Absorption von 0,119 für die Küvette 2 und eine Absorption von 0,294 für die Küvette 3. Hieraus ergab sich ein Blutharnstoffgehalt von 41 mg/dl einer unbekannten Probe. Das war ein erhöhter Harnstoffgehalt und zeigte eine Disfunktion der Niere an.

Beispiel 5

Es wurde eine o-Phthalaldehydreagenslösung wie in Beispiel 4 hergestellt, mit der Ausnahme, daß 600 . mg o-Phthalaldehyd zur Herstellung der Lösung verwendet wurden. Es wurden 0,05 ml/min einer Blutserumprobe, 0,6 ml/min Salzlösung (0,9 g NaCl/dl) und 0,32 ml/min Luft in einen Dialysator geleitet. 0,6 ml/min Wasser und 0,32 ml/min Luft wurden in den Dialysator gepumpt. Die Temperatur des Dialysators wurde auf 37° C eingestellt. 0,23 ml/min der oben angegebenen o-Phthalaldehydlösung (600 mg o-Phthalaldehyd) und 0,8 ml/min N-(1-Naphthyl)äthylendiamin-dihydrochlorid (wie in Beispiel 4 hergestellt) wurden in das System gepumpt, dessen Temperatur auf 37° C eingestellt wurde. Die dialysierte Probe und das Reagensgemisch bewegten sich bei 37° C durch eine Schlange mit 28 Windungen und eine Schlange mit 14 Windungen in eine Fließzelle. Die prozentuale Durchlässigkeit wurde bei 505 nm bestimmt und auf einer Schreibvorrichtung notiert. Eine prozentuale Durchlässigkeit von 87,5 wurde für die Probe erhalten. Die Ergebnisse zeigen, daß diese Probe einen Blutharnstoffgehalt von 10 mg/dl besaß, der einem normalen Wert entspricht.

Beispiel 6

Es wurde wie in den Beispielen 2 bis 5 gearbeitet mit der Ausnahme, daß die Temperatur nicht auf 37° C eingestellt wurde. Die Ergebnisse entsprechen "' denjenigen, die bei 37° C erhalten wurden und zeigen, daß die Temperatur nicht kritisch ist, solange die Reaktionszeit nicht nachteilig beeinflußt wird.

Beispiel 7

!"' Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Urin an Stelle von Blutserum angewandt wurde. Die Ergebnisse stimmen mit denjenigen überein, wie sie nach dem colorimetrischen Verfahren erhalten wurden, das beschrieben ist in

4Ii Manual of Clinical Laboratory Methods, 4. Ausg. von Opal Heffler, Charles Thomas, Springfield, Illinois. Das Heffler-Verfahren umfaßt die Hydrolyse von Harnstoff zu Ammoniumcarbonat mit Hilfe des Enzyms Urease in Gegenwart einer Pufferlösung. Es

■n wird Ammoniak aus dem Carbonat durch Zugabe von Natriumhydroxid freigesetzt und dann in eine 0,05 η Salzsäurelösung destilliert. Die Menge des vorhandenen Stickstoffs wird dann colorimetrisch bestimmt.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Bestimmung von Harnstoff in Flüssigkeiten, wobei man die Probe mit o-Phthalaldehyd vermischt und nach einer bestimmten Zeit die entstehende Farbe colorimetrisch mißt, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich N-( 1 -Naphthyl )äthylendiamindihydrochlorid verwendet.