DE1648977A1 - Farbreagenz zur Bestimmung von Kreatinin - Google Patents

Description

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(früher: M 74 850 IXb/42l)

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E. M e r c k _10< Januar 1970

Darmstadt

Jarbreagenz zur Bestimmung von Kreatinin

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Farbreagenz zur Bestimmung von Kreatinin.

Die exakte Bestimmung des Kreatiningehalts ist insbesondere in biologischen Flüssigkeiten ,.wie Serum, Blut oder Harn ,für die Diagnose bestimmter Krankheiten von Bedeutung· Da Kreatinin nur über die Niere ausgeschieden wird, kann beispielsweise aus einem im Serum gemessenen erhöhtenKreatiningehalt auf-eine Erkrankung der Miere geschlossen werden.

Eine Reihe von Verfahren zur KreatininbeStimmung sind bereits bekannt. In der Praxis angewandt wird vor allem die erstmals in Zeitschrift für physiologische Chemie, Band 10, Seite 391 (1886) und Band 41, Seite 223 (1904)publizierte Methode, bei der das Kreatinin durch Zusatz von Natriumpikrat in alkalischem Medium in das rote Kreatiiiinpikrat übergeführt wird. Nach diesem Verfahren wird beispielsweise ein mit Pikrinsäure enteiweißtes Serum mit Natronlauge versetzt und anschließend colorimetrisch das entstandene Kreatininpikrat bestinimt (Biochemische Zeitschrift, Band 291, Seite 354 (1937). In einer Variante dieses Verfahrens wird die Enteiweißung mit Trichloressigsäure durchgeführt und der Kreatiningehalt durch aufeinanderfolgende Zugabe von Pikrinsäure und Natronlauge zu einer Serumprobe durch Extinktionsmessung bei 530 - 550 nm bestimmt. Der Nachteil

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dieser Verfahren liegt darin, daß die Pikrinsäure und die Natronlauge in 2 getrennten Pipettierungen zugesetzt werden müssen. Diese doppelte Pipettierung beeinträchtigt die Genauigkeit der Bestimmung und erfordert außerdem bei den üblicherweise durchgeführten Reihenuntersuchungen einen erheblichen zusätzlichen Zeitaufwand. Ein weiterer Nachteil dieser bekannten Verfänren besteht darin, daß eine relativ große Menge Serum für die Kreatininbestimmung erforderlich ist. Nach einem weiteren aus Ärztliches Labor, Band 11, Seite 175 ff., insbesondere Seite 177 (1960) bekannten Verfahren wird empfohlen, den Kreatininnachweis nach Enteiweißung von Serum mit Wolframat und Schwefelsäure bei einem pH-Wert von 2,1 - 2,2 durch Pikrinsäure/Natronlauge auszuführen. Jedoch liefert auch dieses Verfahren keine befriedigenden Ergebnisse, vor allem da die Extinktionsmessung hierbei in dem Bereich von 460 - 530, insbesondere 480 - 500 nm, durchgeführt werden muß. Dieser Bereich liefert hohe Blindwerte, wodurch für die Messung keine sicheren Ergebnisse erzielbar sind. Eine Messung bei der Wellenlänge Hg 546 nm, die mit den meist zur Verfügung stehenden Filterphotometern mit Quecksilberlampe leicht zu messen ist, ist bei ■ diesem Verfahren nicht "möglich. Ein weiterer Nachteil dieses - vorbekannten Verfahrens liegt darin, daß die Enteiweißung bei einem ganz bestimmten pH-Wert durchgeführt werden muß und Abweichungen von diesem pH-Wert zu einer Verfälschung der Meßergebnisse führen.

Es wurde nun gefunden, daß die geschilderten Nachteile weitgehend vermieden werden können, wenn ein neues Farbreagenz . angewendet wird. ·

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Alkalipikrat und Alkalihydroxid enthaltendes Farbreagenz zur Kreatininbestimmung durch Messung der Lichtabsorption des gebildeten Kreatininpikrats, bei dem als Alkalipikrat Lithiumpikrat und als Alkalihydroxid Lithiumhydroxid verwendet wird.

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Gegenstand der -vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Kreatininbestimmung mit dem neuen Lithiumpikrat und Lithiumhydroxid enthaltenden Farbreagenz bzw. die Verwendung von Lithiumpikrat und Lithiumhydroxid bei der Bestimmung von Kreatinin.

Das Farbreagenz nach der Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß die Kreatininbestimmung schon kurze Zeit, z. B. 8 bis 10 Minuten nach Zusatz des neuen Reagenzes zu der zu messenden Probe vorgenommen werden kann. Außerdem ist vorteilhaft, daß nur geringe Mengen*der zu messenden Probe, z. B. 0,5.ml Serum, für die Kreatininbestimmung mit dem neuen Reagenz erforderlich sind und trotzdem die Lichtabsorption bei beliebigen Wellenlängen zwischen 500 und 550 nm, insbesondere bei der günstig gelegenen Wellenlänge von 546 nm, die mit den üblichen Filterphotometern mit Quecksilberlampe gemessen werden kann, möglich ist. Ferner ist von Vorteil, daß_die Komponenten des Farbreagenzes, Lithiumpikrat und Lithiumhydroxid, vor der Messung gemischt werden können. Das Farbreagenz kann bei Messung in Lösung in einer einzigen Pipettierung zugegeben werden, wodurch zusätzliche Meßfehler, wie sie bei 2 getrennten Pipettierungen auftreten, vermieden werden. Die einfachere Handhabung bringt insbesondere bei Serienuntersuchungen eine merkliche Arbeitsersparnis. Außerdem kann das Farbreagenz auch in trockener Form für eine Einzelmessung dosiert werden. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß bei Anwendung des neuen Reagenzes die zu bestimmende Probe, z. B. Kreatinin-haltiges Serum, nicht mit Wasser verdünnt werden muß, wie dies nach den Vorschriften der bekannten Verfahren erforderlich ist.

Die Meßgenauigkeit bei der Kreatininbestinimung mit dem neuen Farbreageriz ist ausgezeichnet. Damit ist ein neues, zuverlässiges, einfach zu handhabendes Reagenz zur Kreatininbestimmung geschaffen worden, das genau reproduzierbare Ergebnisse liefert und insbesondere für Reihenuntersuchungen geeignet ist.

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Das Farbreagenz nach der Erfindung kann als Lösung oder in . fester Form vorliegen. Die Messung der Lichtabsorption des Kreatininpikrats wird vorteilhaft in einem pH-Bereich von etwa 9 - 14, vorzugsweise bei einem pH von etwa 12 ausgeführt. Dementsprechend wird zweckmäßigerweise auch der pH-Wert der alkalischen Lithiumpikratlösung des Farbreagenzes nach der Erfindung derart eingestellt, daß nach Neutralisation des Enteiweißungsmittels genügend überschüssiges Alkali vorhanden ist, um den angegebenen günstigen pH-Bereich während der Farbreaktion zu erreichen.

Vorteilhaft wird eine Lösung des Farbreagenzes aus einer Pikrinsäurelösung und einem Überschuß einer Lithiumhydroxidlösung zubereitet. Man verwendet hierbei zweckmäßigerweise eine mindestens, etwa 0,5 $ige Pikrinsäurelösung. Bevorzugt wird eine bei Zimmertemperatur gesättigte Pikrinsäurelösung (Pikrinsäuregehalt etwa 1,2 %) verwendet. Besonders günstig ist die Anwendung einer Pikrinsäurelösung, die durch Zusatz von Lithiumhydroxid auf einen schwach sauren pH eingestellt ist. In einer solchen Lösung liegt die Pikrinsäure zum Teil als ^ü Lithiumpikrat vor. Auch beim Abkühlen, beispielsweiser auf Temperaturen von etwa O⁰C, kristallisiert die Pikrinsäure aus einer solchen Lösung nicht aus. Man kann außerdem auf diese Weise eine höher konzentrierte, z. B. 5 $ige_f stabile Pikrinsäurelösung herstellen. _._:

Die angewandte Lithiumhydroxidlösung enthält zweckmäßigerweise etwa 8 - 12 fo, vorzugsweise etwa 10 5^, Lithiumhydroxid.

Das gebrauchsfertige Farbreagenz wird bei dieser Ausführungsform durcn Mischen der Pikrinsäurelösung, die gegebenenfalls Lithiumhydroxid enthält, mit der Lithiumhydroxidlösung erhalten. Tn einer bevorzugten Ausführungsform wird etwa 1,2 ^ige Pikrinsäurelösung, die gegebenenfalls Lithiumhydroxid enthält, mit etwa 10 $iger Lithiumhydroxidlösung gemischt. Günstig ist

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hierbei ein Verhältnis Pikrinsäurelösung/Lithiumhydroxidlösung 5 : 1 bis 6 : T, insbesondere etwa 5 s 1. Wegen der relativ geringen Stabilität von Alkälipikratlösungen hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die Mischung möglichst kurz vor der Ingebrauchnahme des Reagenzes vorzunehmen. Am vorteilhaftesten · werden die Lösungen unmittelbar vor der Anwendung gemischt. Jedoch kann das fertig gemischte Reagenz gegebenenfalls auch, z. B. bis zu etwa 24 Stunden, vor der Ingebrauchnahme aufbewahrt werden. ' . *

In manchen Fällen kann die wäßrige Lösung des Reagenzes auch ein inertes organisches, mit Wasser mischbares Lösungsmittel wie Alkohol enthalten. Jedoch bringt der Zusatz eines solchen organischen Lösungsmittels im allgemeinen keine Vorteile. μ

Eine gebrauchsfertige Lösung der Komponenten des Farbreagenzes nach der Erfindung kann auch beispielsweise hergestellt werden, .indem Lithiumhydroxid in fester Form einer Lösung von Pikrinsäure zugesetzt wird.

Die gebrauchsfertige Lösung des Farbreagenzes kann zur Erhöhung der Stabilität auch in an sich bekannter Weise gefriergetrocknet werden. Eine solche feste Form des Farbreagenzes muß vor dem G-ebrauch lediglich noch in der erforderlichen Menge Wasser gelöst werden«

Das Farbreagenz nach der Erfindung kann in fester Form auch der- Jj art hergestellt werden, daß die Bestandteile des Farbreagenzes, also feste Pikrinsäure und festes Lithiumhydroxid, vorgemischt werden. Wegen.der Brisanz von Pikrinsäure bzw. Pikraten sind dabei besondere Vorsichtsmaßnahmen zu beachten. Es empfiehlt sich beispielsweise, die Pikrinsäure mit inerten Verdünnungsmitteln, wie sie üblicherweise bei explosiven Substanzen angewendet werden, zu vermischen. Als Verdünnungsmittel sind vorzugsweise wasserlösliche inerte Salze wie wasserlösliche Alkali-

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-■ Λ V .;■ ■...;.■■ fc ;■■ - ;' "'■". " ' 'I salze, ζ. β. Lithium-, Natrium- oder Kaliumhalogenide wie Lithiumchlorid, -bromid oder -jodid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder geeignete wasserlösliche Sulfate, z. B. Natriumsulfat, geeignet.

Sofern das Farbreagenz nach der Erfindung in trockener Forjn, z. B. auch als gefriergetrocknete Lösung angewandt wird, können die Komponenten so gewählt werden, daß eine abgemessene Dosis des Reagenzes gerade für eine Einzelbestimmung ausreicht. Bei jeder KreatininbeStimmung braucht dann lediglich eine Dosis des Farbreagenzes zugesetzt zu werden. ■

Das Farbreagenz nach der Erfindung eignet sich vor allem zur Bestimmung von Kreatinin in biologiscüen Flüssigkeiten, wie Serum, Blut, Plasma, Harn, Cerebrospinalflüssigkeit sowie für Nahrungs- und Futtermittelproben, wie -Fleischextrakt, die Kreatinin enthalten können. Auch die Bestimmung von synthetischem Kreatinin, das insbesondere zur Herstellung von Standardlösungen für die KreatininbeStimmung in biologischen Flüssigkeiten benötigt wird, ist mit dem neuen Farbreagenz leicht und exakt durchzuführen.

Eine auf Kreatiningehalt zu untersuchende biologische Flüssigkeit wird vor der Bestimmung in an sich bekannter ',Veise mit stark sauren Verbindungen enteiweißt. Besonders geeignet als Enteiweißungsmittel ist Trichloressigsäure oder auch Perchlorsäure. Bevorzugt wird Trichloressigsäure angewandt. Nach Einwirkung der sauren Verbindung auf die zu bestimmende Probe wird das ausgefallene Eiweiß abzentrifugiert oder anderweitig in an sich bekannter Weise abgetrennt.

Für die Kreatininbestimmung wird das Farbreagenz zu einer bestimmten Menge der zu untersuchenden, gegebenenfalls enteiweißten Probe gegeben. Nach einer Inkubationszeit von etwa 5 bis Minuten,, vorzugsweise etwa 8 bis 12 Minuten, wird die Lichtabsorption (Extinktion bzw. Transmission) des gebildeten Kreatinin-

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pikrats gemessen. Bevorzugt wird die Extinktion gemessen. Man mißt hierbei zweckmäßigerweise in einem Bereich zwischen 500 und 550 mn, beispielsweise bei 520 nm, mit einem Spektralphotometer oder bei 546 mn mit einem Filterphotometer mit Quecksilberlampe oder bei 509 nm mit einem Filterphotometer mit Cadmiumlampe..Es empfiehlt sich, die Bestimmung bei etwa 10 bis 30⁰C, vorzugsweise bei etwa 20 bis 25°C, durchzuführen.·Die gemessene Lichtabsörption ist proportional der in der Probe enthaltenen Kreatininmenge.

Mn besonderer Vorteil bei der Anwendung des neuen Farbreagenzes besteht darin, daß bei Bestimmung von Kreatinin in enteiweißten biologischen Flüssigkeiten eindeutig reproduzierbare Meßwerte erhalten werden, auch wenn unterschiedliche Mengen Säure zur Enteiweißung benutzt werden. Beispielsweise wurde schon bis zu M etwa 20 $ige Trichloressigsaurelosung für die Enteiweißung verwendet, ohne daß sich die bei der nachfolgenden Kreatininbes.timmung mit dem Farbreagenz nach der Erfindung erhaltenen Werte wesentlich voneinander unterscheiden. Auch die Bestimmung von Kreatinin in einer säurefreien wäßrigen Lösung mit dem Farbreagenz· nach der Erfindung liefert etwa dieselben Resultate wie bei der Bestimmung in einer zuvor durch Säure enteiweißten Lösung.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.

A) Beispiele für Farbreagenz

1)1 Teil einer wäßrigen 10 'Cigen Lithiumhydroxidlösung (Lösung I) wird mit 5 Teilen einer Pikrinsäure/Lithiumhydroxid-Lösung (Lösung II; hergestellt aus 100 ml wäßriger 1,2 #iger Pikrin-" säurelösung und 1 ml Lösung I) gemischt.

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2) 1 Teil einer wäßrigen 9 $igen Lithiumhydroxidlösung wird mit 5 Teilen einer wäßrigen 1,2 folgen Pikrinsäurelösung gemischt«

3) 1 Teil 12 folge wäßrige Lithiumhydroxidlösung wird mit 5 Teilen einer wäßrigen 1,2 $igen Pikrinsäurelösung gemischt,

4) Jeweils 1 Teil einer 10 $igen wäßrigen Lithiumhydroxidlösung wird mit jeweils 5 Teilen einer 0,5 bzw. 1,0 $igen wäßrigen Pikrinsäurelösung gemischt.

5) Jeweils 1 Teil einer 10 %igen wäßrigen Lithiumhydroxidlösung wird mit jeweils 5 Teilen einer wäßrigen schwach sauren bzw. 3 ^igen Pikrinsäurelösung (hergestellt durch Einstellung einer 2 bzw. 3 folgen Pikrinsäurelösung auf schwach sauren pH mit Lithiumhydroxid) gemischt.

6) 100 mg feste Pikrinsäure, 167 mg festes Lithiumhydroxid (erhalten durch Eindampfen einer klaren Lithiumhydroxidlösung) und 100 mg Lithiumchlorid werden gemischt. Vor der Ingebrauchnahme wird die Mischung in 10 ml destilliertem Wasser gelöst.

7) 20 g wasserhaltige Pikrinsäure (50 #ig>-, 16,7 g reines Lithiumhydroxid und 10 g reines Lithiumchlorid werden mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 1 1 aufgefüllt. Die so hergestellte Lösung wird in Portionen von 0,5 ml, vorzugsweise in Reagenzgläsern, gefriergetrocknet.

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B) Beispiele für Kreatininbestimmungen

1) Kreatininbe stiinmung in wäßriger Lösung

1,0 ml des Farbreagenzes nach Beispiel A 1) wird mit 1,0 ml einer wäßrigen Lösung von Kreatinin, die einen pH von etwa 0,2 - 12,0 hat, gemischt und 10 Minuten bei 20 bis 25⁰C stehengelassen. Nach einigen weiteren Minuten (vorzugsweise 8 bis 10 Minuten) wird die Extinktion des Gemisches mit einem Spektralphotometer zwischen 500 und 550, vorzugsweise bei 520 nm oder z. B. bei Hg 54-6 oder Cd 509 bei einer Küvettenschichtdicke von 0,5 bis 2 cm gemessen. Der Kreatiningehalt ergibt sich durch Vergleich mit der Extinktion einer Standardlösung, die eine bekannte Menge reines Kreatinin enthält.

2) KreatininbeStimmung im Serum

a) Enteiweißung .

0,5 ml Serum werden in an sich bekannter Weise enteiweißt durch Zugabe von 0,5 ml 10 $iger wäßriger Trichioressigsäurelösung. Die Mischung wird 10 Minuten lang zentrifugiert·

Zur Kontrolle werden 0,5 ml einer Standardlösung_s die 10 mg Kreatinin/1OO ml Lösung enthält, mit ,ebenfalls 0,5 ml 10 folgev wäßriger Trichloressigsäurelösung gemischt₀

Ferner wird eine Blindprobe aus 0,5 ml 10 $iger wäßriger Trichloressigsäurelösung und 0,5 ml Wasser hergestellt.

b) KreatininbeStimmung ' .

Jeweils 0,5 ml der enteiweißten Serumprobe bzw. der Standard- und Blindprobe werden mit jeweils 0,5 ml nach Beispiel AU hergestelltem Farbreagenz gemischt und 10 Minuten bei 20 bis 25°C stehengelassen. Innerhalb weiterer 10 Minuten werden die * Extinktionen der Serumprobe und der Standardprobe gegen die

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Blindprobe mit einem Spektralphotometer zwischen 500 und 550 m, vorzugsweise bei 520 nm oder z. B. bei Hg 546 oder Cd 509 bei einer Küvettenschichtdicke von 0,5 Ms 2 cm gemessen. Der Kreatiningehalt wird nach folgender Formel berechnet s «

E Kreatiningehalt im Serum * —^ · S mg/ίθθ ml

E^ = Extinktion der Serumprobe gegen die Blindprobe Eg = Extinktion der Standardprobe gegen die Blindprobe S « Konzentration der Kreatininstanaardlösung in mg Kreatinin pro 100 ml.

liegt die gemessene Extinktion über 1,Oj, so wird vorteilhaft die Bestimmung mit der auf das 10-fache verdünnten Probe wiederholt und der nach der obigen Formel erhaltene Wert mit 10 multipliziert.

Die vorstehend beschriebene Kreatininbestimmung wird bei 15⁰G wiederholt.

Die Bestimmung kann auch mit 1 ml Serum ausgeführt werden. In diesem Pail werden 2,0 ml TriChloressigsäure mit jeweils 1 ml Serum bzw. Standardlösung bzw. Wasser für die Blindprobe eingesetzt. Nach dem. Zentrifugieren wird 1 ml Überstand mit 1 ml IParbreagenz gemischt» .

Analoge KreatininbeStimmungen im Serum werden auch durchgeführt unter Verwendung der Farbreagenzien der Beispiele A 2) bis A T). Bei der Verwendung des lyophilisierten dosierten= trockenen Farbreagenzes nach Beispiel Ä 7) wird "bei der Ent-' ei weißung 1 ml 5 $ige !Erichloressigsäure anstelle von 0,5 ml

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10 foige TrichloressigsäurelÖsung verwendet und 1 ml - gegenüber den oben verwendeten 0,5 ml - des eiweißfreien Überstandes dem trockenen JParbreagenz für die Bestimmung zugesetzt»

3) KreatininbeStimmung im Harn

Eine KreatininbeStimmung wird analog Beispiel B 2) mit einer auf das 100-fache verdünnten enteiweißten Harnprobe ausgeführt. Der Kreatiningehalt wird nach der folgenden Formel berechnet:

Kreatiningehalt des mit Wasser auf das 100-fache des ursprünglichen Volumens verdünnten Harns

E.
» _Ji . 1000 mg/100 ml

^Es .

Ε» β Extinktion der verdünnten Harnprobe gegen die Blindprobe Eg a Extinktion der Standardlösung gegen die Blindprobe

Die Normalwerte sind in diesem Fall

1,0 - 1,5 g/24-Stunden-Harn . 100 - 200 mg/100 ml Harn

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Claims (5)

Patentansprüche

1. Alkalipikrat und Alkalihydroxid enthaltendes Farbreagenz
zur Bestimmung von Kreatinin durch Messung der Lichtabsorp—
tion des gebildeten Kreatininpikrate., dadurch gekennzeichnet, ; daß als Alkalipikrat Lithiumpikrat und als Alkalihydroxid j Lithiumhydroxid verwendet wird. " j

2. Farbreagenz nach Anspruch 1, dadiirGh gekennzeichnet, äaß : eine Mischung von wäßriger Pikrinsäurelösung und wäßriger ! Lithiumhydroxidlösung verwendet wird.

3. Farbreagenz nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, ! daß eine Mischung von bei Zimmertempsx'atur gesättigter [ wäßriger Pikrinsäurelösung und von wäßriger Lithiumhydroxid- [ lösung verwendet wird· . . ϊ

4. Farbreagenz nach Anspruch 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß | eine Mischung von schwach saurer wäßriger Pikrinsäure/ i Lithiumhydroxidlösung und von wäßriger Lithiumhydroxidlösung
verwendet wird* '

5. Farbreagenz nach Anspruch 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß .· die vorgemischte Lösung in gefriergetrockneter Form verwendet
wird.

6_β Farbreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine
Mischung von Pikrinsäure und Lithiumhydroxid in fester Form
verwendet wird»

7β Farbreagenz nach Ansprach 5 und 6_$ dadurch gekennzeichnet,
daß die für eine einzelne KreatininbeStimmung erforderlichen

Meagen Pikrinsäure xmä. Mthiumhydroxid verwendet werden.

HfcUC Unte rkgen (Art. 7 § 1 Abs. 2 Nr. 1 Satz 3 des Sndarungsges. v. 4.9,

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8» Verfahren sur B'sstiismaiig voix"-Kreatinin mit einem Alkali«» pikrat und AXiaallhj&TCzSü.' enihsXt&n&BH Far^reagena dTircii Messung der IiiditEibeorgtiou äse geteilfiet^B, Kreatininpikrats _f dadureii geke2iiizeioimet_? fiaS ale iÄ&lipikFat UltMTSBpifcrat isnd als Mkalihjäroxifi LitMisiEbydroxid entsprechend den Ansprüchen 1-7 Terwendet werden» .

TerwendiKig "FCIi !«i^MMEpikrat tasJa-.-IiitbitiiDiiydroxid aar stiisraasg Toa S^eatiaia sntsprsöaaM Äns.pra@k 8«

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