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Reagens für die kolorimetrische Analyse von Ammoniakstickstoff
Die Erfindung betrifft ein Reagens bzw. ein Mehrkomponentenreagens, enthaltend Phenol, ein Alkalinitroprussid und ein Alkalihypochlorit, sowie ein Verfahren zur analytischen Bestimmung von HarnstoffStickstoff. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die chemische Bestimmung von Harnstoff-Stickstoff im Blutserum oder-plasma und im Harn.
Es stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, die routinemässig zur Bestimmung von Harnstoffin biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Plasma oder Harn, angewendet werden. Bei der üblicherweise angewendeten Methode wird Harnstoff mittels des Enzyms Urease in Gegenwart einer Pufferlösung zu Ammoncarbonat hydrolysiert. Aus dem Carbonatsalz wird Ammoniak durch Zugabe von Natriumborat freigesetzt und dann in 0, 05n-Salzsäure destilliert. Die Menge des vorhandenen Stickstoffs wird dann nach Zugabe von Nessler'schem Reagens kolorimetrisch bestimmt. Dieses Verfahren ist im Manual of Clinical Laboratory Methods, 4. Auflage, von Opal Hepler, herausgegeben von Charles C. Thomas, Springfield, 111., näher beschrieben.
Bei einer andern verbreitet angewendeten Methode für die Bestimmung von Harnstoff in biologischen Flüssigkeiten erfolgt die Messung des gelben Pigments, das durch Kondensation von Diacetyl mit Harnstoff in einem proteinfreien Filtrat der Flüssigkeit gebildet wird.
Bei Versuchen zur Schaffung eines Verfahrens, das eine genauere Bestimmung ermöglicht als die unter Verwendung von Nessler's Reagens oder Diacetyl durchgeführten Verfahren und bei denen gleichzeitig mit kleineren Proben das Auslangen gefunden werden kann, haben Fawcett und Scott das bekannte kolorimetrische Verfahren, bei welchem die Reaktion von Ammoniak mit Natriumphenolat, Nitroprussid und Hypochlorit, die unter Bildung einer blauen Farbe erfolgt, ausgenutzt wird, weiter entwickelt. Das Verfahren nach Fawcett und Scott ist in Journ. Clin. Path., Bd. 13 [1960], 5. 156, beschrieben. Dieses Verfahren unterliegt jedoch gewissen Beschränkungen, die dessen Anwendung als Routineanalysenbestimmung ausschliessen. Bei diesem Verfahren ist die Konzentration der Reagentien kritisch. Ferner sind verschiedene gesonderte Reagentien erforderlich.
Diese Vielzahl von Reagentien führt zu einem bei der technischen Durchführung unerwünschten Zeitaufwand bei der Bestimmung. Wenn die Farbreagentien bei der Bestimmung nach Fawcett und Scott nicht rasch nacheinander zugegeben werden, ist die schliesslich erhaltene optische Dichte erheblich vermindert. Eine solche Aufeinanderfolge des Reagentienzusatzes schliesst die gleichzeitige Analyse einer grossen Zahl von Proben aus und bringt eine wesentliche Beschränkung in der praktischen Anwendbarkeit des Verfahrens mit sich. Ferner sind auch einige der von Fawcett und Scott vorgeschlagenen Reagentien instabil, wodurch eine weitere Einschränkung in der Brauchbarkeit des Verfahrens eintritt.
Ziel der Erfindung ist es, ein Reagens für die kolorimetrische Analyse von Ammoniakstickstoff zu schaffen, mit dem die Analyse, insbesondere eine Bestimmung von Harnstoff in biologischen Flüssigkeiten, mit hoher Genauigkeit unter Verwendung minimaler Mengen der Probeflüssigkeit bei nur geringem Aufwand an Laboratoriumseinrichtungen rasch ausgeführt werden kann ; dabei sollen die angewendeten Reagenskomponenten stabil und der Zeitpunkt für deren Zugabe nicht kritisch sein.
Die Erfindung zielt
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auch auf die Schaffung einer zusammengehörigen Einheit eines Mehrkomponentenreagens zur Bestimmung von Harnstoff in biologischen Flüssigkeiten ab, das so zusammengesetzt ist, dass leicht und sicher ohne das Risiko einer Beeinträchtigung der Wirksamkeit des Reagens transportiert werden kann, wodurch analytische Bestimmungen unter Bedingungen erleichtert werden, unter welchen ansonsten solche Bestimmungen ausgeschlossen oder nur in eingeschränktem Umfange durchführbar wären.
Gemäss der Erfindung ist das Reagens für die kolorimetrische Analyse von Ammoniakstickstoff, enthaltend Phenol, ein Alkalinitroprussid und ein Alkalihypochlorit, dadurch gekennzeichnet, dass es einerseits aus einer im wesentlichen wasserfreien Mischung von Phenol und einem Alkalinitroprussid und anderseits aus einer wässerigen, überschüssige Alkaliionen enthaltenden Alkalihypochloritlösung besteht.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält ein solches Mehrkomponentenreagens als Alkalinitroprussid Natriumnitroprussid.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Mehrkomponentenreagens zur Bestimmung von Harnstoffstickstoff in biologischen Flüssigkeiten, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es gepufferte Urease enthält und dass die im wesentlichen wasserfreie Mischung, die wässerige Lösung von Alkalihypochlorit und die gepufferte Urease in einzelnen Ampullen in einer Packung enthalten sind, wobei in der die wässerige Lösung von Alkalihypochlorit enthaltenden Ampulle ein genügender Überschuss an Alkalikationen vorliegt, um das Phenol in der die wasserfreie Mischung enthaltenden Ampulle in ein Alkaliphenolat umzuwandeln.
Bei dieser Ausführungsform der Erfindung wird vorzugsweise als Alkalihypochlorit Natriumhypochlorit verwendet und die überschüssigen Alkalikationen werden von Natriumhydroxyd geliefert.
Ureasepräparate grösserer oder geringerer Reinheit sind im Handel erhältlich. Solche Ureasepräparate können von der Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, U. S. A., bezogen werden. Die in den Beispielen der Erfindung angewendete Urease stammte von dieser Firma. Die Urease hatte eine Aktivität von 800 bis 1000 Sumner-Einheiten je g, gemessen bei 300C. Für die Anwendung beim erfindungsgemä- ssen Verfahren wird die Urease in die Lösung gebracht. Die Lösung wird auf einen pH-Wert gepuffert, der die Enzymaktivität begünstigt und die Stabilität erhöht, wobei übliche Puffer, wie Monokaliumdihydrogenphosphat und Dinatriummonohydrogenphosphat, benutzt werden. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erreicht, wenn ein Chelatbildner, wie Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), als Puffer verwendet wird.
Das Gemisch aus verfestigtem Phenol und Nitroprussid trägt insbesondere erheblich zu den Vorteilen gemäss der Erfindung bei. Bei analogen Verfahren, die vor jenem gemäss der Erfindung benutzt wurden, wurden Lösungen von Natriumphenolat und Natriumnitroprussid als Reagenzien angewendet. Beide Produkte sind in alkalischer Lösung instabil und die Wirksamkeit der Reagenzien nimmt innerhalb relativ kurzer Zeiträume erheblich ab. Gemäss der Erfindung werden diese Reagenzien so modifiziert und kombiniert, dass sie ein einziges Reagens, das überraschende Eigenschaften aufweist, bilden. Da Nitroprussid in Gegenwart von freiem Wasser instabil ist, wobei eine Zersetzung unter Bildung gefärbter Stoffe eintritt, die die kolorimetrische Bestimmung stören, ist dieses Reagens daher so zusammengesetzt, dass es kein solches Wasser enthält.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das feste Phenol durch Erhitzen verflüssigt und in diesem flüssigen Zustand mit Nitroprussid kombiniert. Das Nitroprussid kann entweder in Form eines einzigen Kristalls oder in kleinteiliger Form vorliegen. Anderseits können Phenol und Nitroprussid durch physikalisches Zumischen der Bestandteile als Feststoffe, z. B. in kleinteiliger Form, unter solchen Vermischungs- und Lagerbedingungen vereinigt werden, dass im wesentlichen wasserfreie Bedingungen aufrechterhalten werden und dadurch ein nachteiliger Zerfall des Reagens bei langer Lagerung ausgeschlossen ist.
Die Funktion des Nitroprussids besteht darin, dass es den Katalysator für die Farbreaktion darstellt ; die Geschwindigkeit der Reaktion wird in Gegenwart grösserer Mengen des Katalysators erhöht und in Gegenwart kleinerer Mengen vermindert. Optimale Bedingungen liegen vor, wenn das konzentrierte Reagens etwa 325 mg Phenol und 25 mg Natriumnitroprussid enthält. Dieses konzentrierte Reagens wird gemäss der Erfindung in wässerige Lösung gebracht und zur Verwendung verdünnt. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Menge des Nitroprussids in den Mischungen und beim Verfahren gemäss der Erfindung in weitem Umfange variieren kann, wobei lediglich erforderlich ist, dass es in solcher Menge vorliegt, dass die katalytische Aktivität des Nitroprussids nicht in unerwünschter Weise beeinträchtigt wird, wenn das Reagens gemäss der Erfindung Anwendung findet.
Im Gemisch aus Phenol und Alkalinitroprussid können kleine Mengen Wasser enthalten sein, z. B. 0, 1 ml Wasser je 5 g Phenol, aber dieses Wasser ist dabei vom verfestigten Phenol physikalisch okkludiert und kann mit dem Nitroprussid nicht in Berührung kommen. Die Mischung ist daher unter diesen Bedingungen im wesentlichen wasserfrei.
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Gemäss der Erfindung ist eine der vorgesehenen Reagenskomponenten festes Phenol, im Gegensatz zu bekannten Verfahren, wobei als Reagens Natriumphenolat verwendet wurde. Bei der Ammoniak- bzw.
Harnstoffstickstoffbestimmung gemäss der Erfindung liegt Phenol als Alkalimetallsalz vor. Es sind daher Vorkehrungen getroffen, dass beim Reagens gemäss der Erfindung schliesslich eine Umwandlung des Phenols zu einem Alkalisalz erfolgt. Dies wird dadurch erreicht, dass in der Alkalihypochloritlösung ein genügender molarer Überschuss an Alkalikationen vorgesehen ist, der der Molarität des Phenols angepasst ist, um das Phenol in das gewünschte Phenolat in Lösungen umzuwandeln, die zur Auflösung des Phenols genügend verdünnt und daher zur Bildung von Salzen geeignet sind. Es ist offensichtlich, dass Alkalisalze, wie Natrium- oder Kaliumhydroxyd, -carbonat oder -phosphat die erforderliche Alkalinität ergeben werden. Natriumhydroxyd wird jedoch bei der Herstellung der Mischungen und beim erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt verwendet.
Aus Zweckmässigkeitsgründen wird dieses konzentrierte Reagens gemäss der Erfindung in seiner bevorzugten Form durch Zugabe von 0, 5 g Natriumhypochlorit und 18, 0 g Natriumhydroxyd zu 100 ml Wasser hergestellt. 14 ml dieser Lösung ergeben eine genügende Alkalinität, um 5 g des Phenols in Natriumphenolat umzuwandeln. Bei der Anwendung im Rahmen der Erfindung werden diese konzentrierten Lösungen zuerst durch Zugabe von Wasser in höherem Masse verdünnt.
Bei einer praktischen Ausführungsform der Erfindung sind die konzentrierte gepufferte Urease, das Phenol-Nitroprussid-und das alkalische Hypochloritreagens in einzelnen Fläschchen oder Ampullen enthalten, wobei ein Fläschchen eines jeden Reagens in einem eigenen Behälter, z. B. einer Pappschachtel, eingepackt ist, die geeignet ist, solche Fläschchen aufzunehmen und sie gegen Bruch zu schützen, wenn die Behälter und deren Inhalt in üblicher Weise befördert werden, z. B. als Luft-oder Bahnfracht. Behälter dieser Art sind Handelsartikel und sind als solche nicht Gegenstand der Erfindung.
Bei der Verwendung der oben angegebenen Reagenzien für die praktische Durchführung der Erfindung ist es von Bedeutung, dass bestimmte der Reagenzien in richtiger Reihenfolge zugesetzt werden. Die Urease ist das zuerst verwendete Reagens. Es stellt jenes Reagens dar, das den im Harnstoff enthaltenen Stickstoff in Ammoniakstickstoff umwandelt, in welcher Form dieser mit Natriumphenolat und Hypochlorit reagiert, Sobald die Umwandlung zu Ammoniak erfolgt ist, werden die übrigen Reagenzien nacheinander wie folgt zugegeben. Das Alkalinitroprussig und das Phenol werden entweder gleichzeitig oder nacheinander zugesetzt, wobei wenig oder kein Unterschied besteht, wie diese Zusätze aufeinanderfolgen. Die alkalische Hypochloritlösung wird dann unter Farbentwicklung zugesetzt.
Wenn diese Reihenfolge der Zusätze eingehalten wird, ist es nicht wesentlich, dass die Farbreagenzien rasch nacheinander zugegeben werden. Verzögerungen beim Zusatz des alkalischen Hypochloritreagens, die zwei oder mehr Stunden betragen, haben keinen wesentlichen Einfluss auf die Intensität oder die höchste optische Dichte der Farbe. Das Fehlen eines kritischen Zeitpunktes für die Zugabe der Reagenzien ist von erheblicher praktischer Bedeutung, da dadurch mit einer grossen Anzahl von Proben durchzuführende Bestimmungen ermöglicht werden, ohne dass es notwendig ist, die Zugabe eines der Reagenzien kontinuierlich zu wiederholen, nachdem die andern bereits zugesetzt worden sind.
Ein weiterer Vorteil, der sich bei der Verwendung der Reagenzien und der Verfahren gemäss der Erfindung ergibt, liegt im offensichtlichen Fehlen der Schwierigkeiten, wenn dieselbe Einrichtung, z. B. eine Pipette, für verschiedene Reagenzien benutzt wird. Die Farbreaktion bleibt z. B. unbeeinflusst, wenn dieselbe Pipette für das Phenol-Nitroprussid-Reagens und das alkalische Hypochloritreagens verwendet wird. Es ist lediglich notwendig, dass die Pipette zwischen der Verwendung für diese beiden Reagenzien mit Wasser gespült wird.
Auch kann die Konzentration des Reagens innerhalb weiter Grenzen variiert werden, ohne dass die Intensität oder der Punkt der maximalen spektralen Absorption der Farbe der zu kolorimetrierenden Lösungen beeinflusst wird, wenn diese auf das gleiche Endvolumen verdünnt werden.
Die Einwirkung von Ammoniak, Alkaliphenolat und Alkalihypochlorit führt zur Bildung eines farbigen Stoffes, der zum Stickstoffgehalt einer Probe durch Messung der Farbintensität mit einem geeigneten Instrument, wie einem Beckman-Spektrophotometer oder einem Klett-Summerson-Filterphotometer, in Beziehung gesetzt werden kann. Mit einem Spektrophotometer kann die Absorption wirksam bei 640 mu gemessen werden. Ein Klett-Summerson-Filter Nr. 54 (grün) ist zur Verwendung in einem Filterphotometer geeignet.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert :
Herstellung der Reagenzien.
Diese sind die Stammlösungen der Reagenzien gemäss der Erfindung, wie sie für analytische Verwendung aus den konzentrierten stabilisierten Reagenzien der vorstehend beschriebenen Art bereitet werden.
Die gepufferte Urease wird durch Auflösen von 250 mg Äthylendiamintetraessigsäure in 3500 ml Was-
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ser erhalten. Der pH-Wert der Äthylendiamintetraessigsäurelösung wird mit 54, 6 ml einer 40% igen Natriumhydroxydlösung auf 6, 5 eingestellt. Unter Rühren werden 50 g Natriumazid zugesetzt, bis das Produkt gelöst ist. Dann werden 37, 5 g Urease in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Urease wurde von der Sigma Chemical Company bezogen, von der sie als Sigma Type II bezeichnet wird, und zeigte eine Aktivität von 1000 Sumner-Einheiten je g, gemessen bei 300C. Diese Lösung wird zu der oben genannten Äthylendiamintetraessigsäurepufferlösung gegeben. Das Endvolumen der vereinigten Lösungen wird dann auf 5000 ml gebracht.
Nach der Filtration werden 4 ml der Lösung zu jedem von 1250 der 25 mi-Fläschchen gegeben. Das in den Fläschchen enthaltene Material wird der Gefriertrocknung unterworfen und die Fläschchen werden verschlossen.
Das Phenol-Nitroprussid-Farbreagens wird durch Auflösen von 37, 5 g Natriumnitroprussid in destilliertem Wasser und durch Erhöhen des Volumens auf 150 ml durch weiteren Zusatz von destilliertem Wasser hergestellt. Zu jedem von 1250 der 10 ml-Fläschchen werden 0, 1 ml dieser Nitroprussidlösung gege-
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Nach Abkühlen und Verfestigung des Phenols werden die Fläschchen verschlossen.
Das alkalische Hypochloritreagens wird hergestellt, indem 5120 ml einer 5 1/4 %igen wässerigen
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verschlossen werden.
Diagnostischer Versuch.
Zur Herstellung sämtlicher nachstehend angegebener Reagenzien wird ammoniakfreies Wasser verwendet : a) Gepufferte Urease.
1. Den oben angegebenen Fläschchen mit gepufferter Urease werden 20 ml destilliertes Wasser zu- gegeben.
2. Diese wiederhergestellte Urease ist 1 Monat lang stabil, wenn sie bei Temperaturen zwischen 2 und 100C gelagert wird. b) Phenol-Nitroprussid-Farbreagens.
1. Eines der oben beschriebenen Fläschchen wird mit Wasser 5 min stehengelassen, um das Phenol zu verflüssigen.
2. Der Inhalt des Fläschchens wird in einen 500 ml-Behälter gebracht, worauf die Fläschchen mit destilliertem Wasser ausgespült werden, um das Überführen zu vervollständigen, worauf das End- volumen von 500 ml mit destilliertem Wasser eingestellt wird.
3. Die so erhaltene Lösung ist wenigstens 1 Monat stabil, wenn sie in Glas- oder Plastikbehältern bei
Temperaturen zwischen 2 und ! OOC gelagert wird. c) Alkalisches Hypochloritreagens.
1. Die konzentrierte alkalische Hypochloritlösung aus einem der oben beschriebenen Fläschchen wird in einen 500 ml-Behälter gebracht, worauf die Fläschchen mit destilliertem Wasser gespült wer- den, um das Überführen zu vollenden ; mit destilliertem Wasser wird das Endvolumen auf 500 ml eingestellt.
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Kunststoff- (Plastik)-70, 7 mg analytisch reinem Ammoniumsulfat in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt.
Der Versuch wird mit Serum durchgeführt. Er kann auch mit Plasma oder verdünntem Harn durchgeführt werden. Eine im Verhältnis 1 : 50 verdünnte Harnlösung ist im allgemeinen ausreichend ; eine stärkere oder geringere Verdünnung kann notwendig sein, um die Konzentration in einen für die kolorimetrische Bestimmung geeigneten Bereich zu bringen.
1. Zwei 10 ml gepufferte Urease enthaltende Lösungen werden je in eine Reihe von Proberöhrchen für Blindversuch, Standardlösung und unbekannte Probe gebracht.
2. Zu den entsprechenden Röhrchen (mit Ausnahme desjenigen für den Blindversuch) gibt man 0, 02 ml des Standards und 0, 02 ml einer Serumprobe, deren Harnstoffgehalt unbekannt ist (diese Probe wird als "unbekannt" bezeichnet), wobei eine Hämoglobin-Pipette mit" Auswaschung" verwendet wird.
3. Diese Röhrchen werden 15 min in einen Brutofen gebracht und dort auf 37 C erwärmt, um den Hanrstoff in Ammoniak umzuwandeln. (Die Röhrchen können auch während dieses Verfahrensschrittes und
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des nachstehend angegebenen Verfahrensschrittes Nr. 5 30 min bei Zimmertemperatur gehalten werden.)
4. Zu jedem Röhrchen (einschliesslich desjenigen für den Blindversuch) gibt man in der folgenden Reihenfolge : a) 5 ml Phenol-Farbreagens, b) 5 ml alkalisches Hypochloritreagens, und der Inhalt jedes Röhrchens wird rasch vermischt, wobei ein inertes transparentes, im wesentlichen aus einem Vinylidenchlorid bestehendes Filmmaterial als Deckschicht auf die Röhrchen aufgebracht wird, um eine Verunreinigung zu verhindern.
5. Die Röhrchen werden erneut 15 min bei 370C zwecks Farbentwicklung in den Brutofen gebracht.
6. Unter Verwendung des Beckman-Spektrophotometers wird bei 640 mu eine rote Absorption festgestellt.
Berechnungen.
Bei Messungen mit einem Spektrophotometer ist die Absorption, unter Berücksichtigung des Wertes für den Blindversuch, der Ammoniak-Stickstoffkonzentration direkt proportional. Die aus der oben be-
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rum bestimmt.
Zur Kontrolle wurde der Harnstoff-Stickstoff-Gehalt der unbekannten Probe dieses Beispiels nach der Standardmethode mitNessler'schem Reagens, wie sie im Manual of Clinical Laboratory Methods beschrieben ist, bestimmt. Nach diesem Verfahren wurde der Harnstoff-Stickstoff-Gehalt der unbekannten Probe ebenfalls mit 15 mg/100 ml Serum ermittelt.
Diese kolorimetrische Reaktion kann zur Bestimmung von Ammoniak-Stickstoff in einer Vielzahl verschiedener Flüssigkeiten oder Lösungen benutzt werden, vorausgesetzt dass nach Zugabe des PhenolFarbreagens ein Alkalihypochloritreagens in genügenden Mengen zugesetzt wird, um eine anfängliche Azidität der Lösung zu neutralisieren und einen genügenden Überschuss an Alkali zu schaffen, um das Phenol in das Alkalimetallsalz umzuwandeln. Beispielsweise wird bei der Bestimmung von Stickstoff in einem sogenannten Kjeldahlversuch die Anwesenheit nennenswerter Mengen von Protein oder von Salzen, wie Natriumchlorid oder Sulfat, die Farbreaktion nicht nennenswert beeinflussen.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Reagens für die kolorimetrische Analyse von Ammoniak-Stickstoff, enthaltend Phenol, ein Alka-
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im wesentlichen wasserfreien Mischung von Phenol und einem Alkalinitroprussid und anderseits aus einer wässerigen, überschüssige Alkaliionen enthaltenden Alkalihypochloritlösung besteht.