DE2123032A1 - Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von HarnsäureInfo
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Description
RECHTSANWÄLTE Λ λ
DR. JUR. DlPL-CHtM. WALTER BEIi 1Ul
ALFRED HOEPPEMER
DR. JUS. 0!PL-CfItM H.-J. WOLWP
623 FRANKFURT AM MAIN-HOCHST
Unsere Hummer 17 094
Pfizer Inc«, New York, Ii.Y.
V.St.A.
Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure,
und zwar insbesondere eine verbesserte diagnostische Methode zur Bestimmung von Harnsäure im Blut von Menschen.
Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode beruht auf einer Farbänderung
eines Kupferneocuproin-Komplexes in Gegenwart von N-Äthylmaleimid.
Die Bestimmung von Harnsäure ist zur Diagnose bestimmter
Krankheitszustände sehr wichtig. Harnsäure ist das Stoffwechsel-Endprodukt
der Purine. Purine können sich von Nukleinsäuren, Nucleotid-Cofaktoren oder den Nukleinsäuren in den Nahrungsmitteln
ableiten. Bei der Gicht ist die Harnsäuremenge erhöht und Urate werden in und um die Gelenke abgelagert, wodurch es
zu Schwellungen und Schmerzen kommt. Bei Gicht oder gichtischer Arthritis ist der Harnsäure-Spiegel im Blut erhöht. Hohe Harnsäurewerte
finden sich auch bei Nephritis, Eklampsie, Leukämie
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und anderen Krankheitszuständen, die die ausscheidende Punktion
der Nieren "beeinträchtigen.
Harnsäure läßt sich auf verschiedene Weise bestimmen,, Zwei der
gebräuchlichsten Methoden bestehen in der Umsetzung von Harnsäure mit alkalischem Phosphowolframat und dem Enzym Uriease»
Bei der erstgenannten Methode wird die Harnsäuremenge aus der Reduktion des alkalischen Phosphowolframates zu Wolfram-Blau
und Messung des gefärbten Produktes in einem Colorimeter bestimmt. Bei der zweiten Methode macht Man von der Tatsache
Gebrauch, das Harnsäure Licht bei 290 bis 293 m/U absorbiert.
Die Produkte der Uricas*-Reaktion absorbieren nicht bei dieser
Wellenlänge. Die Abnahme der Absorption ist der Menge der ursprünglich vorhandenen Harnsäure proportional.
In der TJSA-Pat ent schrift 3 282 649 ist ein Verfahren zur Bestimmung
von Harnsäure in von Eiweiß befreitem Blut beschrieben, feei welchem ein vorgeformter Kupfer-Komplex aus Cuproin, Neocuproin
oder Bathocuproin bei pH 5 bis 6 verwendet wird; es wird
die Kupfermenge gemessen, die durch die im Blut vorhandene Harnsäure bis zur Cupro-Stufe reduziert worden ist.
Die Erfindung stellt eine Weiterentwicklung dieses bekannten Standes der Technik dar.
Erfindungsgemäß wird die Harnsäurekonzentration bestimmt, indem man:
(a) eine Lösung von N-Äthylmaleimid zu einer vorbestimmten
Menge Serum gibt,
(b) dieser Lösung eine bestimmte Volumenmenge einer Heocuproinlösung
und anschließend eine bestimmte Menge einer Kupferlösung in Cupri-Zustand zusetzt und
(c) die Kupfermenge, die zum Cupro-Zustand reduziert worden ist, aus der optischen Dichte der Lösung feststellt und danach
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die Harnsäuremenge durch Vergleich der optischen Sichte mit der
einer Standardlösung hei einer Wellenlänge von etwa 450 bis 460 m /U bestimmt.
In der Praxis verwendet man zur Durchführung des diagnostischen Tests vorzugsweise folgende Mengen der genannten Substanzen:
Serum 0,2 ml
gepufferte N-Äthyl-
aaleimid-Lösung
(0,4 ί> Gew./Vol.) 1,0 ml
gepufferte Heocuproin-
löeung (0,04 # Gew./Vol.)i,0 ml
Kupfersulfat-Lö sung
(0,02 ?£ Gew./Vol.) 2,0 ml
Selbstverständlich kann man anstelle der vorstehend genannten Volumenmengen äquivalente Mengen verwenden; die genannten Mengen
sind jedoch besonders günstig, weil die entstehende Gesamtvolumenmenge für die nachfolgenden optischen Dichte-Messungen
besonders günstig ist.
Die Wellenlänge, bei der die optischen Dichte-Messungen durchgeführt
werden, liegt am günstigsten bei 455 m/u; es können aber auch andere Werte zwischen etwa 450 und 460 m/u angewandt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbesserung gegenüber den Methoden des Standes der Technik dar, weil sie direkt mit
Serum durchgeführt werden kann, so daß die Notwendigkeit der Befreiung des Blutes von Eiv/eiß und damit die Herstellung eines
protein—freien Serums entfällt. Auf diese Weise ergeben sich
eine erhebliche Zeiteinsparung und eine Vereinfachung in methodischer Hinsicht. Dieser bedeutende Umstand ergibt sich aus der
Verwendung des H-Äthylmaleimids, welches die Empfindlichkeit
des Kupfer—Heocuproin-Reduktionskomplexes erhöht und die
Reaktion i» Hinblick auf Harnsäure stärker spezifisch macht.
Auf diese Weise ist es möglich, den Test mit Serum durchzuführen.
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Zum Gegenstand der Erfindung gehört auch eine Testpackung zur Bestimmung von Harnsäure im Blut von Menschen, welche
N-Äthylmaleimid (gepuffert) Neöcuproin-Lösungen (gepuffert) Kupfersalz ('Lösung)
Härnsäure-Vorratslösüng
Härnsäure-Vorratslösüng
enthält. Eine Packung, die für etwa 100 Versuche verwendet werden kann, enthält Folgendes:
200 ml Reagenz A: gepuffertes N-Äthylmaleimid 200 ml Reagenz B: gepufferte Neocuproin-Lösung
400 ml Reagenz G: Kupfersulfat-Lösung 10 ml Reagenz D: Harnsäure-Vorratslösung.
In der hier beschriebenen diagnostischen Methode wird die Harnsäuremenge im menschlichen Serum bestimmt, und zwar wird
die Menge mit Hilfe der Änderung der optischen Dichte eines Kupfer-Neocuproin-Komplexes in Gegenwart von N-Äthylmaleimid
gemessen.
Diese neue Methode stellt deshalb einen Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik dar, weil sie direkt mit Serum durchgeführt
werden kann, wogegen - wie bereits gesagt - die bisher bekannten Verfahren die Verwendung von protein-freien Filtraten
voraussetzten. Die erfindungsgemäße neue Methode wird mit N-Äthylmaleimid durchgeführt, welches
(a) die Empfindlichkeit des Kupfer-Neoeuproin-Reduktionkomplexes
erhöht,
(b) die Linearität der Reaktion vergrößert und
(c) die Genauigkeit von Anschlußversuchen erhöht, wenn
zwei Seren mit abweichenden Werten vermischt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Serum nacheinander
mit N-Athylmaleimid, Neocuproin und schließlich mit einer getrennten
Cupri-Lösung behandelt.
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Experimentell läßt sich der diagnostische Test beispielsweise wie folgt durchführen: eine Blutserummenge von etwa 0,1 bis
etwa 0j8 ml, vorzugsweise 0,2 ml, wird mit etwa 0,5 bis 4,0 ml,
vorzugsweise 1,0 ml einer gepufferten N-Athylmaleimid-Lösung mit einer Konzentration von etwa 0,4 % Gew./Vol. vermischt. Der
pH-Wert der gepufferten Lösung soll bei etwa 7,0 bis 8,0, vorzugsweise 7,5 liegen.
Zu dieser Lösung gibt man dann etwa 0,5 bis etwa 4,0 ml, vorzugsweise
1,0 ml einer gepufferten Neocuproin-Lösung mit einer Konzentration von etwa.0,04 i° (Gew./Vol.). Diese Mischung läßt
man dann bei Umgebungstemperatur etwa 15 bis etwa 30 Min., vor- M
zugsweise etwa 20 Min. reifen. Schließlich setzt man Kupfersulfat-Lösung mit einer Konzentration von etwa 0,02 fi Gew./Vol.
zu. Die übliche Menge liegt zwischen etwa 0,5 und etwa 4,0 ml; vorzugsweise soll die Menge 2,0 ml betragen. Diese Mischung
läßt man dann weitere etwa 10 bis etwa 20 Min., vorzugsweise 15 Min. stehen. Die optische Dichte wird anschließend bei einer
Wellenlänge von etwa 450 bis 460 m/U, vorzugsweise 455 m/U bestimmt. Die Harnsäuremenge, die in der Lösung vorhanden ist,
wird mit Hilfe einer Standard-Kurve bestimmt, die mit Hilfe von Messungen an Proben mit bekannten Harnsäure-Konzentrationen aufgestellt
worden ist.
Herstellung der Reagenzien
(A) gepufferte N-Athylmaleimid-Lösung
In einen 2-1-Kolben wurden 8,0 g N-Äthylmaleimid, 1,03 g
Natriumdihydrogenphosphat und 3,19 g Dinatriumhydrogenphosphat gegeben. Danach wird destilliertes Wasser (800 ml) aufgefüllt
und die Mischung wird gerührt, bis alle festen Substanzen in Lösung gegangen sind. Die Lösung wird dann durch Zugabe von
1n NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Schließlich wird so viel destilliertes Wasser zugegeben, daß sich eine Menge von
2 1 Lösung ergibt.
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(B) gepufferte Neocuproin-lösung
Neoeuproin-Hemihydrat (0,720 g) gi"bt man au 200 ml destilliertem
Wasser. Eine gewisse Menge feste Substanz bleibt ungelöst.
Danach setzt man 5n HGl zu, so daß der pH-Wert sich auf 2,0
einstellt. An diesem Punkt sind alle festen Bestandteile in lösung gegangen. Dann setzt man soviel 5n NaOH zu, daß der pH-Wert
der Lösung auf 5,0 gebracht wird.
15 g Glycin werden zu 200 ml destilliertem Wasser gegeben und so lange gemischt, bis vollständige Lösung eingetreten ist.
Danach wird der pH-Wert durch Zugabe einer ausreichenden Menge 5n NaOH auf 9,0 eingestellt.
In einem 2-1-Kolben, der 600 ml destilliertes Wasser enthält,
werden die vorstehend beschriebenen Neoeuproin- und Glycin-Lösungen
vereinigt. Der pH-Wert der vereinigten Lösungen wird durch Zugabe von 5n NaOH auf 9,0 eingestellt. Schließlich setzt
man so viel destilliertes Wasser zu, daß sich eine Menge von 2 1 Lösung ergibt.
(C) Kupfersulfat-Lösung
Zu 60 ml destilliertem Wasser in einem 2-1-Kolben gibt man 15,2 ml 2-Amino-2-methylpropanol. Der pH-Wert der Lösung wird
dann durch Zugabe von 5n HGl oder 5n NaOH auf 9,0 eingestellt.
0,39 g wasserfreies Kupfersulfat werden in 10 ml destilliertem
Wasser gelöst. Die Kupfersulfatlösung setzt man dann der Lösung des 2-Amino-2-methylpropanols zu. Der pH-Wert wird durch Zugabe
von 5n NaOH auf 9,0 eingestellt. Mit einer ausreichenden Menge
destilliertem Wasser wird auf 2 1 aufgefüllt.
(D) Harnsäure-Vorrätslösung
In 150 ml destilliertem Wasser in einem 1-1—Kolben löst man
0,6 g Lithiumcarbonat und 1,0 g Harnsäure. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 1n NaOH auf 12,0 eingestellt, um die Harnsäure
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zu lösen. 40#iges Formalin (20 ml) und 330 ml destilliertes
Wasser werden anschließend zugegeben. Mit Hilfe von 1n H2SO.
wird der pH-Wert wieder auf 2,9 eingestellt. Mit einer ausreichenden Menge destilliertem Wasser wird dann auf 11 lösung
aufgefüllt.
1. 1,0 ml Reagenz A werden in je ein Reagenzglas mit Abmessungen
von 9 5 x 15 mm pipetfciert und als "Versuch" und "Blindversuch11
bezeichnet.
2. Das zu prüfende Serum wird in einer Menge von 0,2 ml in das "Versuchs"-Reagenzglas gegeben, während in das "Blindversuchs"-Reagenzglas
2,0 ml destilliertes Wasser gegeben werden.
3. In jedes Reagenzglas werden 1,0 ml Reagenz B gegeben.
4. Beide Reagenzgläser bleiben dann etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur
stehen.
5. In jedes Reagenzglas werden 2,0 ml Reagenz C gegeben, worauf
man weitere 15 Minuten Wartezeit verstreichen läßt.
6. Die spektropjio tome tri sehen Ablesungen werden dann so durchgeführt,
daß man bei 455 m/u mit Hilfe der "Blindversuchs-" Probe den Nullpunkt des Spektrophotometers einstellt und
anschließend die Absorption der "Versuchs"-Probe bestimmt.
Serum-Blindproben wurden hergestellt, indem man 4,0 ml destilliertes
Wasser in je eins von 3 Reagenzgläsern mit Abmessungen von 95 χ 15 mm gab. In jedes Reagenzglas gab man dann 2,0 ml
Serum. Die spektrophotometrische Bestimmung wurde dann durchgeführt, indem man destilliertes Wasser zur Einstellung des Nullpunktes
benutzte und dann anschließend die Absorption jeder
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- β - 212303?
Serum-Blindprobe bestimmte. Die Ergebnisse wurden dann ge-,
mittelt, worauf folgende Berechnung der optischen Dichte (OD) durchgeführt wurde:
OD-Versuch ./. OD-Blindversuch = OD-Harnsäure.
Die Harnsäurekonzentration wird dann aus einer Standard-Kurve abgelesen, die so erhalten worden war, daß man das Reagenz D
in unterschiedlichen Verdünnungen wie beschrieben behandelte und die dabei erhaltenen Werte der optischen Dichte gegen die
Harnsäure-Konzentration auftrug.
Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurden folgende Mengen an Serum und Reagenzien verwendet:
II,
| Probe | A | 0 | ,4 ml |
| Reagenz | B | 2 | ml |
| Reagenz | C | 2 | ml |
| Reagenz | 4 | ml | |
| Probe | A | 0 | ,8 ml |
| Reagenz | B | 4 | ml |
| Reagenz | G | 4 | ml |
| Reagenz | 8 | ml | |
Es wurden entsprechende Ergebnisse erzielt,
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Claims (4)
- 3 21230.??.PatentansprücheVerfahren zur Bestimmung der Harnsäure-Konzentration in menschlichem Blutserum dadurch gekennzeichnet, daß man(a) wässrige N-Äthylmaleimid-Lösung zu einer abgemessenen Menge des Serums gibt,(b) dem so behandelten Serum zunächst wässrige Neocuproinlösung und danach eine wässrige Lösung eines Cuprisalzes zusetzt und(c) die optische Dichte der gewonnenen Lösung im Vergleich zu der einer Standard-Lösung feststellt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Dichte bei einer Wellenlänge zwischen etwa 450 und 460 m/U gemessen wird.
- 3. Versuchspackung zur Bestimmung der Harnsäure in menschlichem Blut, bestehend aus N-Äthylmaleimid (gepuffert), Neocuproin-Lösung (gepuffert), Kupfersalz (Lösung), Harnsäure-Vorratslösung.
- 4. Versuchspackung zur Bestimmung von Harnsäure in menschlichem Blut, bestehend aus 200 ml Reagenz A = gepuffertes N-Äthylmaleimid, 200 ml Reagenz B = gepufferte Neocuproin-LÖsung, 400 ml Reagenz G = Kupfersulfat-Lösung, 10 ml Reagenz D = Harnsäure-Vorratslösung.Für Pfizer Inc., New York, N.Y., V.St.A./trRechtsanwalt109849/1671
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3890770A | 1970-05-19 | 1970-05-19 |
Publications (1)
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